1. 引言
自从抗生素问世以来,它在维护人类健康和促进畜牧养殖方面,始终扮演着无可替代的重要角色。抗生素的种类有很多种,根据结构式和基本原理将其大致分为7大类,但最常见的有5种,分别为𝛽-内酰胺类、磺胺类、大环内酯类、四环素类和氟喹诺酮类[1]。近年来,由于人们在使用抗生素时的不合理行为,导致抗生素污染问题频繁出现,这一问题引起了国内外学者的深切关注和重视[2]。抗生素进入人体或动物体后,不能被完全的吸收转化,有相当一部分会以原药或代谢产物的形式随母体的代谢物进入环境中。环境中的抗生素主要来自污水排放。据研究结果显示,有40%到90%的抗生素,通过原药或药物活性成分的形式,直接或间接的被排放到环境中[3]。因此,对于排入环境的抗生素对环境的污染影响,以及对生命体的毒理性研究,都显得尤为重要。
畜禽粪便和污水中的药物也可以通过施肥和灌溉等途径进入土壤。国内外许多研究学者多次报道了畜禽粪便和废水中检测到高浓度的抗生素[4],Pan等[5]人在中国黄淮海平原中检测了20种抗生素,浓度最高为575 ng/g。Jia等[6]对全球农业土壤中和地表水中抗生素研究发现,磺胺类抗生素(SAs)是在农业土壤和地表水中检测到频率最高的抗生素,四环素类抗生素(TCs)是在土壤中和地表水中中位数最高的,说明TCs是使用最广泛的抗生素。地表水和土壤中的抗生素污染通过渗透作用和淋洗作用进入到地下水中[7],造成了地下水中抗生素污染。Xiao等[8]人研究发现,地下水中检测出64种抗生素,大部分浓度在10~1000 ng/L,其中喹诺酮类抗生素(QAs)和SAs的浓度较高。抗生素可以通过各种方式进入人体,例如饮用水,残留了抗生素的肉、牛奶、鱼等。抗生素会在生物体内累积,并通过食物链放大,传递给人类,对人类造成各种危害,包括但不限于致癌、致畸、骨髓抑制和破坏肠道菌群等[9]。另外抗生素具有比较好的抑菌性,抑制植物和藻类的生长,降低环境中微生物的多样性,破坏生态系统的平衡,产生抗生素耐药性等[10]-[14]。研究表明,环境中低浓度的抗生素可促进抗生素耐药菌(ARB)和抗性基因(ARGs)的传播[4]。Zhang等[15]在河南省采集了34个地下水样品中检测到多种ARGs,其中以磺胺类、β-内酰胺类和四环素类ARGs为主。
健康风险评价是以人为主体的评价,描述污染物在特定暴露剂量下,对人体健康产生影响的概率大小和风险程度。目前最常用的健康风险评价方法有两种,一是饮水当量法,Jingyun Shi等[16]采用饮水当量法探究了中国北方地下水中抗生素,结果表示抗生素的风险商值显示出随年龄的增长而减小的趋势,风险商值的大小在2.6 × 10−7~1 × 10−3之间。Ting Meng等[17]也采用了该方法对中国南方沿江农村地区进行了调查,研究结果显示抗生素的风险商值在10−6~10−2。另一种方法是日均剂量法,Lyu J等[18]对中国的12座城市的饮用水中的抗生素进行了分析,研究结果显示三种SAs的健康风险商值分别为2.8 × 10−4~9.4 × 10−3,1.2 × 10−5~2.7 × 10−3,5.5 × 10−6~2.9 × 10−4。
本文选取5种最常见的抗生素作为研究对象,采集河南省某养猪场周围点位的地下水及土壤样品,探究抗生素的空间分布特征,并采用不同的评价方法进行人体健康风险评价,为后面抗生素的污染控制提供技术支撑。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
本研究使用的磷酸溶液和硫酸溶液均从永华化工有限公司购买。甲醇(色谱纯级)和乙腈(色谱纯级)来自美国默克公司。萃取使用的固相萃取柱(HLB, 200 mg, 6 mL)来自比克曼公司。三重四极杆液质联用系统中使用的色谱柱(2.6 μm EVO C18 100A)来自飞诺美公司。有机相针式滤膜(0.22 μm,尼龙)购自安培实验室技术(上海)有限公司。此外,5种抗生素标准品购自天津阿尔塔试剂公司,5种抗生素的全称及缩写如表1所示。
Table 1. Full names and abbreviations of the 5 antibiotics
表1. 5种抗生素的全称及英文简写
抗生素 |
简写 |
抗生素类型 |
抗生素 |
简写 |
抗生素类型 |
四环素 |
TC |
四环素类(TCs) |
磺胺嘧啶 |
SDZ |
磺胺类(SAs) |
金霉素 |
CTC |
磺胺甲噁唑 |
SMX |
恩诺沙星 |
ENR |
喹诺酮类(FQs) |
|
|
|
2.2. 样品采集
在河南省某地市选取了一个养猪场进行调查采样,该养猪场始建于2019年,养殖数量为6000头,养殖面积约为60,000 m2。废物处置方式为外运做肥料,整个厂区包括猪棚、污粪处理区以及办公区。厂区属于浅层地表水,地下水径流方向大致由西北方向往东南方向径流,地下水埋深较浅,水位埋深约7~10 m。采样点分布如图1所示。
样品采集参照HJ 91.1-2019的相关规定进行,采样时间为2024年4月,对研究区域内的点位进行采样,所有地下水样品采集后装入1.0 L磨口棕色玻璃瓶中避光冷藏保存。土样装入专用的密封袋,避光冷藏保存。水样使用贝勒管采样器进行采样,土样采用梅花形布点法采样,刮去表层2~3 cm的土壤,用铁锹挖取五点土样,装入密封袋混合。
Figure 1. Sampling point location map
图1. 采样点位置图
2.3. 抗生素提取
水样:准确量取经0.45 μm玻璃纤维滤膜过滤的水样0.5 L,并立即贮存在4℃的冰箱中,在提取之前,用4 mol/L硫酸和氨水调节pH值为4,并加入0.5 g Na2EDTA。然后用经5 ml甲醇、5 ml超纯水活化的HLB固相萃取住提取水样,上样速度约为10~15 ml/min。接着,用10 ml的超纯水淋洗HLB柱,并在负压条件下抽真空30分钟进行干燥,用5 ml甲醇以3 ml/min (约1滴/秒)的流速洗脱,收集洗脱液。洗脱液氮气吹干,然后用甲醇溶液定容至1 ml。样品定容过后0.22 μm滤膜,使用LC-MS进行分析。
土壤:准确称取(1.00 ± 0.01 g)经研磨的土壤样品(过2 mm筛),置于50 ml聚乙烯离心管中,加入10 ml Na2EDTA-McIlvaine缓冲液,涡旋30 s(室温),于4℃下,超声15 min,8000 r/min条件下离心10 min,收集上清液。吸取上清液至另一洁净的离心管中,同样的步骤提取两次,之后再用10 ml有机混合提取剂提取两次,合并4次上清液,稀释至250 ml,过0.45 μm玻璃纤维滤膜,之后样品的净化和浓缩等与水处理的方法一致。
2.4. 数据处理
本论文中主要利用软件Microsoft Office Excel 2021对实验数据进行整理、运算;利用Origin绘制图形。
健康风险评估
(1) 饮用水当量法
风险商的计算是通过环境实测浓度MEC与饮用水当量水平DWEL做商[19],得到单个目标抗生素的风险商值RQi。由于抗生素之间存在协同作用,所以,一个采样点的风险商值是由各目标抗生素的风险商值RQi加和所得到的RQs代表。风险商RQi及RQs由公式(1)、(2)、(3)计算得到。RQ被分为3个等级,分别为:RQ < 0.1,低风险;0.1 < RQ < 1,中等风险;RQ ≥ 1,高风险[20]。不同年龄段的DWI及BW的推荐值如表2。
(1)
(2)
(3)
式中:
ADI——可接受的每日摄入量(μg/kg/day);
BW——成人或儿童的体重(kg);
HQ——危害商,取1;
DWI——饮用水摄入量(L/day);
AB——吸收速率,取1;
FOE——暴露频率,356 d/365 d = 0.96。
(2) 平均每日潜在剂量法
该方法是将暴露途径分为两部分,一是通过饮用水吸收;另一部分是通过皮肤接触。之后将两部分的ADD加和,与每日可接受摄入量做商,得到风险商值(即HRQ值或RQ值),具体计算公式如(4)、(5)、(6)和(7)所示[21]。参数的取值见表3~5。
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
式中:
cdw——饮用水中抗生素的浓度(μg/L);
IngR——摄入量(L/day),主要参考《中国人群暴露手册》;
EF——暴露频率(day/year),350 day/year;
ED——暴露周期(year),非致癌效应为30,致癌效应为0;
BW——成人或儿童的体重(kg);
AT——平均时间(days),非致癌效应为30年,即10950,致癌效应固定为25550,即70年;
SAi——皮肤接触面积(cm2);
C——皮肤接触到的水中抗生素的浓度(μg/L);
T——皮肤与抗生素接触的时间(hours/day)
Kp——渗透系数:
Kow——目标抗生素的正辛醇/水分配系数;
MW——目标抗生素的摩尔质量(g/mol)。
Table 2. Recommended values of DWI and BW for different age groups
表2. 不同年龄段DWI、BW推荐值
年龄段 |
0~3 月 |
3~6月 |
6~12月 |
1~2岁 |
2~3岁 |
3~6岁 |
6~11岁 |
11~16岁 |
16~18岁 |
成人 |
BW |
5.6 |
7.2 |
9.4 |
12 |
13.8 |
19 |
36 |
56 |
57 |
60 |
DWI |
1.15 |
1.14 |
1.18 |
0.85 |
0.83 |
1.16 |
1.55 |
1.9 |
1.77 |
2.04 |
Table 3. Value of ADI [22]
表3. ADI的取值[22]
抗生素 |
ADI (μg/kg/day) |
LogKow |
MW |
恩诺沙星 |
6.2 |
0.64 |
359.44 |
磺胺嘧啶 |
50 |
2.59 |
250.27 |
磺胺甲噁唑 |
130 |
0.89 |
253.28 |
四环素 |
30 |
−1.33 |
444.48 |
金霉素 |
20 |
−0.62 |
478.92 |
Table 4. Skin contact area per event
表4. 每个事件的皮肤接触面积
SAi (cm2) |
洗手 |
洗脸洗头 |
洗脚 |
洗盘子 |
洗菜 |
洗衣服 |
洗澡 |
游泳 |
男性 |
800 |
1300 |
1100 |
800 |
800 |
800 |
17,000 |
6300 |
女性 |
700 |
1200 |
100 |
700 |
700 |
700 |
15,000 |
5700 |
Table 5. Recommended intake by season in Henan
表5. 河南地区分季节摄入量推荐值
区域 |
季节 |
IngR(L/day) |
河南 |
春秋 |
2.34 |
夏季 |
2.90 |
冬季 |
2.30 |
3. 结果与讨论
3.1. 土壤中抗生素的残留特征
土壤中抗生素的残留浓度见表6。检测的8个土样中,TC,CTC和SMX的检出率分别为2.5%、12.5%和50%。两种TCs的总含量为n.d.~0.1459 μg/L,以CTC为主,这可能是因为TC在厌氧的田间能被降解[23]。两种抗生素主要集中于高污染点位S6。这可能是由于S6点位附近有粪便堆积区,且地面硬化没做好,导致抗生素下渗入到土壤中,该点位所在农田可能采取了该养殖场产生的粪便及污水施肥、灌溉农田。SDZ和ENR在土壤中均未检出,这可能是因为这两种抗生素容易发生水解和光解[24],且容易被有机质吸附在土壤中,在雨水淋溶作用下或阳光照射下,转入地下水或被光解,从而使土壤中的含量低于检测限。SMX在S2、S4、S5、S6四个点位均有检出,浓度范围在n.d.~0.19 μg/L。SMX在土壤中多次检出,这可能与其理化性质相关,SMX不易吸附并且难以降解。相较于SDZ、ENR两种易吸附,且水解或光解的抗生素而言,不能够得到有效的光降解,或者是随着淋溶作用下渗到地下水中,从而少量残留于表层土壤。TCs类抗生素,容易水解,在雨水的淋溶作用下,会渗入深层土壤和地下水中[25]。五种抗生素在土壤中含量的高低顺序为:SMX > CTC > TC > SDZ = ENR,最大残留浓度点为S6。
Table 6. Residual concentrations of antibiotics in soil
表6. 土壤中抗生素的残留浓度
点位 |
TC |
CTC |
SMX |
SDZ |
ENR |
S1 |
n.d. |
n.d. |
n.d. |
n.d. |
n.d. |
S2 |
n.d. |
n.d. |
0.0205 |
n.d. |
n.d. |
S3 |
n.d. |
n.d. |
n.d. |
n.d. |
n.d. |
S4 |
n.d. |
n.d. |
0.19 |
n.d. |
n.d. |
S5 |
n.d. |
n.d. |
0.0017 |
n.d. |
n.d. |
S6 |
0.0109 |
0.135 |
0.0015 |
n.d. |
n.d. |
S7 |
n.d. |
n.d. |
n.d. |
n.d. |
n.d. |
S8 |
n.d. |
n.d. |
n.d. |
n.d. |
n.d. |
3.2. 地下水中抗生素的残留特征
地下水中抗生素的残留浓度如表7所示。检测的8个地下水样中,八个点位均能够检测出四环素类的抗生素,检出率为100%,三种抗生素的检出率分别为75%,87.5%和62.5%。TC检测出的浓度范围在1.581~16.95 μg/L,CTC检出的浓度范围在1.226~23.414 μg/L,SMX的为n.d.~2.099 μg/L,SDZ的为n.d.~8.886 μg/L,ENR的为n.d.~8.308 μg/L。由表可见,CTC、SMX和SDZ在各点的残留状况相当,只有在S7点位陡然变大。并且四环素类抗生素的检出浓度相较于其他两种抗生素的检出浓度,普遍较大,这说明该养殖场使用的抗生素类型主要为四环素类。同时,在S7点位,各抗生素检出浓度普遍为最大值,这可能是因为S7点位距离粪便堆积区较近,粪便堆积的渗滤液下渗,污染地下水,另外该点位于地下水的下游,上游污染的水体在该点富集,造成了该点位抗生素浓度整体偏高。
Table 7. Groundwater antibiotic test results
表7. 地下水抗生素检测结果
点位 |
TC |
CTC |
SMX |
SDZ |
ENR |
S1 |
2.048 |
1.226 |
0.827 |
n.d. |
n.d. |
S2 |
7.613 |
1.569 |
0.943 |
0.085 |
2.139 |
S3 |
8.42 |
1.255 |
0.792 |
0.194 |
n.d. |
S4 |
2.64 |
1.341 |
n.d. |
0.139 |
n.d. |
S5 |
16.95 |
2.813 |
n.d. |
0.167 |
2.386 |
S6 |
4.028 |
1.627 |
0.903 |
0.317 |
7.885 |
S7 |
5.374 |
23.414 |
2.099 |
8.886 |
8.308 |
S8 |
1.581 |
1.255 |
0.850 |
0.112 |
1.946 |
3.3. 环境中抗生素的健康风险评价
3.3.1. 饮用水当量法
饮水当量法对该养猪场周边地下水进行评价。具体结果如图2所示,图2(a)和图2(b)展示了TCs的评价结果,发现TCs通过饮用水途径成年人的健康风险评价在该区域处于0.00172~0.03821之间,对6~18岁孩童的健康风险处于0.00157~0.06862之间,对0月~6岁孩童的0.0104~0.2308之间。结果表明通过此途径对0月~6岁孩童的健康风险指数在该区域内要普遍高于成年人和青少年,属于最敏感人群。在图2(d)和图2(e)中,SAs通过饮用水途径成年人的健康风险评价在该区域处于0.00006~0.0058之间,对6~18岁孩童的健康风险处于0.00006~0.0735之间,对0月~6岁孩童的0.0004~0.0350之间。这表明通过此途径对6~11岁青年的健康风险指数在该区域内要普遍高于成年人和儿童,属于最敏感人群。图2(c)中发现ENR通过饮用水途径成年人的健康风险评价在该区域处于0.01024~0.04374之间,对6~18岁孩童的健康风险处于0.00936~0.05539之间,对0月~6岁孩童的0.01812~0.2642之间。这表明ENR的风险商要显著高于另外两种抗生素的风险商,对低龄儿童的风险已然达到了0.2642,这应当予以足够的重视。通过此途径对低龄儿童的健康风险指数在该区域内要普遍高于成年人和儿童,属于最敏感人群。
Figure 2. Evaluation results of the drinking water equivalent method: (a) TC; (b) CTC; (c) ENR; (d) SDZ; (e) SMX
图2. 饮用水当量法的评价结果:(a) TC;(b) CTC;(c) ENR;(d) SDZ;(e) SMX
3.3.2. 平均每日潜在剂量法
根据前文查到的相关参数及公式,计算得到5种抗生素的RQ,如图3所示。图3(a)表示了TCs的评价结果。结果发现TC对成年男性的风险在9.99547E−06~1.1055E−05之间,对成年女性的风险在6.02213E−06~1.13819E−05;CTC对成年男性的风险在2.47163E−06~7.03729E−05之间,对成年女性的风险在6.30844E−06~1.20517E−05;整体都存在健康风险,但是这种风险还可以被接受;图3(b)表明SMX对成年男性的风险在n.d.~6.36235E−07之间,对成年女性的风险在n.d.~7.24464E−07;SDZ对成年男性的风险在n.d.~7.04001E−06之间,对成年女性的风险在n.d.~8.01308E−06;磺胺类抗生素的风险相较于四环素类抗生素要小一个数量级,大多数点位表现为无明显健康风险,个别地区处于可接受的风险状态。由图3(c)可以得到,ENR对成年男性的风险在n.d.~5.27843E−05之间,对成年女性的风险在n.d.~6.01056E−05。ENR的风险相较于前两类抗生素普遍要高,大多数点位处于可接受的风险状态,只有三处点位表现为无风险状态。
Figure 3. Results of the evaluation of the average potential daily dose method: (a) TCs; (b) Sas; (c) ENR
图3. 平均每日潜在剂量法的评价结果:(a) TCs;(b) SAs;(c) ENR
3.3.3. 综合评价结果
将每个点位各个抗生素的风险商相加,得到一个总风险商。具体结果如图4所示。图4(a)为使用饮用水当量法评价的结果,发现在S1、S3、S4、S8点位,抗生素的联合风险商均在0.1以下,对各年龄段的人群表现为无健康风险;在S2、S5、S6、S7点位,抗生素对部分人群表现为中等风险,主要集中在2岁以下儿童,S7点位抗生素的影响已延伸到11岁儿童。在所有点位中,均未出现高风险点位,由结果可以看出,随着年龄的增加,人体受到抗生素带来的风险也随之减小,16~18岁时期的青年受到的影响最小。使用日均潜在剂量法评价的结果如图4(b)所示,S1点位为最低风险点位,成年男性、女性的风险商为5.1 × 10−6,5.8 × 10−6,均大于10−6;S7点位为最高风险,男性、女性的风险商为1.02 × 10−4、1.16 × 10−4,均大于10−4;根据风险判定标准,S1~S8点位(S7除外),为可接受风险,对人体影响可以忽略,S7点位为不可接受风险,需要引起重视。
Figure 4. Combined results of the two evaluation methods:(a) Comprehensive evaluation results of the drinking water equivalent method;(b) Comprehensive evaluation results of the average potential daily dose method
图4. 两种评价方法的综合评价结果:(a) 饮用水当量法的综合评价结果;(b) 平均每日潜在剂量法的综合评价结果
总体来说,饮用水当量法对广泛的人群和年龄段进行了评估,根据结果显示RQ值呈现出随年龄的增长而减小的趋势。这一规律与Jingyun Shi等[16]研究一致。另外养殖场对低龄儿童的潜在健康风险较大,特别是S7点位,对6~11岁的青少年也存在影响,这与S7点位附近是蓄粪池有关。而日均潜在剂量法则更侧重于特定个体(成年男性和女性)的潜在风险,该方法确定的暴露途径更加全面,同时也将季节,性别等考虑在内,使评价结果相较于饮水当量法更加准确。本研究结果显示只有S7点位表现为不可接受风险,其余点位均为可接受风险。两种方法各有特点,饮水当量发法便捷高效,能够快速的识别风险地区以及敏感人群,可以对污染地区做出快速反应,而日均潜在剂量法更加具体,考虑的暴露途径更加全面,计算方法相较于饮用水当量法稍微繁琐一些,可以对点位进行更加详细的风险评估,便于制定特定人群的保护措施。
4. 结论
本研究探究了在该畜禽养殖场周边环境中抗生素的残留特征及健康风险评估。研究结果表明,在该养殖场周边的地下水环境中,TCs的检出率最高,为100%,且最高残留浓度为23.414 μg/L。SAs和ENR的检出率都较低,但ENR的残留浓度比SAs的高。因此在该养殖场的主要用药类型为TCs。在检测的8个点中,主要污染集中在S6、S7、S8这三个点位,主要是因为这三个点在蓄粪池周边。在该养殖场的周边土壤中,SDZ和ENR均未检出,TCs也只有在S6点位有检出,SMX在本次研究中多次检出,这与它本身不易被吸附也不易降解的性质有关。在人体健康风险评价方面,饮水当量法的评价结果表示:在S1、S3、S4、S8点位,对各年龄段的人群均表现为低风险;在S2、S5、S6、S7点位,对低龄的儿童有中等健康风险。特别是对于0~3月的儿童,在各点位受到的风险均高于其他年龄段,属于敏感人群。日均潜在剂量法的评价结果表示:除S7点位外,成年男性和成年女性的健康风险尚属于可接受的风险,并不会对人体健康造成影响。仅有S7点位,风险商大于10−4,属于不可接受风险,应当引起重视。并且根据结果显示,TC给男性带来的风险高于女性,另外4种抗生素给女性带来的风险要高于男性。本研究再次证实了畜禽养殖场周边环境中抗生素的污染不容忽视,因此,我们应该加强对抗生素的监管,另外,还需进一步开展环境中抗生素的源头解析、污染治理和生态风险评估管理,维护土壤安全和人体健康。
NOTES
*通讯作者。