1. 前言
系统性红斑狼疮是一种慢性自身免疫性疾病，它可以影响各个系统，并且对脑、肾脏、心脏、皮肤等多个器官造成损害[1]。系统性红斑狼疮的发病机制可能受到复杂的遗传性、激素性、感染性、免疫性和环境因素等因素影响[2]。越来越多的证据表明，肠道菌群失衡引起的肠道屏障缺陷可能导致疾病的发展[3]，同时，肠粘膜屏障受损与许多自身免疫性疾病比如克罗恩病之间存在一定的相关性[4]。肠道屏障的完整性受到饮食和生活方式等因素的影响，是影响自身免疫性疾病发展的重要因素之一。肠道中的肠上皮细胞不止在吸收营养物质、调节电解质等方面发挥作用，在抵御肠腔中微生物、抗原和有毒物质中起到保护性屏障作用[5]。肠粘膜屏障主要由物理屏障、化学屏障、免疫屏障和微生物屏障组成。各屏障相关通过肠黏膜屏障功能标志物(血清中连蛋白(Zonulin)、肠脂肪酸结合蛋白(IFABP)、脂多糖结合蛋白(LBP)、脂多糖(LPS))共同作用，共同通过Zonulin途径、肠道微生物组和Toll样受体信号通路维持免疫稳态的平衡[6]。Zonulin目前是唯一被认可的细胞内紧密连接中的生理调节剂[7]。Zonulin水平升高导致抗原通过损伤的肠道黏膜，刺激粘膜和全身炎症发生，从而引起自身免疫性疾病的发展[8]。本研究的主要目的是评估诊断为系统性红斑狼疮的患者的血清Zonulin水平。此外，为进一步研究肠道通透性对系统性红斑狼疮疾病发展和严重程度的潜在影响，本文分析系统性红斑狼疮疾病活动指数(SLEDAI-2k评分)及免疫相关指标与Zonulin水平的相关性。
2. 材料和方法
2.1. 参与者与样本采集
在2022年9月至2024年6月青岛市市立医院风湿免疫科参照1997年美国风湿病学会(ACR)分类标准选取了60例初发系统性红斑狼疮患者，并招募了60例健康个体作为健康对照(HC)。由于在系统性红斑狼疮患者中，女性发病率远高于男性，故本实验选取的系统性红斑狼疮患者均为女性。所有受试者均来自于中国山东省不同地区。排除怀孕或哺乳患者，入组受试者均未有除SLE外任何基础疾病，包括其他自身免疫性疾病、高血压、糖尿病、严重精神疾病、炎症性肠病、其他炎症性疾病、自身免疫性和感染性疾病或恶性肿瘤等疾病。所有受试者中近8周内使用大剂量激素、口服益生菌及应用抗生素者排除。本实验在获得青岛大学市立医院伦理委员会批准的基础上进行，并且每一位受试者都自愿签署了参与研究的知情同意书，并收集患者外周血。
分别记录年龄、病程、使用的治疗方法、胃肠道系统(GIS)症状(消化不良、腹泻、便秘和腹痛)、并对患者进行系统性红斑狼疮疾病活动指数(SLEDAI-2k评分)评估患者疾病活动度、血沉、C-反应蛋白、免疫球蛋白、补体等临床指标。
2.2. 外周血的收集与存放
禁食12小时后，从所有患者和对照组获得5 ml的血样，在4℃下收集混合抗凝全血并以2400 rpm离心10分钟，取出上清液并放入Eppendorf管中。溶血的血清样本被排除在本研究之外。血清样本均存放于−80℃的冰箱中。
2.3. 酶联免疫法检测Zonulin及IFABP
从SLE组和HC组的参与者中收集血清样本，采用ELISA检测试剂盒，严格按照说明书的步骤检测Zonulin以及IFABP的水平。
2.4. 统计学分析
从研究中获得的数据通过使用SPSS 23.0版进行统计分析进行分析。除了描述性统计(频率、平均值和标准)外，还采用独立样本t检验比较正态分布的参数，而采用Mann-Whitney U检验来比较没有正态分布的2组参数。通过进行Pearson相关检验以表现符合正态分布的参数之间的关联，并使用Spearmam相关分析来分析不符合正态分布的参数之间的关系。当p值 < 0.05时，获得的结果被认为具有统计学意义。
3. 结果
1) 该研究包括60名系统性红斑狼疮患者和60名健康对照者。SLE患者和对照组的人口统计学特征和受累系统汇总于表1。患者和对照组的平均年龄分别为32.84 ± 11.46岁和30.71 ± 14.19岁。两组之间的年龄和性别没有显著差异。在患者组中，有消化不良、腹泻、便秘和腹痛等消化系统症状(GIS)的患者占入组的系统性红榜狼疮患者的51.66%，有肾脏累及(狼疮性肾病)患者占28.33%，发生脑梗死及神经系统表现等累及脑的患者占15.00%。SLE组中患者SLEDAI-2k评分平均值为4.67 ± 4.29分，其中重度活动(SLEDAI-2k > 12)有13人，中度活动(7~12分)及轻度活动(≤6分)分别有34、13人。
Table 1. Sample demographics and involvement of the system
表1. 样本的人口统计学和受累系统
|
SLE (n = 60) (%) |
HC (n = 60) |
年龄(岁) |
32.84 ± 11.46 |
30.71 ± 14.19 |
消化系统症状(GIS) |
31 (51.66) |
|
肾 |
17 (28.33) |
|
脑 |
9 (15.00) |
|
SLEDAI-2k (分) |
4.67 ± 4.29 |
|
|
轻度活动(≤6分) |
13 (21.67) |
|
|
中度活动(7~12分) |
34 (56.67) |
|
|
重度活动(>12分) |
13 (21.67) |
|
Values are expressed as mean ± standard deviation (number of persons) or number (%). CIS: Digestive symptoms; SLEDAI-2k: SLE disease activity index. 值以平均值 ± 标准差(人数)或数字(%)表示。CIS：消化系统症状；SLEDAI-2k：系统性红斑狼疮疾病活动指数。
Figure 1. Zonulin and IFABP levels. (A), (B): levels of intestinal mucosal barrier markers between SLE and HC. (C), (D): intestinal mucosal barrier marker levels between the three groups of mild, moderate and severe. E: Correlation analysis between SLEDAI-2k and Zonulin. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 was considered statistically significant
图1. 不同分组方式Zonulin及IFABP水平。(A)、(B)：SLE、HC二组间肠黏膜屏障标志物水平。(C)、(D)：轻度、中度、重度三组患者之间肠粘膜屏障标志物水平。(E)：SLEDAI-2k与Zonulin间相关性分析。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001认为有统计学意义
2) 健康对照组相比，系统性红斑狼疮患者的外周血Zonulin明显升高(376.6 ± 207.8 VS 114.10 ± 54.90，p < 0.001，图1(A))，同时，Zonulin和IFABP也较健康对照组明显升高(109.25 ± 46.62 vs 61.36 ± 38.20，p < 0.001，图1(B))。为进一步探究其与疾病活动度关系，本文将Zonulin与SLEDAI-2k进行线性回归分析，并以SLEDAI-2k作为标准将系统性红斑狼疮患者分为轻度、中度、重度相比较。结果显示Zonulin与SLEDAI-2k呈正相关关系(R2 = 0.5247，p < 0.001，图1(E))，而IFABP与SLEDAI-2k之间无明显相关性，且在系统性红斑狼疮患者中，重度患者Zonulin (634.50 ± 177.83)显著高于轻度患者(246.70 ± 126.50, p < 0.001)及中度患者(327.66 ± 156.75, p < 0.001)。虽然轻度组Zonulin明显低于中度组，但二组之间并无统计学意义(图1(C))。重度组(133.98 ± 62.63) IFABP仅显著高于轻度组(86.55 ± 33.03, p < 0.05)，中度组(108.48 ± 40.23)与重度组及轻度组均无统计学意义(图1(D))。因此，Zonulin可能作为一种评估患者疾病重度活动的潜在生物标志物之一。
3) 为进一步研究Zonuin与IFABP与疾病活动度的关系，我们统计了入组患者及健康对照组之间免疫指标如图2(A)，系统性红斑狼疮患者的血沉(42.42 ± 24.44, p < 0.001)、CRP (22.96 ± 30.87, p < 0.001)、ds-DNA (53.25 ± 42.48, p < 0.001)、IgG (19.20 ± 7.04, p < 0.001)显著高于健康对照组(9.07 ± 5.41、2.66 ± 1.39、2.18 ± 1.2、9.95 ± 3.36)。SLE组补体C3 (0.51 ± 0.26, p < 0.001)、C4 (0.22 ± 0.16, p < 0.05)均显著低于HC组(1.09 ± 1.43、0.28 ± 0.12)。与Zonulin存在正相关关系的临床免疫指标是CRP (r = 0.491, p < 0.001)、ds-DNA (r = 0.447, p < 0.001)、血沉(r = 0.519, p < 0.001)、免疫球蛋白G (r = 0.365, p < 0.001)，负相关的为补体C3 (r = −0.391，p < 0.001，表2)。与IFABP存在正相关关系的是CRP (r = 0.199, p < 0.05)、ds-DNA (r = 0.377, p < 0.001)、血沉(r = 0.451, p < 0.001)、免疫球蛋白G (r = 0.272, p < 0.05)，存在负相关关系的是补体C3 (r = −0.235，p < 0.01，表2)。然而，将系统性红斑狼疮患者分为有消化系统症状、确诊狼疮性肾病及狼疮性脑病三组，我们发现，三组之间Zonulin以及IFABP均无明显差异及统计学意义(图2(B)、图2(C))。以上结果也从侧面表明了肠粘膜屏障损伤标志物Zonulin一定程度上可能与疾病活动加重存在一定的关系，但与受累脏器及系统无关。
![]()
Figure 2. Clinical indicators and Zonulin and IFABP levels in patients with different organ involvement. (A): Clinically relevant index level between SLE and HC, CRP: C-reactive protein; ds-DNA: double-stranded DNA; ESR: sedimentation; C3: complement C3; C4: complement C4; IgG: immunoglobulin G; IgM: immunoglobulin M; IgA: immunoglobulin A, (B) and (C): The level of intestinal mucosal barrier damage between the three groups. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001
图2. 临床指标及不同脏器累及患者Zonulin、IFABP水平。(A)：SLE、HC二组之间临床相关指标水平，CRP：C-反应蛋白；ds-DNA：双链DNA；ESR：血沉；C3：补体C3；C4：补体C4；IgG：免疫球蛋白G；IgM：免疫球蛋白M；IgA：免疫球蛋白A。(B)、(C)：有消化系统反应、肾、脑脏器累及三组之间肠粘膜屏障损伤标志物水平。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001
Table 2. Zonulin, IFABP and related immune indicators
表2. Zonulin、IFABP和相关免疫指标相关性分析
|
Zonulin (ng/mL) |
IFABP (ng/mL) |
CRP (mg/L) |
0.491*** |
0.199* |
ds-DNA，IU/ml |
0.447*** |
0.377*** |
ESR (mm/h) |
0.519*** |
0.451*** |
C3 (g/L) |
−0.391*** |
−0.235** |
C4 (g/L) |
−0.086 |
−0.093 |
IgG (g/L) |
0.365*** |
0.272* |
IgM (g/L) |
−0.038 |
0.057 |
IgA (g/L) |
0.098 |
0.132 |
CRP: C-reactive protein; ds-DNA: double-stranded DNA; ESR: sedimentation; C3: complement C3; C4: complement C4; IgG: immunoglobulin G; IgM: immunoglobulin M: immunoglobulin; IgA: immunoglobulin A. All values were Pearson correlation test r-values, *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. CRP：C-反应蛋白；ds-DNA：双链DNA；ESR：血沉；C3：补体C3；C4：补体C4；IgG：免疫球蛋白G；IgM：免疫球蛋白M；IgA：免疫球蛋白A。数值均为Pearson相关检验r值，*p < 0.05；**p < 0.01***；p < 0.001。
4. 讨论
肠粘膜肠道通透性改变与许多自身免疫性疾病、代谢性疾病、神经及精神类疾病甚至皮肤病等有关联[9]。Zonulin是迄今为止唯一已知的细胞间紧密连接的生理调节剂，它作为结合珠蛋白2的前体，负责通过PAR2反式激活表皮生长因子受体。通过Zonulin通路，这两个受体都被激活，肠道通透性增加[10]。此外，IFABP也被认为是肠道损伤的标志物之一，因为它在小肠上皮细胞的细胞膜完整性受损后立即释放，随后仅在肠上皮细胞损伤后才出现在循环中，但并未得到国际统一认可[11]。Zonulin上调是由环境因素比如肠腔中的细菌(大肠杆菌、伤寒沙门氏菌)、肠毒素和某些食物(麸质)触发，而Zonulin长期上调会导致肠道通透性升高和抗原从肠腔易位到粘膜下层。在自身免疫性疾病中，由于肠道通透性增加导致非自身抗原通过细胞旁到固有层，并在那里与免疫系统相互作用[12]。
结果表明，系统性红斑狼疮患者血清Zonulin显著高于健康对照组，SLE患者存在肠粘膜受损的情况。最近的研究指出，SLE与肠道菌群失调有关，其特征是微生物多样性减少和群落组成改变，与不同的性别、种族群体和疾病活动无关[13]。有研究通过鸟枪法宏基因组测序的方法发现，大肠杆菌属的代表物种大肠杆菌在SLE患者中的富集度显著最高，并且与SLEDAI呈正相关，并且大肠埃希氏菌的多个表位与疾病活动或肾脏受累表型之间相关[14]。先前的一项研究表明，大肠埃希氏菌也确实是通过多种元素(如紧密连接蛋白)来促进肠上皮屏障功能障碍[15]。有相关研究表明，SLE患者的肠道生物组(Chao 1和ACE)的α多样性降低，尤其是在中重度狼疮患者中更为显著，表明SLE患者的丰富度和均匀度较低。在β多样性水平，SLE患者与健康人群的肠道菌群组成存在显著差异。在门水平上，肠道的微生物群特征主要以厚壁菌门、拟杆菌门以及变形菌门为主，厚壁菌门显著降低，而拟杆菌门、变形菌门以及放线菌门丰度更高，进一步表明了SLE患者中存在着菌群失调[2]。
SLEDAI是SLE患者的全球疾病活动指标，可以充分代表狼疮表现的复杂性。它被用作研究[16]和临床试验[17]中最常用的疾病活动指标之一。通过分析Zonulin与SLEDAI-2k得出随着肠粘膜屏障损伤加重，血清Zonulin升高，患者疾病活动度呈加重趋势。大肠杆菌感染的核苷酸平衡反应代谢物的变化可能参与了SLE的发病机制，同时参与大肠埃希氏菌的显著相关的肽聚糖生物合成途径，与SLEDAI-2k评分呈正相关[14]。
在研究中，临床评估患者疾病活动的指标(血沉、C反应蛋白、ds-DNA、免疫球蛋白G的升高及补体C3的降低)与Zonulin存在显著相关，同时也证明了血清Zonulin与疾病活动存在某种联系。表观遗传可能影响着系统性红斑狼疮患者的肠粘膜屏障，近期有相关文章表明，狼疮患者肠道通透性与疾病活动度呈正相关，这与我们的结果一致。同时得出926个CpG位点的DNA甲基化水平与肠道通透性显著相关，尤其在LRIG1中并在肠道稳态中发挥作用。在系统性红斑狼疮患者中，随着肠道通透性增加，细胞间粘附相关的基因可能在低甲基化的基因中富集[18]。
尽管有许多研究已经表明，Zonilin可评估系统性硬化症患者的胃肠道受累情况[19]、与强迫症患者中抑郁患者存在某种关联[8]。更有研究进一步通过粪便大肠杆菌饲养法证明了，Zonulin上调了狼疮相关血清性状并加重了MRL/lpr小鼠模型的肾小球病变[14]。遗憾的是，在本研究中，不同脏器及系统受累患者的血清Zonulin及IFABP均无显著区别，这可能与患者本实验样本量较小有关。本实验局限性在于仅研究实验时间过程中入院的患者，并未严格要求为初发未经过免疫抑制剂以及生物制剂治疗，不排除药物治疗对肠道菌群微生物组的改变以及对肠道黏膜屏障的影响，且对于可能影响肠粘膜屏障标志物的因素(饮食、生活习惯等)并无法做到严格把控。
总的来说，肠道通透性改变与系统性红斑狼疮活动度存在一定的关系，但具体调节机制尚未可知。外周血Zonulin一定程度上可能与SLE疾病活动加重存在一定的关系，或许可以作为系统性红斑狼疮患者疾病严重程度及进展的潜在生物标志物。但是，关于患者肠道屏障通透性的新数据可以为阐明发病机制和建立治疗方案开辟新的途径。为此，需要进行全面的研究，以评估系统性红斑狼疮患者肠道屏障的通透性和标志物(例如Zonulin、IFABP等)的存在，并进一步明确Zonulin如何在系统性红斑狼疮疾病的发病机制中发挥作用，并需要进一步体外实验验证。
声 明
该病例报道已获得病人的知情同意。
NOTES
*通讯作者。