1. 引言
酒精性肝损伤(Alcoholic Liver Injury, ALI)作为酒精性肝病进展的核心病理环节，其发病机制涉及氧化应激、炎症级联反应及肠肝轴紊乱等多重病理过程[1]。尽管戒酒仍是首要干预措施，但临床缺乏特异性靶向治疗药物，约30%患者最终进展为肝纤维化[2]。中医药在ALI防治中展现出独特优势，其中“肝与大肠相通”理论通过调控肠–肝对话机制，为ALI治疗提供了创新视角[3] [4]。课题组基于该理论创制的复方三黄饮(赶黄草–炙黄芪–生大黄，SHY)临床显示可显著改善患者肠黏膜通透性及肝脏炎症指标[5]，但其多靶点作用机制尚未系统阐明。
近年来研究发现，白细胞介素11 (IL-11)作为IL-6家族的关键成员，在纤维炎症性疾病中发挥核心病理作用。近期Gut期刊突破性研究揭示：肝细胞IL-11信号通路是酒精性肝损伤的核心驱动因素，其表达水平与肝脏炎症程度呈正相关，且靶向阻断IL-11R可有效缓解乙醇诱导的肝损伤[6]。因此，本研究拟利用网络药理学预测SHY改善ALI的活性成分及分子机制，通过Lieber-DeCarli酒精液体饲料[5% (vol/vol)乙醇]复制野生型(WT)小鼠ALI模型，探究SHY抗ALI的具体作用机制，以期为SHY的开发研究提供实验依据。
2. 材料与方法
2.1. 仪器及试剂
多功能酶标仪(BIO-TEK, SynergyHTX)，全自动生化分析仪(Roche Cobas c501)；玻璃匀浆器或超声破碎仪(Sonics，型号VCX750)，SDS-PAGE凝胶电泳槽(Bio-Rad, Mini-PROTEAN)，湿转系统(Bio-Rad Trans-Blot SD)等。
SHY由眉山市中医医院制剂室中心提供，试剂包括ELISA试剂盒(百奥莱博，货号ZN2238)，PBS缓冲液(Gibco，货号10010023)，蛋白酶抑制剂(Roche，货号04693116001)，RIPA裂解液(Thermo，货号89900)，蛋白浓度检测试剂盒(Pierce，货号23225)，ECL显影液(Millipore，货号WBKLS0500)等。
2.2. 方法
2.2.1. 网络药理学分析和分子对接
1) 收集与筛选赶黄草、炙黄芪、生大黄的活性成分
通过文献检索和查询数据库的方式，获取赶黄草化学成分约120个，随后在TCMSP数据库中，按照口服药物生物利用度(OB) ≥ 30%，类药性(DL) ≥ 0.18的条件筛选到符合此条件的15种化合物；并在TCMSP数据库中检索炙黄芪、生大黄的活性成分，按照上述筛选条件，收集活性成分，并在TCMSP中获取上述三种药物靶点信息。利用Uniprot数据库，设置种类为Homosapiens，将所有靶点转化为基因名称，并剔除重复及无法检测的靶点，获得上述三种中药的有效成分靶点。
2) 酒精性肝损伤相关靶点的获取
检索三个公开可用的基因库：Gene Cards、OMIM和TTD。为获取疾病相关基因靶点，以“Alcoholic Liver Injury”为检索词进行检索，利用中位数进行筛选，获得酒精性肝损伤基因靶点。
3) 赶黄草、炙黄芪、生大黄与酒精性肝损伤的PPI网络构建
将药物与疾病的靶点进行相互映射，利用Evenn网站获得交集基因。将药物和疾病的交互靶点蛋白导入STRING数据库，物种选择为“Homosapiens”，交互作用阈值为“0.40”，构建蛋白互作的PPI网络图，下载tsv格式文件，并导入Cytoscape 3.9.1软件中，并在其App中以Centiscape 2.2选定Betweenness、Closeness、Degree计算阈值，将大于阈值的交集蛋白确定为蛋白互作网络中的关键靶点。
4) 生物学功能富集分析
在DAVID中导入赶黄草、炙黄芪、生大黄与酒精性肝损伤的共同靶点，进行基因本体(Gene Ontology, GO)的生物过程(Biological Process, BP)、分子功能(Molecular Function, MF)、细胞组分(Cell Component, CC)富集分析，以及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，将P < 0.01的生物过程与通路筛出，再按富集基因数从大到小排序，选取前几位药物治疗酒精性肝损伤的主要基因功能富集过程和信号通络，预测赶黄草、炙黄芪、生大黄治疗酒精性肝损伤的潜在作用机制。
2.2.2. 分组、造模及干预
1) 分组
8~10周龄的C57BL/6WT 60只小鼠饲养于恒温恒湿标准化IVC动物房。适应性喂养7 d后，随机分为空白对照组、模型对照组、阳性药对照组、复方三黄饮高剂量组、复方三黄饮中剂量组以及复方三黄饮低剂量组，每组各设置10只小鼠。
2) 造模及干预
参考文献[6]的描述方法进行造模，依次各给药组小鼠每日灌胃，高中低剂量分别为20、10和5 g/kg，其余各组小鼠灌胃等体积蒸馏水；造模最后一天结束后收集各组小鼠血清及肝脏组织。
3) 检测指标
干预前后取小鼠静脉血检测ALT、IL-11，干预后检测小鼠肝脏IL-11、p-STAT3及STAT3蛋白表达。
4) 统计方法
采用IBM SPSS 23.0软件统计数据。正态性数据的组间比较采用单因数方差分析并进行方差齐性检验；非正态性数据组间比较采用非参数检验。蛋白表达差异使用单变量两因素方差评估。
3. 结果
3.1. 赶黄草、炙黄芪、生大黄与酒精性肝损伤的交集靶点
在TCMSP数据库中筛选出赶黄草、炙黄芪、生大黄的主要活性成分相关靶点，去重后得到219个相关靶点。在GeneCards数据库筛选并去重后得到1032个酒精性肝损伤的潜在靶点，之后运用EVenn分析获得共同靶点基因106个，见图1所示。
3.2. 赶黄草、炙黄芪、生大黄与酒精性肝损伤交集靶点的蛋白互作网络(Protein-Protein
Interaction, PPI)分析
将赶黄草、炙黄芪、生大黄治疗酒精性肝损伤的106个靶点导入STRING平台中进行分析，构建赶黄草、炙黄芪、生大黄与酒精性肝损伤靶点PPI网络图(图2(a))。将得到的网络文件导入Cytoscape中，根据Dergee值大小对该PPI网络进行可视化分析(图2(b))，Dergee值代表网络中节点的连接度。连接度越高的靶点，在网络中的作用越重要。
通过PPI分析得出TNF、BCL2、HIF1A、TP53、EGFR、AKT1、IL1β、MMP9、IL6、PTGS2、ESR1、CASP3、TGFB1、CXCL8、PPARG基因在该网络中连线较多，在该网络中处于核心位置，是较为重要的节点。
Figure 1. Venn diagram of potential therapeutic targets of Penthorum chinense Pursh, Astragalus membranaceus, and Raw Rheum palmatum in alcohol-induced liver injury
图1. 赶黄草、炙黄芪、生大黄治疗酒精性肝损伤的潜在靶点韦恩图
(a)
(b)
Figure 2. (a) Protein-protein interaction (PPI) network of therapeutic targets of Penthorum chinense Pursh, Astragalus membranaceus, and Raw Rheum palmatum in alcohol-induced liver injury; (b) PPI network of Penthorum chinense Pursh, Astragalus membranaceus, and Raw Rheum palmatum in alcohol-induced liver injury
图2. (a) 赶黄草、炙黄芪、生大黄治疗酒精性肝损伤的靶点蛋白相互作用网络图；(b) 赶黄草、炙黄芪、生大黄治疗酒精性肝损伤的PPI网络图
3.3. 赶黄草、炙黄芪、生大黄治疗酒精性肝损伤的GO及KEGG富集分析
为了更系统地分析赶黄草、炙黄芪、生大黄的治疗机制，我们利用DAVID数据库对赶黄草、炙黄芪、生大黄治疗酒精性肝损伤的交叉靶点进行基因通路富集分析。赶黄草、炙黄芪、生大黄治疗酒精性肝损伤的GO基因富集分析结果显示，BP共富集得到3886个条目，CC共有218个条目，MF共416个条目，排序后得到BP、MF、CC各前十个GO条目，共30个条目。其中BP主要与活性氧代谢过程、对脂多糖的反应、调节活性氧代谢过程、细胞对化学应激的反应、外源性凋亡信号通路、凋亡信号通路的负调控、对活性氧的响应、凋亡信号通路的调节等相关；CC主要与膜筏、膜微结构域、膜区域、囊泡管腔、分泌颗粒腔、细胞质囊泡腔、蛋白激酶复合物、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物等相关；MF主要与细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、信号受体激活剂活性、DNA结合转录因子结合、核受体活性、配体激活的转录因子活性、磷酸酶结合、丝氨酸型内肽酶活性等相关，见图3(a)。将交叉基因与KEGG通路对比，共富集到236个条目，取排名前20条与酒精性肝损伤相关的通路，包括IL-17信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、C-type lectin receptor信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、Toll-like receptor信号通路等，见图3(b)。由上述富集结果分析可知，赶黄草、炙黄芪、生大黄可能多过程、多通路地发挥治疗酒精性肝损伤的作用，其中PI3K-Akt、JAK-STST信号通路是其中重要的通路，因此推测其最有可能参与赶黄草、炙黄芪、生大黄治疗酒精性肝损伤的过程。
3.4. SHY对ALI小鼠模型的影响
研究发现该SHY复方明显降低ALI模型小鼠循环内IL-11和ALT水平，同时抑制肝组织中IL-11和p-STAT3蛋白表达，见图4，提示该药对改善ALI药效明确，且可能通过调控IL-11R/JAK/STAT通路起作用。
(a)
(b)
Figure 3. (a) Gene ontology (GO) enrichment analysis of therapeutic targets of Penthorum chinense Pursh, Astragalus membranaceus, and Raw Rheum palmatum in alcohol-induced liver injury; (b) Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis of therapeutic targets of Penthorum chinense Pursh, Astragalus membranaceus, and Raw Rheum palmatum in alcohol-induced liver injury
图3. (a) 赶黄草、炙黄芪、生大黄治疗酒精性肝损伤相关靶点的GO富集分析；(b) 赶黄草、炙黄芪、生大黄治疗酒精性肝损伤的KEGG通路富集分析
Figure 4. Therapeutic effects of compound Sanhuang Yin on alcohol-induced liver injury and its specific downstream mechanisms
图4. 复方三黄饮改善ALI的药效及部分下游机制
4. 讨论
“肝与大肠相通”理论首见于《医学入门》，其理论基础可追溯到《黄帝内经》，历代医家多有阐述及实践，证实从肠论治肝病疗效确切。《灵枢·经脉》曰：“肝足厥阴之脉……其支者，复从肝，别贯膈，上注肺”、“大肠手阳明之脉……络肺，下膈，属大肠”，揭示二者通过肺经间接相连。《素问·阴阳应象大论》曰：“左右者，阴阳之道路也……肝气自左升，肺气从右降”，阐释肝与大肠气机升降的关联。东汉时期从五行相克与功能互用方面进行治疗，其中《伤寒论》云：“阳明病，无汗，小便不利，心中懊憹者，身必发黄”，首次提出肠腑不通致肝胆湿热发黄的病理关联。《难经》言：“肝之为脏……其治在左，其藏在右”，奠定肝体阴用阳的生理特性，与大肠传导功能呼应。隋唐至宋元时期，该理论在脏腑气化与形气相通方面得到发展，《诸病源候论》(巢元方，隋)曰：“肝病可致飧泄，大肠病可致目黄”，明确肝肠病理传变；《素问玄机原病式》(刘完素，金)曰：“木郁则达之，金郁泄之”，以五行生克阐释肝(木)与大肠(金)的生理制约。明清时期进一步将理论系统化与临床深化，《医宗金鉴》(吴谦，清)曰：“肝居膈下，大肠当脐左回十六曲……膈膜相连，气血相通”，补充解剖与功能联系；唐容川的《中西汇通医经精义》(清)曰：“肝借道大肠以降浊，疏泄得畅，大肠通降方顺”，提出“肝–肠气化协同”学说；《类证治裁》(林佩琴，清)曰：“肝木性升散，郁则气逆……为飧泄”，完善了肝失疏泄致大肠传导失常的病理机制。近现代：该理论与现代医学相印证。《董氏奇穴》(董景昌，20世纪)曰：“肝与大肠相通，由六经开阖枢推衍，脏腑气化相通”，呼应《灵枢》经络理论。陈英杰等言：“肝寄腑于大肠，降浊以维疏泄”，结合“肠–肝轴”机制诠释经典理论。因此，中医认为“肝与大肠相通”，肝病可从肠论治，“六腑以通为用”，通腑泻浊法是从肠论治肝病的重要治法，强调腑气通降，则肝疏泄有常。
酒精性肝损伤归属于中医“胁痛”、“酒疸”、“伤酒”、“酒癖”、“酒胀”、“酒臌”等范畴[7] [8]。《灵枢·五枢》云：“邪在肝，则两胁中痛。”《诸病源候论》中首先提出了酒癖之名：“夫酒癖者，因大饮酒后，渴而引饮无度，酒与饮俱不散，停滞在于胁肋下，结聚成癖，时时而痛，因而即呼为酒癖，其状胁下弦急而痛”。不难看出，由“胁痛”演变发展成癥瘕积块的“酒癖”，进而形成“酒臌”的过程，与酒精性肝炎向肝硬化发展的过程是一致的。初期过量饮酒，酒毒湿热之邪蕴积中焦，伤及脾胃，如未得到重视或积极治疗，将发展为酒精性肝炎和酒精性肝纤维化。部分医家认为其主要病机为食滞胃肠，湿热互结，瘀血阻络[9] [10]。作者团队经多年临床实践发现酒精性肝损伤湿热蕴结证居多，湿热内蕴可导致气滞血瘀，多因素夹杂导致肝损伤迁延难愈，病久耗气伤津。因此，团队总结认为该病呈现“湿、热、毒、瘀、虚”的病机特点，湿热–气滞–浊毒是其核心病机。本阶段是阻断疾病的发展，防治肝硬发生的关键时期，应尽早给予通脏腑、泻湿热的治疗，防止其向痰瘀互结、痹阻肝络证型的发展。这与以“肝与大肠相通”理论为指导的通腑泻浊治法高度一致。
复方三黄饮是作者基于酒精性肝损伤“湿、热、毒、瘀、虚”的病机特点，以及湿热–气滞–浊毒核心病机研制而成，处方包含生大黄、赶黄草及炙黄芪三味药。《神农本草经》言大黄“主下淤血，血闭，寒热，破症瘕积聚，留饮，宿食，荡涤胃肠，推陈致新，通利水谷，调中化食，安和五脏”[11]，赶黄草为苗族传统药物，始载于明代《救荒本草》，其性温、味甘、无毒，具有清热解毒、活血散瘀、利水消肿、退黄、利胆平肝之功效[12]。两药合用通肠腑、逐瘀生新、保肝利胆。黄芪补中益气，《神农本草经》将其列为上品，味甘微温，主补虚；与大黄相用防其通腑过甚[13]。笔者前期临床研究显示该方可显著改善酒精性肝硬化患者的肠黏膜通透性及肝脏炎症指标[5]，但其多靶点作用机制尚未系统阐明。
本研究通过网络药理学方法探究SHY干预ALI的主要成分、作用靶点以及机制通路。基于“SHY成分–共同靶点”网络图的构建和分析，筛选出SHY干预ALI的效应成分包含槲皮素(Quercetin, QET)、乔松素(Pinocembrin, PCB)、没食子酸(Gallic Acid, GA)、大黄素(Emodin, EMO)、大黄酸(Rhein, RHE)、黄芪甲苷(Astragaloside IV, AIV)、芒柄花苷(Ononin, ONI)和芒柄花素(Onocerin, OCR)。主要与抑制细胞凋亡、抗炎、抗氧化如何改善肠道菌群相关[14]-[16]。
GO和KEGG富集分析结果显示，SHY可能通过抑制磷酸化、炎症应答、凋亡过程等途径参与改善酒精性肝损伤过程，可能存在的机制通路包括PI3K-Akt、JAK-STAT、NF-κB等。本研究表明，SHY能显著改善ALI模型小鼠循环内IL-11和ALT水平，同时抑制肝组织中IL-11和p-STAT3蛋白表达，提示该药对改善ALI药效明确，且可能通过调控IL-11R/JAK/STAT通路起作用。
5. 结语
综上所述，本研究采用网络药理学方法初步预测SHY防治ALI的主要活性成分和核心靶点，通过动物实验进一步探究SHY改善ALI的作用及机制。初步表明ALI通过下调IL-11R/JAK/STAT信号通路表达，抑制炎症因子表达，减轻肝细胞损伤，从而发挥抗肝损伤作用。SHY是基于“肝与大肠相通”理论指导下研制而成，临床及动物实验均证实其有效性，丰富了中医药防治酒精性肝损伤的理论基础，为进一步研究SHY干预ALI的作用机制提供了实验依据。
基金项目
成都中医药大学“杏林学者”学科人才科研提升计划项目：YYZX2022016；成都中医药大学校院联合创新基金：LH202402015；四川省中医药管理局专项资助项目：2024MS187。
NOTES
*通讯作者。