摘要:
三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)在我国南方为民间常用药，其全株可入药，特别是块根，具有清热解毒、消炎、抗病毒、活血化瘀等功效，主要用于发烧、小儿高热惊厥、肺炎等的治疗。最近，人们发现三叶青在抗肿瘤、抗病毒以及调节免疫力等方面具有显著的疗效。这些研究说明三叶青具有很高的药用研究价值，本文从三叶青的生物学特性、化学成分、药理作用、临床应用及生物工程等研究领域阐述相关的研究进展，以期为三叶青的进一步研究提供较为全面的信息。
Abstract: Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg (Vitaceae) is a folk and rare medicinal plant, and specifically, it is distributed in the south, China. As a popular folk medicine, the entire herb, especially, its root has some medical properties, such as anti-inflammatory, anti-virus, detoxification and antipyretic. It is mainly used for the treatment of fevers, children convulsions, pneumonia, etc. Astoundingly, it has been reported recently that T. hemsleyanum has significantly curative effects in terms of anti-tumor, anti-virus, immune regulation. In this paper, we reviewed biological characteristics, chemical components, pharmacologic actions, clinical applications and bioengineering of T. hemsleyanum, and the aim is to gather all the possible references to help scientists in future study.
1. 引言
三叶青(Radix Tetrastigmae)为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Dielset Gilg)，其块根或全草可入药，为我国特有珍稀植物 [1] 。又名有角乌蔹莓、蛇附子、石抱子、土经丸、金线吊葫芦、三叶对、小扁藤、三叶扁藤、拦山虎、雷胆子、破石珠等[2] [3] ，广泛分布于长江以南各省份，主要有浙江、江西、江苏、福建、湖南、湖北、广东、广西、贵州、重庆、四川、西藏、云南、海南和台湾等地区。生长微环境主要是山坡、林下的灌丛中或山谷溪边林下的岩石缝中，海拔高度一般为300~1300米 [4] 。
三叶青是民间常用药，块根或全草可以入药，可用于治疗高热惊厥、肺炎、哮喘、肝炎、肾炎、风湿痹痛、跌打损伤、痈疔疮疖、湿疹、蛇伤等 [2] 。《本草纲目》记载“三叶崖爬藤，性味苦、辛、凉，清热解毒、活血祛风”；《植物名实图考》记载“蛇附子可治小儿高热、止腹痛、取浆冲服”；《浙江民间常用草药》记载“治小儿风热，惊风和疝气痛；治蛇咬”；《江西草药》记载“治小儿高热惊厥，肺炎，肝炎，外伤出血”等等。近年来在现代药理学、化学成分等方面取得了一些进展，本文对三叶青的化学成分、药理作用、临床应用及生物工程等研究现状进行较为系统的阐述，为研究者提供借鉴。
2. 三叶青的生物学特征
三叶青为草质藤本，小枝纤细，有纵棱纹，无毛或被疏柔毛。卷须不分枝，与叶对生。叶为掌状3小叶，披针形，长3~10 cm，边缘有4~6个锯齿。花序腋生，长1~5 cm，二级分枝通常为4，集生成伞形，花二歧状着生在分枝末端；花序梗长1.2~2.5 cm，被短柔毛；花蕾卵圆形，高1.5~2 mm，顶端圆形；花萼蝶形，萼齿细小，卵状三角形；花瓣4，卵圆形，顶端有小角；雄蕊4，花药黄色；花盘明显，4浅裂；子房陷在花盘中呈短圆锥状，花柱短，柱头4裂。果实近球形或到卵球形，直径约0.6 cm，种子1颗；种子倒卵椭圆形，顶端微凹，基部圆钝，表面光滑，种鳍在种子背面中部向上呈椭圆形，腹面两侧洼穴呈沟状，从下部1、4处向上斜展直达种子顶端 [4] 。三叶青盛花期在5月上、中旬，历时7~10天，开花期一直持续到6月下旬。其结果期与花期重叠，花谢后即形成小米大小的绿色圆形小果，成熟时果实由绿色变为红色，浆果球形，软球状。地下块根呈纺锤形、卵圆形、葫芦形或椭圆形，一般长1~7 cm，直径0.3~4.2 cm，表面褐色、棕色，质硬而脆，断面平坦而粗糙，类白色、粉色，可见棕色形成层环，气辛、味甘 [5] 。
3. 三叶青的化学成分
三叶青中含有酚类、氨基酸类、糖类、黄酮类、萜类、强心苷类、甾体类、油脂类等成分 [6] 。
3.1. 块根中的化学成分
3.1.1. 石油醚提取物
胡轶娟等 [7] 从三叶青块根的石油醚提取物中检出25个组分，鉴定出16个化合物，按含量依次降低分别为9，12-十八碳二烯酸、十六酸、油酸、棕榈酸、α-亚麻酸、9,12,15-十九碳三烯酸、2羰基-D葡萄糖酸、二十酸、9,12,15-二十碳三烯酸、D-果糖、木酮糖、十七酸、D-葡萄糖、肉豆蔻酸、2-羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸；郭晓江 [8] 分离得到水杨酸。
3.1.2. 乙醚提取物
霍昕等 [9] 从三叶青块根的乙醚提取物中，共分离出21个组分，鉴定出18个化学成分，其中相对百分含量高于1%的分别确定为亚油酸35.28%、棕榈酸26.93%、油酸15.56%、二苯胺7.40%、亚麻酸甲酯7.15%、硬脂酸2.41%，其余的分别鉴定为樟脑2,3-丁二醇、己酸、苯甲酸、苯乙醇、苯酚、6,10,14-三甲基-2-十五烷酮、异丙苯、豆蔻酸、十五酸、补骨脂素、十七酸。陈丽芸 [10] 从三叶青的乙醚提取物中分离得到10个单体化合物，β-谷甾醇、棕榈酸、原儿茶酸、白藜芦醇、山奈酚、槲皮素、对羟基苯甲酸、水杨酸、4-羟基肉桂酸、异槲皮苷，并对其进行抗肿瘤活性筛选，得到2个具有明显抗肿瘤活性的化合物，即白藜芦醇和山奈酚。
3.1.3. 氯仿提取物
杨大坚等 [3] 从三叶青块根的氯仿提取物中分离得到3个化合物：6'-O-苯甲酰基胡萝卜苷、胡萝卜苷、β-谷甾醇。
3.1.4. 乙酸乙酯提取物
李瑛琦等 [11] 从三叶青块根的乙酸乙酯提取物中分离到了β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素、山奈酚-3-O-新橙皮糖苷；郭晓江 [8] 分离得到香橙素、山奈酚-3-O-β-D葡萄糖苷、烟花苷、根皮苷、云杉新苷、1'-O-苄基-芸香糖苷；曾婷 [12] 分离得到儿茶素、鼠李柠檬素、山奈酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖、白藜芦醇、astringin、大黄素、大黄素-8-O-β-D吡喃葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D吡喃葡萄糖苷。
3.1.5. 正丁醇提取物
郭晓江 [8] 从三叶青块根的正丁醇萃取物中分离得到槲皮素苷、刺槐素。
3.2. 地上部分的化学成分
刘东等 [13] 从三叶青地上部分的石油醚萃取物中分离得到蒲公英萜酮、蒲公英萜醇、β-谷甾醇、麦角甾醇、α-香树脂醇、三十二酸；从氯仿萃取物中分离得到水杨酸、丁二酸；从乙酸乙酯萃取物中分离得到胡萝卜甙、芹菜素-6-α-L-吡喃鼠李糖(1-4)-α-L-吡喃阿拉伯糖甙、芹菜素-8-α-L-吡喃鼠李糖(1-4)-α-L-吡喃阿拉伯糖甙、山奈酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、没食子酸乙酯；从正丁醇萃取物中分离得到甘露醇、芹菜素-6,8-二-β-D-吡喃葡萄糖甙、环四谷氨肽。孙永等 [14] 从三叶青叶片的甲醇提取物中分离得到了13种物质：绿原酸、新绿原酸、咖啡酰奎宁酸、5-p-coumaroylquinic acid、异荭草素-2″-O-鼠李糖苷、异荭草素、荭草素-2″-O-鼠李糖苷、荭草素、1-p-coumaroylquinic acid、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷、异牡荆素-2″-O-鼠李糖苷、牡荆素、异牡荆素。
4. 药理作用
4.1. 抗肿瘤作用
丁丽等 [15] 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法，研究发现三叶青乙醇提取物和其4个提取部位对肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用，其中三氯甲烷部位和石油醚部位在一定浓度下可有效抑制人宫颈癌细胞Hela 229、人胃腺癌细胞AGS、人恶性黑色素瘤细胞A375和人膀胱癌细胞5637的活性,并且其抑制作用表现出浓度依赖性；冯正权等 [16] 研究发现三叶青黄酮能显著地抑制SGC-7901人胃癌细胞的生长，并且具有浓度依赖性，且细胞有明显的凋亡特征性改变，并能降低细胞上清液中MMP-2的含量；张立明等 [17] 研究发现三叶青黄酮还能显著抑制SMMC-7721肝癌细胞的生长，具有浓度依赖性；王明仪和魏克民等 [18] 研究发现三叶青乙酸乙酯提取物具有抑制HepG-2皮下移植瘤的作用，作用机制可能与提高IFN-γ和TNF-α平有关；李华美和魏克民 [19] 研究发现中药三叶青乙酸乙酯提取物能抑制小鼠Lewis肺癌细胞的生长，可能与促进肿瘤细胞坏死及下调Bcl-2、上调Bax和caspase-3从而促进肿瘤细胞凋亡有关；刘跃银，夏红 [20] 研究发现三叶青乙酸乙酯提取物具有诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡作用，其作用机制与激活线粒体途径有关；陈丽芸 [10] (2014)以系统溶剂萃取法对三叶青乙醇提取物进行依次萃取，并采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法，以MB-435S细胞为受试对象，筛除了两个活性部位，乙醚部位和水部位，其IC50分别为99.7 μg/mL和127.8 μg/mL。
4.2. 抗病毒作用
杨学楼等 [21] 通过三叶青提取物含氮碱A和含酮物F，粗全浸提取物S1和S2在小白鼠体内和鸡胚成纤维细胞上的实验证实，以上4种药物均显示出不同程度的抗病毒作用。其中A和F对流感病毒PR3株及仙台病毒(小白鼠肺适应株)有较强的抗病毒效果；杨雄志等 [22] 研究发现三叶青乙酸乙酯提取物对乙肝病毒具有较强活性，能明显降低HBV的DNA复制水平。
4.3. 抗炎、镇痛、解热作用
资古明等 [23] 研究发现给小鼠腹腔注射三叶青块根提取物，在热板法和苯醌法致痛模型上均有明显的镇痛效果，以及对二甲苯引起小鼠耳肿胀有明显抑制作用；黄真等 [24] 研究发现三叶青提取物能明显抑制小鼠腹腔毛细血管炎性渗出，抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀及10%蛋清致大鼠足趾肿胀，减少醋酸致小鼠扭体次数，提高热板法小鼠痛阈值，降低干酵母和2,4-二硝基苯酚致大鼠发热模型的体温，从而证实了三叶青具有较好的抗炎、镇痛及解热作用。
4.4. 保肝作用
钟晓明等 [25] 采用CCL4致小鼠急性肝损伤药理模型，研究发现三叶青提取物能够明显降低CCL4致小鼠肝损伤后ALT、AST增高，减轻肝细胞变性、炎症浸润及坏死等病变，降低肝中脂质过氧化物MDA生成量，表明三叶青提取物对CCL4所致肝损伤具有一定的保护作用；张同远等 [26] 采用CCL4反复多次给药，造成大鼠慢性肝损伤，检测造模动物血清ALT、AST、HA (透明质酸)、LN (粘连蛋白)、T-Bili (总胆红素)、TP (总蛋白)、ALB (白蛋白)水平及A/G (白蛋白/球蛋白比率)。结果显示三叶青可降低造模大鼠血清ALT、AST、HA、LN、T-Bili水平，抑制造模动物血清TP、ALB水平及A/G的下降和提高大鼠存活率，表明三叶青具有良好的保肝降酶和抗肝纤维化作用；马丹丹等 [27] 通过对三叶青多糖抗四氯化碳致急性肝损伤的研究，发现三叶青中多糖的含量为8.69%，与模型组比较，三叶青多糖治疗组ALT、AST及MDA含量均明显降低(P < 0.01)，而SOD水平显著提高(P < 0.01)，表明三叶青多糖对CCl4造成的小鼠急性肝损伤具有阻抗作用。
4.5. 调节免疫作用
钟晓明等 [28] 研究发现三叶青提取物能拮抗烫伤致大鼠血清IgA含量降低、回肠粘液中S-IgA含量降低及肠粘膜中MDA含量升高作用，能拮抗烫伤致大鼠脾脏淋巴细胞增殖能力下降、NK细胞活性降低及烫伤引起的血清IL-6水平增加作用，提示三叶青提取物对烫伤引起的肠道局部和全身免疫紊乱有纠正作用。丁刚强等 [29] 研究发现三叶青使小鼠体内TNF-以、IFN-以含量增高，能提高小鼠的细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞吞噬功能。
4.6. 急性毒性
江月仙等 [30] 将三叶青按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中“食品安全性毒理学评价试验”进行实验，发现第一阶段大鼠经口急性毒性半数致死量(LD50)雌雄两性别均大于100.0 g/kg体重，小鼠经口急性毒性半数致死量(LD50)，雌雄两性别均大于40.0 g/kg体质量，按急性毒性分级标准判定，属实际无毒，第二阶段Ames试验结果为阴性，小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验结果均为阴性，说明三叶青未显示出致突变性。
上述药理研究成果说明：1) 三叶青具有非常出色的药用价值；2) 至今还未发现三叶青的临床毒性。
5. 临床应用
朱祖禄 [31] 曾报道三叶青为当地民间常备用医治小儿发烧、咳嗽和各种炎症，有效，也有人用作毒蛇咬伤后内服和外敷药以及用作刀口创伤，有防腐消炎功效，此外，根据28例麻疹并发肺炎的患儿服用三叶青的临床观察，它对肺炎、结合膜炎、咽峡炎等疗效甚佳；刘为熙 [32] 曾报道以浙江省遂昌县中医药的老中医林宝福的经验方“三叶青饮”治疗小儿外感高热80例，取得满意疗效，其中痊愈41例(51.25%)，显效23例(28.75%)，有效11例(13.75%)，无效5例(6.25%)，总有效率93.75%；徐有水 [33] 曾报道以三叶青、生石膏为主药的三叶青石膏汤治疗小儿外感发热72例，效果满意。
单敬文 [34] 曾报道为热毒内攻的乳腺癌患者治疗时，配方中加入了三叶青20 g，患者连续服药3个月后，诸症均有改善；石镇东 [35] 曾报道治疗乳腺癌患者的脾胃虚弱证和气阴亏虚证时，使用了三叶青来消肿散结、解毒抗癌；魏克民等 [36] 研制了以三叶青为主配以黄芪、人参皂苷制成的制剂金芪片，并应用于临床，120例恶性肿瘤病人服用90天，完全缓解52例，部分缓解42例，稳定18例，进展8例，总有效率78.33%，表明三叶青及其制剂金芪片对恶性肿瘤病人有较好的效果。
郜红利 [37] 曾报道三叶青能治疗妇科疾病如血崩、白带等；
6. 三叶青的栽培、加工工艺和生物工程研究
在三叶青的栽培技术方面，Dai等 [38] 将三叶青在强、中、弱光照条件下培养一个月后，通过观察叶片形态、净光合速率及叶绿素荧光反应，发现遮光率低于50%会降低三叶青光合活性而高于75%则限制碳同化作用，都会抑制植物生长，对于三叶青培养，约67%的遮光率才是最适合的光照条件；牟豪杰和董爱兰 [39] 提供了一套三叶青人工栽培的实施步骤，从选择种植地、种植时间、繁殖材料类型，到施肥、追肥、使用遮荫棚，到最后的采收等都进行了优化选择；吉庆勇 [40] 根据生根剂用量、插穗年龄和基质对插穗生根的影响进行了研究，发现2~3年生老枝用l000 mg/L IBA溶液浸渍10 s后扦插于黄土中生根效果最佳；吉庆勇 [41] 发明了一种高效仿野生栽培技术方法，与人工栽培不同的是，增加了滴灌设备、微生物菌肥，并引导三叶青上架进行立体种植。
傅婷婷 [42] 对三叶青总黄酮提取及纯化工艺进行研究，利用紫外/可见分光光度法建立了总黄酮含量测定方法，利用大孔吸附树脂法优化了其纯化条件。严余明 [43] 通过三种不同工艺制得的三叶青药剂(冻干粉、水煎剂、饮片粉)灌喂人肺癌A549移植瘤裸鼠，测定其肿瘤生长动态体积和抑瘤率，发现三叶青冻干粉和饮片粉抗人肺癌A549裸鼠移植瘤的作用强于水煎剂，而冻干粉发挥抑瘤效果的时间要早于饮片粉。显而易见，三叶青的栽培和加工工艺的研究比较滞后，需要进一步加大投入研究力度，提高三叶青的种植和加工工艺水平。
目前，三叶青生物工程主要涉及组织培养和毛状根诱导，见表1。钱丽华 [44] 以三叶青腋芽为材料，进行了腋芽外植体诱导技术、不定芽继代增殖技术及试管苗生根技术研究，实现了其离体快速繁殖，并发现23 μmol∙m−2∙s−1的光照强度有利于腋芽的萌发；钟毓倩 [45] 用三叶青的茎尖、带腋芽的茎段和叶片为外植体，研究发现最佳诱导外植体为茎尖；Jiang W.M.等 [46] 用三叶青的带腋芽的茎段为外植体，通过对外植体的选取与处理、诱导培养、增殖培养、生根培养、移栽等步骤建立了一套组培快繁体系；卢爱芳等 [47] 以三叶青叶片、茎段和无菌苗叶片为外植体，诱导形成愈伤组织，并对其中两种愈伤组织、叶片、块根中的总黄酮含量进行测定，发现总黄酮在愈伤组织中含量较高；彭昕[48] 等用三叶青的幼嫩带芽茎段为外植体，通过正交试验对其腋芽增殖、生根培养条件进行优化，得出最适培养基。
杜苏瑞[49] 利用黄瓜碱型发根农杆菌K599 (带内源质粒pRi2659和外源质粒pRI101-AN-GFP)侵染三叶青外植体，成功诱导繁殖了转基因毛状根。其中，在诱导毛状根的培养基中，以MS + 0.4 mg/L NAA最佳，毛状根诱导率高达93.7%；而在继代增殖培养过程中，B5培养基比MS培养基更适合三叶青毛状根的生长，以B5 + 1.0 mg/L KT + 1.0 mg/L IBA为最佳，毛状根的成活率可达90%。在毛状根的悬浮培养中，0~15 d为平缓生长期，15~28 d为快速生长期，随后28~35 d又进入平缓生长期，而35 d后毛状根的增长接近停滞。
7. 展望
三叶青作为我国南方传统药用植物，在治疗小儿高热惊厥、肺炎等方面有显著疗效，且近年来的研究发现其在抗肿瘤、抗病毒及免疫调节方面具有很好的疗效。因此，三叶青具有重要的药用研究价值。
表1. 三叶青培养基配方
然而，三叶青的研究主要集中在化学成分提取与鉴定、药理学作用、组织培养等方面，但具体的有效成分及其合成调控机理、抗肿瘤作用机制等的研究还比较少，严重妨碍了三叶青的应用。另一方面，由于三叶青野生资源的过度利用与破坏，加快其种质资源保护、生物工程和育种等的研究也迫在眉睫。以期本文能为三叶青的深入研究提供比较全面的文献信息。
基金项目
陕西省重点攻关项目2012KTCL02-07和浙江理工大学科研启动费14042008-Y。