间充质干细胞工程化修饰策略在基于干细胞治疗中的研究进展

Research Progress of Mesenchymal Stem Cell Engineering Modification Strategies in Stem Cell-Based Therapy

摘要: 间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)因其多向分化、自我更新、免疫调控等功能，可治疗多种疾病。尽管MSCs疗法在一定程度上已被证明是安全有效的，但在临床应用中，其疗效和安全性仍存在局限性，主要体现在MSCs靶向性不足、分化能力受限、体内存活率低及药物递送效率不足等方面。为解决这些问题，目前出现多种工程化修饰技术，包括基因工程、表面修饰、物理化学修饰和组织工程等，以提高MSCs疗法的治疗效果和安全性。本文详细介绍了不同工程化修饰策略，并重点阐述各工程化修饰下MSCs功能化的实现和临床应用前景。

Abstract: Mesenchymal stem cells (MSCs) hold significant promise for the treatment of a wide range of diseases, owing to their multi-lineage differentiation potential, self-renewal capabilities, and immune regulatory properties. Although MSCs-based therapies have demonstrated safety and efficacy to some extent, their clinical application remains limited. These limitations are primarily due to challenges such as insufficient targeting of MSCs, restricted differentiation capacity, low in vivo survival rates, and poor drug delivery efficiency. To address these issues, a variety of engineering strategies, including genetic modification, surface functionalization, physicochemical modification, and tissue engineering, have been developed to enhance the therapeutic efficacy and safety of MSCs therapies. This paper provides a comprehensive overview of these engineering approaches and discusses their potential for future clinical application in MSCs-based therapies.

1. 背景

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一种成体多能祖细胞，可以分化为骨、软骨和脂肪等多种间充质组织。MSCs具有多样表型，且其生物标志物的表达受到来源和分离方法的影响，因此不能简单将其视为是一组同质细胞[1]。为促进对MSCs的统一定义，国际细胞治疗学会设定了人类MSCs的最低标准，这些标准包括：1) 在标准培养条件下可保持可塑性粘连；2) 表达CD105、CD73和CD90，不表达造血标志物表面分子CD45、CD34、CD14；3) 可在体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞[2]。除上述基本标准，MSCs还具有如下特性：1) 可在体外扩增而不丧失其免疫调节和分化潜力[3]；2) 低免疫原性，适用于同种异体移植[4]；具有向不同细胞分化的能力，可治疗多种疾病[5]。此外，MSCs通过自分泌和旁分泌途径，分泌细胞因子以调控微环境，促进血管生成、减少炎症，并有助于促进组织修复[6]。MSCs还具有良好的体外扩增潜力和多系分化潜能，可向新生血管、肿瘤和炎症部位趋化[3]。这些特性使MSCs成为基于细胞治疗的理想选择，广泛应用于治疗各种疾病，如风湿性疾病[6]、自身免疫性疾病[7]、肝脏疾病[8]和心血管疾病等[9]。

本综述将全面回顾基于MSCs的工程化修饰策略，包括基因工程、表面修饰、物理化学修饰和组织工程。通过对这些策略的回顾，本综述旨在评估如何通过工程化修饰手段提升MSCs的功能化，进一步扩展其临床应用。

2. MSCs工程修饰策略

2.1. 基因工程修饰MSCs策略

基因工程对MSCs进行修饰通常有两个主要目的：1) 通过引入特定的关键转录因子，将不同类型的成体细胞重编程为诱导性多能干细胞(iPSC)，从而获得更广泛的分化能力[10] [11]。2) 上调或下调特定基因的表达，以改善MSCs在特定疾病中的治疗效果。基因工程修饰包括基于病毒、非病毒和基因编辑的修饰方法，通过这些技术赋予MSCs新的功能，增强其临床应用潜力。

2.1.1. 基于病毒的基因工程修饰

MSCs很容易受到病毒修饰[12]，根据病毒载体是否整合到宿主基因组中，可将其分为整合病毒载体和非整合病毒载体。

整合病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒等，用于哺乳动物的转导以实现长期转基因表达。逆转录病毒最早被应用于造血干细胞基因治疗，并成功治愈了X连锁严重联合免疫缺陷[13]和腺苷脱氨酶缺乏症[14]。由于其能够将外源基因稳定整合入宿主基因组，逆转录病毒在长期转基因表达中具有重要应用价值。学者通过逆转录病毒转染牙周组织来源的MSCs (DPSCs)以获得过表达SFPR2的MSCs，可增强DPSCs介导的牙本质形成和颌骨牙本质再生[15]。慢病毒可有效地对增殖和非增殖细胞进行基因整合，已被广泛应用于基因工程[16]。利用慢病毒过表达Periostin蛋白，学者成功修饰了MSCs，使其细胞粘附能力增强，并显著改善梗死心肌的心功能[17]。腺相关病毒的整合位点为AAVS1，具有低免疫原性的显著特点[18]，使其成为基因治疗中又一重要工具。学者通过腺相关病毒转导MSCs，可提高BMSCs治疗脊髓损伤的潜能[19]。然而，腺相关病毒对干细胞的转导效率因细胞类型不同而存在较大差异，这在一定程度上限制了其临床应用。

非整合病毒载体包括腺病毒载体和仙台病毒载体。腺病毒载体较少整合入宿主基因组，通常以异构体形式存在于细胞质中。尽管其转导效率较高，但腺病毒载体的高免疫原性可能导致宿主免疫反应，进而影响其治疗效果和安全性[20]。仙台病毒对人类无致病性，转导效率和基因表达水平较高，因此被广泛应用于目前细胞重编程和iPSC研究中[21]。

2.1.2. 基于非病毒方法的基因工程

基因工程也可以通过非病毒方法实现，这些方法通常分为物理方法和化学方法。物理方法包括几种通过物理方法将治疗基因转入MSCs的方法，如：1) 显微注射[22]：通过细胞膜直接注射基因物质，适用于小范围基因转染。2) 电穿孔和微穿孔[23] [24]：通过电场或微针产生微小孔隙，促进基因进入细胞，适用于大规模转染。3) 核转染法[25]：通过直接将DNA递送至细胞核进行转染。4) 磁选择感染法[26]：利用磁场控制携带基因的微粒进入细胞，具有高效率和精准性。5) 声学转染法[27]：利用超声波脉冲增强细胞膜通透性，适用于多种细胞类型。这些物理方法通常不依赖于外源载体，可较为直接地实现基因转染，具有较高的效率，尤其在某些特殊细胞的转染中更具优势[28]。

化学方法则依赖于化合物的内化作用，通过以下几种方式将基因转入MSCs中：1) 基于磷酸钙的转染[29]：学者通过将TGF-β1包封在磷酸钙中实现MSCs的转染，此方法在提高转基因效率方面表现较好。2) 阳离子脂质载体：阳离子脂质载体可调节大小以控制siRNA的局部递送，具有适应性释放的特点。然而，不同的脂质载体可能导致MSCs的转染效率不同[30]。3) 脂多糖载体：脂多糖载体：研究表明，阳离子脂类包裹的PEI/DNA复合体形成脂质复合物，能够提高转染效率并降低细胞毒性[31]。4) 阳离子聚合物：如聚赖氨酸，聚乙烯亚胺和树枝状聚酰胺-胺。这些阳离子聚合物能有效将DNA与细胞表面蛋白多糖结合并内化，但不像脂质体那样具有疏水结构[32]。5) 阳离子多糖与多肽复合物：碱性多肽和多糖与DNA形成复合物后，被细胞表面识别受体内化[33]。这些化学方法可通过调节不同的载体性质，提高基因转染效率，且相比病毒方法，通常具有较低的免疫原性。

2.1.3. 基因编辑

基因编辑如成簇的规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9 (CRISPR/Cas9技术)、TALENs或ZFN等，这些技术可以通过基因敲除、敲入或点突变编辑MSCs的基因，增强其自我更新能力、分化潜力或免疫逃逸能力[34]。学者使用慢病毒-CRISPR/Cas9效应物和单向导RNA转染MSCs来激活其中的外胚层发育不良启动子转录，汗腺特异性标志物在转染的MSCs中呈阳性，这项技术可能为受损汗腺和大面积深度烧伤提供一种新的治疗方法[35]。

MSCs基因工程修饰极大地扩展了MSCs的来源和应用潜力，但仍面临许多挑战，尤其是在基因组整合和转基因表达的控制方面，需要进一步的研究来优化其安全性和效率。病毒载体的基因传递基于病毒感染细胞的天然能力，但由于MSCs对病毒的自然感染性较低，这限制了病毒载体在干细胞中的应用范围。此外，基因重编程可能导致致癌基因表达的增加，进一步提高了基因工程过程中的潜在风险。逆转录病毒载体的一个显著特征是基因的随机整合，这可能导致基因组的不稳定性，因此其安全性仍需进一步评估[36]。由于这些风险(突变、异常转基因表达和免疫原性)，病毒载体方法在某些临床应用中的使用受到限制。非病毒方法因其低免疫原性和简便的操作程序而受到广泛关注，尤其是在减少基因转染的免疫反应方面具有优势。然而，MSCs在非病毒方法下的转染效率通常较低，这主要是因为这些方法很难在不影响细胞活性的前提下有效地将基因导入MSCs [37]。因此，尽管非病毒方法在免疫安全性方面具有优势，其转染效率仍是制约其临床应用的一个重要因素。基因编辑技术扩大了MSCs疾病治疗的应用，但仍然面临一些困境。所有的基因操作技术都会面临脱靶效应(基因编辑工具意外切割到非目标基因)、基因组不稳定和相关伦理的风险和挑战[38]。

2.2. 干细胞表面修饰

表面修饰作为提高MSCs治疗潜力的有效工具，具有显著优势。与其他方法相比，表面修饰的生产要求相对较低，因此更容易实现大规模生产[39]。该方法通过修改MSCs表面的分子结构，将生物活性物质(如药物、抗体或生长因子)通过共价或非共价相互作用连接到细胞膜上[40]。具体而言，共价修饰通过稳定的化学键将活性分子直接连接到细胞膜上的目标位点，确保其长期稳定性和持续效果。相比之下，非共价修饰则依赖于较弱的相互作用力(如静电力、氢键等)，这种修饰方法更为灵活，且通常可以更容易地调节生物活性物质的释放。由于这些方法的生产工艺相对简便且具有较高的可扩展性，表面修饰已成为一种具有广泛应用潜力的MSCs工程化修饰策略。

2.2.1. 共价结合

化学偶联：通过利用膜蛋白官能团作为接枝点，常用的化学交联剂包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团、马来酰亚胺和吡啶二硫醇。通过酰化或烷基化反应，多个化学基团可与伯胺形成稳定的共价键[41]。为促进MSCs在血管中的结合和滚动，学者使用马来酰亚甲基将P-选择素糖蛋白配体-1偶联至MSCs表面，以促进选择素介导的细胞结合和滚动，帮助MSCs在血管中流动至需要组织修复的部位，同时不会影响细胞的活力、增殖和多能性[42]。

酶促改性：由于MSCs全身输注后通常只有不足1%的细胞能够到达靶组织，干细胞的低归巢效率常归因于其低表达的表面归巢配体。尽管MSCs不表达E-选择素配体和CXCR4，但它们表达CD44+α-2,3-sialyl修饰的糖型。为此，学者使用α-1,3-岩藻糖基转移酶制剂在特殊的酶促反应条件下，将MSCs表面天然的CD44糖型转化为能够有效结合E-选择素和L-选择素的配体。这种修饰不仅提高了干细胞的归巢能力，还能有效促进骨再生，同时保持细胞的活力和多能性[43]。酶修饰法可以改善细胞表面标记物的种类，但仅限于细胞表面存在的受体。

抗体偶联：抗体具体高亲和性，能够特异性结合靶细胞表面过度表达的抗原，因此抗体偶联亦被用于改善MSCs归巢能力。研究表明，包被血管细胞粘附分子抗体的MSCs在炎症状态下能够高效递送至肠系膜淋巴结和结肠，显著提高了MSCs的疗效[44]。

2.2.2. 非共价结合

链霉亲和素与生物素能够快速形成牢固的非共价结合，这种结合在自然界中是最强的之一，且具有高度特异性。学者发现，这种生物素化方法可以方便且快速地对MSCs进行表面修饰，且对细胞活力、增殖、迁移和分化无明显影响[45]。学者通过三步化学过程将sLeX (一种细胞滚动配体)固定在MSCs表面。首先，细胞表面的胺基与NHS基团发生共价生物素化反应，然后利用链霉亲和素进行进一步的生物素功能化，最终，生物素化的sLeX与纳米级聚合物结构结合。然而，链霉亲和素-生物素复合物较为稳定，形成的细胞聚集体解离时间较长，这可能增加免疫排斥的风险[45]。

虽然MSCs表面修饰技术具有广泛的应用潜力，但也带来了一系列的风险和挑战。表面修饰的方法通过药物、纳米材料、抗体、配体等修饰MSCs表面，这些修饰物可能具有免疫原性，激活宿主的免疫系统。干细胞表面修饰后可能被免疫系统识别为“外来物质”，进而引起免疫排斥反应[45] [46]。MSCs表面通常具有丰富的表面分子，表面修饰可能改变这些分子的功能，影响干细胞的定向迁移、靶向能力和组织修复能力[40]。MSCs的表面修饰通常是暂时的，随着时间迁移和所处环境变化(温度、pH值和酶活性等)会发生解离，从而影响治疗效果[45]。因此，在进行MSCs表面修饰时，需要充分评估其安全性，并在临床前和临床试验中得到充分的验证[44]。

2.3. 干细胞物理化学修饰

干细胞疗法通常需要在体内外大量扩增，物理化学修饰可通过改变干细胞所处的微环境或直接改变干细胞本身的性质，来增强其功能。常用的几种物理化学修饰方法包括：1) 三维培养系统：通过利用三维支架或水凝胶等材料，建立更接近体内微环境的三维培养系统，促进干细胞的生长，从而提高其存活率、分化潜能和组织再生能力[47]。水凝胶的多孔框架不仅支持氧气、营养物质、分泌因子和代谢废物的有效扩散，还能包裹MSCs，避免免疫排斥反应，从而确保MSCs在体外存活并发挥功能[48]。2) 机械力调控：施加物理力(如剪切力、拉伸力等)可调控干细胞的增殖、分化及归巢能力。近年来，力学微环境被认为在干细胞的功能调控中起着至关重要的作用[49]。MSCs能够感知其周围环境中的机械信号，如刚度、应变、剪切应力等。这一能力被称为“机械感受性”，使MSCs能够适应不同的生长环境和生理状态[50]。学者开发的培养系统通过修改和测量细胞保留机械感累积效应的程度，解释了机械力可以通过纤连蛋白的RGD粘附基序对MSCs产生影响，从而调控其行为[51]。3) 生物电刺激：利用电场或电流对干细胞进行电刺激，已被证明可以改善干细胞的增殖、分化和迁移特性，尤其在骨再生和心血管疾病治疗中具有重要潜力。电刺激MSCs，导致胞质性钙离子增加，钙调蛋白活化，TGF-β mRNA表达增加，细胞内钙含量提高可增加MSCs的软骨分化潜力[52] [53]。

物理化学修饰虽然可以提高MSCs的功能性和治疗潜力，但也伴随一定的风险和挑战。物理化学修饰可能会导致干细胞生物学功能发生改变，过度的机械力和电刺激可能导致MSCs过度增殖或分化，影响其修复组织损伤[54]。物理化学修饰可能改变MSCs表面分子及抗原结构，导致免疫系统产生免疫反应。例如，电场处理可能改变MSCs表面蛋白的表达，被宿主免疫系统识别引发免疫排斥反应。物理化学修饰后也可能带来恶性转化的风险以及不良的材料与修饰剂的毒性问题。在进行MSCs修饰时，需要仔细评估潜在风险，采取适当的策略最小化风险。

2.4. 组织工程

组织工程结合了干细胞、支架和生物因子，旨在修复或再生受损的组织或器官[55]。通过设计和构建适合干细胞生长的支架或生物材料，提供物理支持和生物化学信号，从而促进干细胞的生长、分化和功能。主要的策略包括：1) 三维支架设计与构建：三维支架为干细胞提供物理支持，并通过表面特性和孔隙结构的优化，提供生物学信号，促进干细胞的增殖和分化。这些支架可以是天然或合成材料，常见的如胶原、聚乳酸、聚己内酯等[56]-[58]。通过优化支架的孔隙结构、表面特性及降解速率，可以进一步提高MSCs的组织修复能力[59]。2) 流体动力学与机械力学：通过模拟体内的生理环境，增强MSCs的功能。例如，生物反应器可以通过控制培养条件，如流速和剪切力，促进MSCs的增殖和分化，模拟体内微环境的复杂性[60]。

组织工程应用广泛，可用于骨缺损、软组织损伤、心脏病等多种疾病的治疗[55]。然而，这项技术在临床应用中也存在一些副作用及局限性。在开发此项技术的同时，仍然需要大量的临床研究[61]。大多数组织和器官具有复杂的结构和功能，现有的组织工程技术在重建这些复杂的组织和器官仍然面临巨大挑战[55]。组织工程结合了干细胞、支架和生物因子，尽管干细胞具有很强的分化能力，但大规模扩增对细胞活性和功能的影响仍然是一个难题[62]。并且，移植的干细胞来源于异体可能会被识别为外来物质，引发免疫排斥反应。有学者通过CRISPR/Cas9技术，在iPSC和胚胎干细胞中敲除β2微球蛋白、HLA-II的组装激活因子，再转导入HLA-E、PD-1、CD47基因，以减缓NK细胞、所有表达PD-1的淋巴细胞和巨噬细胞的攻击[63]。

3. 通过工程化修饰实现MSCs的功能化

前述的MSCs修饰策略表明，通过基因工程、表面修饰、物理化学修饰和组织工程，可以有效改善MSCs的生物学特性如靶向性、增殖及分化能力，从而增强其在再生医学和药物输送应用中的潜力。

3.1. 多能性

胚胎干细胞和胎儿干细胞具有全能性和多能性，但是胚胎来源的干细胞存在伦理问题。2007年，学者提出，体细胞的多能性可通过特定转录因子的诱导得到恢复。Kazutoshi Takahashi使用四种主要表达于胚胎干细胞的转录因子(Oct-3/4、Sox2、KLF4和c-Myc)，通过逆转录病毒将成纤维细胞诱导成为多能细胞[64]。如今，iPSC已广泛应用于细胞治疗，尤其在再生医学和癌症免疫治疗中取得了显著进展[64]。由于从单一供体获得足够数量的MSCs较为困难，研究表明iPSC可以被诱导为间充质样细胞，其基因表达和表型特征与原代MSCs相似[11]。

3.2. 提高存活率和活力

Carlos Theodore Huerta报告了一种通过慢病毒转染E-选择素，增强MSCs再生和促血管生成能力的方法。修饰后的MSCs表现出更强的存活率和活力，在缺血性伤口展现出更丰富的胶原沉积和血管生成反应[65]。尽管现有一些修饰方法可以提高MSCs的存活能力，但大多数传统药物修饰方法存在短期效果、不稳定性和细胞毒性问题。为解决这一问题，Yukiya Takayama开发了链霉亲和素-生物素复合物法，长期修饰小鼠MSCs，修饰的荧光素酶在体外可持续表达14天，且未对细胞活力、细胞增殖、迁移能力和分化能力产生显著影响[45]。

3.3. 靶向分布与迁移

MSCs具有归巢特性，肿瘤和靶器官分泌的细胞因子和趋化因子对MSCs的停滞和迁移起着重要作用。MSCs的归巢过程需要通过趋化因子、细胞外基质成分、选择素和整合素等受体进行调节[39]。然而，MSCs在体外培养扩增过程中会失去某些细胞表面粘附受体/配体的表达，导致归巢能力下降或丧失。Debanjan Sarkar提出了一种替代策略，通过生物素-链霉亲和素将SLeX (细胞滚动配体)共价偶联至MSCs表面，促进其归巢功能。该方法可在不影响MSCs活力、增殖、粘附和分化的情况下提高其靶向能力[43]。

在癌症治疗中，MSCs不仅具备免疫调节能力，还表现出肿瘤归巢特性。未修饰的MSCs已被证明具有抗肿瘤作用，主要通过分泌因子及与肿瘤细胞的物理相互作用发挥作用[66]。通过工程化MSCs靶向癌细胞表面受体，结合抗肿瘤剂(抗体和配体)或溶瘤病毒，能够显著增强其抗肿瘤靶向性[66] [67]。

此外，MSCs在心肌梗死后左室重构和心功能恢复中也表现出重要作用。Young-Wook Won等发现，脂质-聚乙二醇-CXCR4修饰的MSCs能够响应SDF-1 (心梗后上调的趋化因子)梯度，促进MSCs向缺血心肌的归巢。此研究表明，脂质可以作为一种非侵入性方法，将重组CXCR4成功应用于MSCs表面，优化其归巢效果[68]。

4. 结论

由于MSCs具有显著的自我更新、多潜能、免疫调控和归巢特性，它们成为细胞治疗领域的理想候选细胞。MSCs不仅能够再生受损的组织，传递治疗基因或制剂，还通过旁分泌作用，招募效应细胞，促进组织再生和疾病治疗。近年来，学者通过各种工程化策略进一步增强MSCs的治疗潜力。大量临床试验已证明，MSCs在干细胞治疗中的应用是安全的。然而，由于细胞存活、保留和植入能力较差，MSCs在体内的治疗效果仍然有限。为此，学者通过基因工程、表面修饰、物理化学修饰和组织工程来提高MSCs的治疗效果。MSCs可以通过病毒或非病毒方式进行基因改造，通过表达治疗性蛋白，以增强其固有特性。物理化学修饰则通过模拟体内干细胞微环境或生态位的生物物理和生物化学结构，增强MSCs的疗效和靶向性。此外，酶修饰、化学偶联或非共价相互作用可以提高MSCs对治疗部位的归巢能力。通过不同修饰方法，MSCs可以被功能化以表达外源基因，进一步提高其存活率和归巢能力，还可以整合治疗药物，从而增强治疗效果。MSCs在再生医学、免疫治疗和肿瘤治疗等领域的应用前景广阔，随着新的治疗特性的不断发现，基于MSCs的治疗有望得到更加广泛的应用。尽管功能化干细胞具有巨大的应用潜力，但其应用仍伴随着一定的风险和挑战。功能化MSCs可能被免疫系统识别为外来物质，从而诱发免疫排斥反应。为了改善组织修复或治疗效果，功能化MSCs可能通过增强其增殖能力，但过度增殖可能导致细胞失控并发生恶性转化。此外，干细胞的功能化通常通过改变其表面特征、分子受体和与微环境的相互作用来实现特定的治疗目的，但这种修饰可能影响细胞的基本功能，甚至干扰其自我更新、分化或迁移等生物学特性。功能化干细胞通常需要使用外源性材料，这些修饰材料可能具有毒性，进而对细胞和组织造成损害。更进一步，MSCs的基因工程修饰可能引发基因组不稳定性，增加基因突变和肿瘤发生的风险。总之，虽然功能化干细胞作为一种新兴的生物治疗方法，展现了巨大的应用前景，但也伴随着免疫反应、肿瘤发生、毒性、基因稳定性等方面的潜在风险和挑战。为了确保功能化干细胞的安全和有效应用，必须进行严格的风险评估，选择合适的修饰方法，并在临床前和临床试验中进行充分验证。并且，为了实现工程化干细胞的临床转化，仍需解决一些技术挑战，如细胞长期安全性、质量控制和治疗效果稳定性等问题。本综述重点介绍了各种工程化MSCs技术，讨论了它们的应用现状与局限性，以期为提高MSCs治疗效率提供有益见解。

基金项目

重庆医科大学附属口腔医院博士后科研启动金。

NOTES

^*通讯作者。