1. 引言
贝类外壳作为其适应外界环境的核心防护屏障，不仅能够有效抵御物理冲击、化学侵蚀及生物捕食等多重外界胁迫，其独特的形态结构与色泽表型更成为物种分类鉴定、生态适应性评估及经济性状筛选的重要指标[1]。壳色表型的形成是一个复杂的多通路协同调控过程，不仅依赖于特定色素组分的种类与含量，更与壳体生物矿化的完整进程深度耦合，涵盖无机相碳酸钙晶体的沉积模式、有机基质的精准调控，以及色素分子的合成、转运与靶向沉积等关键环节[2]。已有研究证实，贝类壳色的表型差异并非由单一色素分子主导，而是壳基质蛋白、糖类组分、能量代谢网络及信号通路调控等多因素共同作用的结果，形成了复杂的分子调控网络[3]。
菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)，简称蛤仔，作为我国沿海滩涂养殖产业中的支柱性经济贝类，在黄渤海、东海及南海沿岸均有广泛分布，具有生长速率快、适应能力强、养殖效益显著等优势。该物种外壳普遍呈现黑白相间、界限清晰的典型色泽特征，且同一壳体不同颜色区域的遗传背景一致，为解析贝类壳色形成的分子机制提供了理想的天然研究模型[4]。目前，学界针对蛤仔的研究多聚焦于生长性能调控、环境胁迫响应(如盐度、温度、重金属胁迫)及群体遗传多样性等领域，积累了较为丰富的基础数据，而针对同一壳体不同颜色区域的分子水平差异，尤其是蛋白层面的系统性比较研究仍较为匮乏，制约了对其壳色调控机制的深入解析[5]。
贝类壳体的化学组成以碳酸钙晶体为主，辅以少量有机基质(占比通常不足5%)，尽管有机基质含量较低，但其作为矿化过程的“分子模板”，在碳酸钙晶体的成核、生长取向调控、矿化速率调节以及色素分子的锚定与结合中发挥着不可替代的关键作用[6]。其中，壳基质蛋白、糖胺聚糖及糖蛋白等生物大分子可通过提供特异性结合位点，调控色素分子在壳体中的分布模式与富集程度，进而影响壳色表型[7]。此外，色素的合成与沉积过程高度依赖细胞代谢状态的调控，尤其是能量代谢通路的支撑：线粒体氧化磷酸化通路作为细胞能量代谢的核心，为壳基质蛋白的合成、转运及色素分子的沉积过程提供能量支撑；而mTOR信号通路则通过精准感知细胞能量状态与营养水平，对壳体形成相关基因的表达及蛋白合成过程进行动态调控[8] [9]。
随着高通量组学技术的飞速发展，定量蛋白质组学已成为解析贝类壳体形成及色素调控分子机制的核心技术手段。相较于转录组学仅能反映基因转录水平的差异，蛋白质组学可直接对应功能分子的表达丰度、修饰状态及相互作用关系，更贴合壳形成这一动态生理过程的研究需求，能够精准鉴定参与壳体结构构建、色素代谢及矿化调控的结构蛋白、功能酶类及代谢调控蛋白[10]。目前，在太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)、栉孔扇贝(Chlamys nobilis)、马氏珠母贝(Pinctada fucata)等贝类中，已有多种与壳体矿化、色素沉积及基质合成相关的功能蛋白被成功鉴定，为揭示贝类壳色形成的分子基础提供了重要参考[11] [12]。然而，针对同一贝类壳体不同颜色区域的蛋白组学系统比较研究仍较为有限，尚未明确调控同一壳体色泽分化的核心蛋白及分子通路，文蛤(Meretrix meretrix)中相关研究虽有涉及，但针对蛤仔的专项研究仍存在空白[13]。
因此，本研究以蛤仔同一壳体的黑色与白色区域为研究对象，采用DIA (Data independent acquisition)定量蛋白质组学技术，系统比较不同壳色区域的蛋白表达谱差异。通过GO和KEGG通路富集分析，重点聚焦氧化磷酸化、溶酶体代谢、细胞外基质相互作用及糖胺聚糖生物合成等与壳体矿化及色素沉积密切相关的代谢通路，旨在阐明蛤仔壳色表型差异的核心分子调控机制，筛选调控壳色形成的关键功能蛋白。本研究结果不仅能够丰富贝类壳色形成分子机制的理论体系，深化对贝类矿化与色素代谢协同调控机制的理解，同时也可为蛤仔优良壳色性状的定向分子育种、养殖品系改良及种质资源创新提供重要的理论支撑与技术参考[14]。
2. 材料与方法
2.1. 样品采集与处理
实验用蛤仔采自辽宁省葫芦岛市兴城海区，健康状况良好，平均壳长为3.0 ± 0.5 cm，选取200枚蛤仔，放置于50 L容积的平底养殖槽中，20℃充氧海水中暂养两周，待蛤仔适应环境、生理状态稳定后，适应养殖环境后开始实验。暂养期间每12 h更换一次海水，并投喂小球藻饵料。实验所用海水来自大连市黑石礁海区，海水盐度为31 ± 1.0，pH值为8.15 ± 0.10，温度为18℃ ± 0.5℃，经沉淀、砂滤后贮存备用。
挑选5只健康的蛤仔记做组织解剖取样，用解剖工具解剖，取黑壳(B)与白壳(W)对应区域外套膜组织(图1)，利用液氮对样本进行速冻，随后储存于−80℃超低温冰箱，用于样品制备。
Figure 1. Sampling diagram
图1. 取样示意图
2.2. 样品制备
2.2.1. 蛋白质提取
取蛤仔壳体黑色、白色区域外套膜组织样品各50~100 mg，迅速置于预冷的研钵中，加入适量液氮充分研磨至均匀粉末状，期间持续补充液氮以维持低温环境，防止蛋白质降解。将研磨后的样品粉末快速转移至1.5 mL无菌EP管中，按照料液比1:5~1:10 (m/v)加入预冷的SDT裂解液(含4% SDS、100 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L DTT，pH 7.6)，涡旋振荡30 s使样品与裂解液充分混匀。
将EP管置于沸水浴锅中，恒温沸水浴3 min，使蛋白质充分变性并终止内源性蛋白酶活性，取出后立即置于冰浴中冷却至室温。随后采用超声波破碎仪进行超声处理，设定参数为：功率200~300 W，脉冲模式(超声3 s，间隔5 s)，全程冰浴条件下超声2 min，进一步破碎细胞结构，促进蛋白质充分释放，避免超声产热导致蛋白质变性。
超声处理后，将EP管放入高速冷冻离心机，于4℃、16,000 g条件下离心20 min，离心前确保样品管平衡以避免离心失衡。离心结束后，用无菌枪头缓慢吸取上清液至新的预冷EP管中，避免吸入底部沉淀(细胞碎片、杂质及未裂解组织)；若上清液仍存在浑浊，可重复离心一次以提高样品纯度。
采用BCA蛋白定量试剂盒测定上清液中蛋白质浓度，以牛血清白蛋白(BSA)为标准品绘制标准曲线，根据标准曲线计算各样品的蛋白质浓度，确保蛋白质浓度满足后续实验需求(一般控制在1~5 μg/μL)。取适量蛋白样品，加入5×上样缓冲液，沸水浴5 min进行变性处理，通过12% SDS-PAGE凝胶电泳验证蛋白质提取完整性及纯度，电泳结束后经考马斯亮蓝R-250染色、脱色，观察蛋白条带清晰度与分布情况，合格样品置于−80℃冰箱中保存备用，用于后续定量蛋白质组学分析。
2.2.2. 蛋白质酶解
每例样品取适量蛋白分别进行FASP酶解，步骤如下：每例样品中分别加DTT至100 mM，沸水浴5 min，冷却至室温。加入200 µL UA buffer (8M Urea, 150 mM Tris-HCl, pH 8.0)混匀，转入10 KD超滤离心管，离心12,000 g 15 min。加入200 µL UA buffer离心12,000 g 15 min，弃滤液。加入100 µL IAA (50 mM IAA in UA)，600 rpm振荡1 min，避光室温30 min，离心12,000 g 10 min。加入100 µL UA buffer，离心12,000 g 10 min重复2次。加入100 µL NH4HCO3 buffer，离心14,000 g 10 min重复2次。加入40 µL Trypsin buffer (6 µg Trypsin in 40 µL NH4HCO3 buffer)，600 rpm振荡1 min，37℃ 16~18 h。换新收集管，离心12,000 g 10 min，收集滤液，酶解后的肽段使用C18 Cartridge脱盐，真空冻干。脱盐后的肽段干燥后用0.1% FA复溶，并对肽段浓度进行测定，以备LC-MS分析。
2.3. DIA质谱数据分析
2.3.1. DIA质谱数据采集
每例样品取适量肽段，使用Vanquish Neo UHPLC system，operated Neo UHPLC色谱系统(Thermo Scientific)进行色谱分离。缓冲液：A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为80%)。色谱柱以96%的A液平衡。样品首先进入捕集柱(Trap Column, PepMap Neo 5 µm C18, 300 µm × 5 mm, Thermo Scientific)进行脱盐与富集，随后转移到分析柱(μPACTM Neo High-Throughput色谱柱，Thermo Scientific)进行梯度分离。液相梯度设置如下：0 min~0.1 min，B液线性梯度从4%~6%；0.1 min~1.2 min，B液线性梯度从6%~12%；1.2 min~3 min，B液线性梯度从12%~22.5%；3 min~5 min，B液线性梯度从22.5%~45%；5 min~5.2 min，B液线性梯度从45%~99%；5.2 min~6 min，B液维持在99%。肽段分离后用Orbitrap Astral质谱仪(Thermo Scientific)进行DIA (数据非依赖采集)质谱分析[15]。分析时长为6 min，电喷雾电压2.2 kV，检测模式：正离子，母离子扫描范围：380~980 m/z，一级质谱分辨率：240,000，AGC target：500%，一级Maximum IT：3 ms。二级质谱分辨率：80,000，AGC target：500%，二级Maximum IT：3 ms，RF-lens：40%，MS2 Activation Type：HCD，Isolation window：2 Th，Normalized collision energy：25%，cycle time：0.6 [15] [16]。
2.3.2. DIA质谱数据检索
通过软件DIA-NN合并所有质谱数据，完成DIA质谱数据的数据库检索及蛋白DIA定量分析[17]。数据库为NCBI-Ruditapes philippinarum [129788]-78947-251118.fasta，来源于网址
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/129788 [18]。
2.4. 数据分析及生物信息学分析
2.4.1. 蛋白质筛选
为了保证后续生信与统计学分析的有效性、准确性，根据通用的原则，我们首先筛选样本实验数据，确保鉴定的蛋白对应的样品组别中至少保留50%以上无空值数据，然后对剩余的空值进行数据填充，然后进行统计分析，其中符合表达差异倍数大于1.5倍(上下调)且P-value小于0.05筛选标准的蛋白质视为显著性差异表达蛋白质。
2.4.2. 质量控制与主成分分析(PCA)
为保障质谱数据及后续分析结果的可靠性，采用统计学方法对数据进行系统性质量控制(QC)，核心流程如下：实验通过高质量精度、高分辨率质谱仪采集数据，控制肽段质量误差阈值为±10 ppm；采集完成后用Proteome Discoverer软件搜库，设定Peptide FDR ≤ 0.01、Protein FDR ≤ 0.01以过滤假阳性结果，确保定量准确性[19]。
同时统计鉴定肽段数、蛋白质数及肽段覆盖率。稳定性评估采用双重方式：计算样本间蛋白质表达量相关系数及相对标准偏差(RSD)分析重现性，同时通过主成分分析(PCA)进一步验证，利用R软件对质控后数据进行PCA降维。经上述流程筛选后的高质量数据，用于后续蛋白质表达差异及通路富集分析。
2.4.3. 差异蛋白筛选
蛋白质显著性差异分析以P值(P.value)结合差异倍数(FC, Fold Change)作为筛选标准。设定筛选阈值为P.value < 0.05，且FC ≥ 1.5或FC ≤ 1/1.5，据此筛选获得显著差异蛋白[20]。
2.4.4. 富集分析
筛选获得的显著差异蛋白，采用R软件进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，探究差异蛋白的生物学功能及参与的核心代谢通路。
GO功能富集分析将差异蛋白归类至分子功能(MF)、细胞组分(CC)及生物过程(BP)三个维度，采用FDR校正法控制假阳性，设定FDR < 0.05为阈值，筛选具有统计学意义的显著富集GO条目[21]。
KEGG通路富集分析以物种特异性数据库为参考，定位差异蛋白参与的信号通路及代谢途径，同样采用FDR校正，以FDR < 0.05为标准，筛选显著富集的通路，结合通路功能注释，挖掘与蛤仔壳色形成相关的核心通路[22]。
3. 结果
3.1. 蛋白质鉴定结果
DIA蛋白质定性定量结果数据统计，将项目中每个样品独立进行样品制备，蛋白质酶解后分别上机进行DIA质谱检测。所得的DIA原始质谱文件，导入DIA-NN进行DIA分析，使用Qvalue ≤ 0.01为筛选参数，本次实验最终得到的蛋白和肽段统计信息见表1。
Table 1. DIA protein identification results summary
表1. DIA蛋白质鉴定结果统计
样品组别 |
样品名 |
蛋白组数目 |
唯一性肽段 |
B |
B1 |
8067 |
45,656 |
B2 |
8289 |
46,366 |
B3 |
8508 |
48,723 |
B4 |
8094 |
45,700 |
B5 |
8258 |
46,929 |
B-Total |
9564 |
58,345 |
W |
W1 |
8698 |
48,283 |
W2 |
8744 |
49,806 |
W3 |
8635 |
48,909 |
W4 |
8665 |
49,525 |
W5 |
8568 |
47,612 |
W-Total |
9726 |
59,291 |
Total |
9876 |
60,677 |
3.2. 蛋白质组数据质量
为评估蛋白质组数据的整体质量及鉴定特征，本研究对肽段长度分布、蛋白对应的unique肽段数量、蛋白分子量与等电点分布及蛋白覆盖度进行了统计分析(图2(a)~(d))，结果显示所获数据质量优良，可满足后续分析需求。其中，肽段长度分布结果表明，大多数鉴定肽段长度集中在8~16个氨基酸之间，峰值位于10~12个氨基酸(图2(a))，符合胰蛋白酶酶切及LC-MS/MS分析的典型肽段长度特征，提示酶切效率良好且质谱检测稳定，而较长肽段(>20 aa)数量较少，进一步印证了样品处理与数据采集过程的可靠性；蛋白分子量与等电点统计结果显示，鉴定蛋白分子量主要集中在10~100 kDa范围内，等电点以pI 5~9区间为主且分布广泛(图2(b))，蛋白对应的unique肽段数量分布显示，大部分蛋白由1~3条unique肽段支持鉴定，且2条及以上unique肽段鉴定的蛋白占比较高(图2(c))，既表明蛋白鉴定结果可信度高，也反映样品中同时存在高丰度与一定数量的低丰度蛋白，为后续差异蛋白分析奠定了良好基础；符合贝类组织蛋白质的一般理化特征，说明鉴定蛋白覆盖多种理化性质与功能类型，无明显偏向性；蛋白覆盖度分析则显示，约38%的蛋白覆盖度处于10%~30%区间，11%的蛋白覆盖度达30%~50%，另有少量蛋白覆盖度超过50% (图2(d))，虽部分蛋白覆盖度偏低，但整体分布合理，契合复杂生物样品蛋白质组分析的常见特征，体现了数据良好的深度与可靠性。
Figure 2. Quality assessment and identification feature distribution of proteomic data (a) Peptide length distribution; (b) Protein molecular weight versus isoelectric point distribution; (c) Unique peptide count distribution; (d) Protein coverage distribution
图2. 蛋白质组学数据质量评估与鉴定特征分布分析(a) 肽段长度分布图；(b) 蛋白分子量与等电点分布图；(c) unique肽段数量分布图；(d) 蛋白覆盖度分布图
基于蛋白质表达谱数据的主成分分析(PCA)结果如图3所示，清晰揭示了B组与W组样本间的整体蛋白质表达差异及组内重复性特征。第一主成分(PC1)可解释26.10%的总变异，是区分两组样本的核心维度；第二主成分(PC2)解释了14.26%的总变异，主要反映组内样本的离散程度。从PCA二维得分图的空间分布特征来看，两组样本呈现显著的组间分离与良好的组内聚集特性：B组样本(蓝色)集中分布于PC1轴负值区域，W组样本(红色)则聚集于PC1轴正值区域，两组置信椭圆在PC1方向上无重叠，表明B组与W组在蛋白质表达谱上存在明确的系统性差异；而各组内样本在二维空间中聚集度较高，其中B组样本分布更为紧凑，提示组内生物学重复一致性优良，实验数据稳定性可靠。
3.3. 差异表达蛋白质分析
蛤仔黑壳区域(B组)与白壳区域(W组)对应的外套膜组织蛋白质组数据进行差异表达分析，结合火山图可视化呈现(图4)，共筛选获得1500个显著差异表达蛋白。从火山图可见，差异蛋白沿表达倍数轴呈明显不对称分布，其中383个为显著上调蛋白(红色散点)，此类蛋白在黑壳区域对应外套膜组织中的表达水平显著高于白壳区域；1117个为显著下调蛋白(蓝色散点)，对应蛋白在黑壳区域外套膜组织中的表达水平显著低于白壳区域。量化分析显示，显著下调蛋白数量约为上调蛋白的2.9倍，提示同一蛤仔不同壳色区域外套膜组织的蛋白表达调控网络中，蛋白表达抑制现象较表达激活现象更为普遍，这一表达差异特征可能是驱动其壳体黑白区域色泽分化的重要分子基础。
Figure 3. Principal component analysis (PCA) reveals global protein expression differences and intra-group reproducibility between mantle samples of black shell (B) and white shell (W)
图3. 主成分分析(PCA)揭示黑壳(B)与白壳(W)外套膜样本间整体蛋白质表达差异及组内重复性特征
Figure 4. Volcano plot of differentially expressed proteins between the B and W groups. Compared with the white shell (W), 1117 proteins were significantly downregulated (blue) and 383 proteins were significantly upregulated (red) in the black shell (B) samples, while 7642 proteins showed no significant change (gray)
图4. B vs. W比较组差异表达蛋白火山图。图中显示，与白壳(W)相比，黑壳(B)样本中1117个蛋白显著下调(蓝色)，383个蛋白显著上调(红色)，另有7642个蛋白未发生显著变化(灰色)
3.4. 功能富集分析
3.4.1. GO功能富集分析
蛤仔同一壳体黑壳区域(B组)与白壳区域(W组)外套膜组织的显著差异蛋白进行GO功能富集分析，结果显示两组在生物过程、分子功能及细胞组分三大维度均存在明显功能分化，差异蛋白功能覆盖广泛，为解析壳色分化的分子机制提供了重要线索(图5)。在生物过程(Biological Process, BP)层面，差异蛋白主要富集于代谢过程(metabolic process)、细胞过程(cellular process)、定位过程(localization)及发育过程(developmental process)等核心生理活动，同时在运动过程(locomotion)、多细胞个体过程(multicellular organismal process)、稳态过程(homeostatic process)中也有显著富集，且涉及生物过程的正向与负向调控(positive/negative regulation of biological process)、对刺激的响应(response to stimulus)、解毒过程(detoxification)及免疫系统过程(immune system process)等调控与防御相关条目，提示壳色差异的形成可能与外套膜组织的代谢调控、环境响应及生理稳态维持密切相关。在分子功能(Molecular Function, MF)层面，差异蛋白以结合活性(binding activity)和催化活性(catalytic activity)为核心富集类型，同时涵盖转运蛋白活性(transporter activity)、ATP依赖性活性(ATP-dependent activity)、电子传递活性(electron transfer activity)及抗氧化活性(antioxidant activity)等能量代谢与物质转运相关活性，此外还涉及细胞骨架马达活性(cytoskeletal motor activity)、分子伴侣蛋白折叠活性(protein folding chaperone activity)，以及转录调控活性(transcription regulator activity)、翻译调控活性(translation regulator activity)，表明差异蛋白通过多样的分子功能参与壳色形成相关的物质合成、能量供给及基因表达调控。在细胞组分(Cellular Component, CC)层面，差异蛋白主要定位于细胞结构实体(cellular anatomical entity)及蛋白质复合体(protein-containing complex)，提示这些差异蛋白多通过形成功能复合体或作用于特定细胞结构，发挥其参与壳色调控的生物学功能。总体而言，GO富集结果表明，黑白壳区域差异蛋白在细胞功能执行、代谢活动调控及结构组成等方面呈现广泛的功能分布特征，其功能多样性可能是驱动蛤仔壳体黑白区域色泽分化的重要分子基础。
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Figure 5. GO annotation enrichment map of differentially expressed genes
图5. 差异表达蛋白质GO注释富集图
3.4.2. KEGG功能富集分析
蛤仔外套膜组织的显著差异蛋白进行KEGG通路富集分析，结果显示差异蛋白广泛参与多个代谢通路、信号通路及生理过程，为揭示壳色分化的分子调控网络提供了关键依据(图6)。其中，能量代谢与物质转运降解相关通路尤为突出，包括氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)、嘌呤代谢(Purine metabolism)、谷胱甘肽代谢(Glutathione metabolism)、糖胺聚糖降解(Glycosaminoglycan degradation)及其他聚糖降解(Other glycan degradation)，提示能量供给效率与物质代谢差异可能是驱动壳色分化的重要因素；细胞转运与加工相关通路涵盖囊泡运输中SNARE相互作用(SNARE interactions in vesicular transport)、内吞作用(Endocytosis)、吞噬体(Phagosome)、溶酶体(Lysosome)及内质网蛋白加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)，反映两组外套膜组织在蛋白转运、降解及加工修饰方面存在显著差异，可能影响壳基质蛋白的合成与沉积。信号调控及合成相关通路包括mTOR信号通路(mTOR signaling pathway)、细胞外基质受体相互作用(ECM-receptor interaction)、糖胺聚糖生物合成–硫酸软骨素/硫酸皮肤素(Glycosaminoglycan biosynthesis - chondroitin sulfate/dermatan sulfate)、鞘糖脂生物合成–神经节苷脂系列(Glycosphingolipid biosynthesis - ganglio series)，这些通路直接参与壳形成相关的信号传导与生物大分子合成，可能通过调控壳基质组成影响壳色表型。此外，差异蛋白还富集于核糖体(Ribosome)、剪接体(Spliceosome)、泛素介导的蛋白水解(Ubiquitin mediated proteolysis)、mRNA监视通路(mRNA surveillance pathway)等基因表达与蛋白调控通路，以及药物代谢–细胞色素P450 (Drug metabolism - cytochrome P450)、药物代谢–其他酶(Drug metabolism - other enzymes)等解毒代谢通路，表明壳色差异的形成是多通路协同调控的结果，涉及能量供给、物质合成、信号传导及代谢调控等多个层面的复杂相互作用。
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Figure 6. KEGG annotation enrichment map of differentially expressed genes
图6. 差异表达蛋白质KEGG注释富集图
4. 讨论
4.1. 溶酶体通路关键差异蛋白对蛤仔壳色形成的调控
溶酶体(Lysosome)通路中显著富集的关键差异蛋白主要为CTSL (组织蛋白酶L，cathepsin L)与CTSS (组织蛋白酶S，cathepsin S)，二者均隶属于半胱氨酸蛋白酶家族(Cathepsins)蛋白。这类蛋白在细胞内蛋白降解、基质更新及膜性结构重塑过程中发挥核心调控作用[23] [24]。溶酶体系统不仅参与细胞内物质的降解与循环再利用，其功能状态还与贝类壳基质的代谢平衡密切相关，而壳基质蛋白的动态调控正是壳色形成的重要环节[25]。在本研究蛋白质组学分析中，黑壳区域相较于白壳区域，CTSL蛋白显著下调(表达倍数FC = −4.20)，CTSS蛋白亦呈现一定程度下调(FC = −1.51)，提示两组外套膜组织中溶酶体通路活性整体减弱。结合生物矿化速率差异推测，溶酶体通路活性减弱可能导致壳基质蛋白的降解速率降低，进而影响壳体矿化进程：白壳区域外套膜组织中溶酶体通路活性相对较高，壳基质蛋白更新周转加快，支撑壳体快速矿化，快速形成的壳体无机相结构可能掩盖了色素分子，使得白壳表型得以呈现；而黑壳区域溶酶体通路活性受抑，壳基质蛋白降解减缓，导致壳体矿化速率下降，矿化过程中色素分子未被快速形成的壳体结构掩盖，得以在壳体中稳定沉积，进而通过影响壳体结构完整性及色素显现效率，参与壳色表型分化。
已有研究证实，CTSL蛋白在多种生物的生物矿化过程中具有重要作用。例如，在马氏珠母贝(P. fucata)中，CTSL蛋白的高表达水平与壳体外层有机基质的重塑及碳酸钙晶体生长密切相关[26]，其酶活性的动态调控可直接影响矿化过程中壳基质蛋白的加工修饰与更新周转。类似地，CTSS蛋白也被证实参与贝类壳体形成过程中有机基质的降解及重构，是壳基质代谢网络的关键功能蛋白[27]。据此推测，蛤仔壳色形成过程中，溶酶体通路相关Cathepsin家族蛋白(CTSL, CTSS)的表达下调，可能导致壳基质蛋白更新周转减缓，进而影响色素结合位点的形成效率或有机相结构的透明度，最终造成黑白壳区域的色泽差异。
此外，CTSL蛋白与能量代谢通路存在潜在调控关联。研究发现，CTSL蛋白的表达及酶活性在氧化应激条件下易受线粒体代谢状态的调控[28]，而在贝类中，线粒体介导的能量代谢过程与壳体矿化及壳基质合成密切相关，可为蛋白合成、色素沉积提供能量支撑[29]。因此，本研究中CTSL蛋白的显著下调，不仅反映了壳基质降解通路的功能抑制，还可能与能量代谢水平的改变协同作用，共同影响壳色形成的动态平衡过程。
4.2. SNARE通路核心差异蛋白对蛤仔壳色形成的调控
SNARE (可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体，soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)通路中多种核心蛋白均呈现显著下调趋势，包括Syntaxin蛋白(K08513，表达倍数FC = −4.10)、SNAP-25类蛋白(K08490, FC = −2.24)及VAMP蛋白(K08495, FC = −1.85)。这些蛋白分别对应Qa-SNARE、Qb/Qc-SNARE与R-SNARE家族成员，是介导细胞内囊泡与靶膜融合的核心功能元件[30] [31]。它们在囊泡运输与膜融合过程中，通过组装形成四螺旋复合体实现膜间距缩短及脂质双层融合，这一过程是维持细胞分泌功能及胞外基质转运的关键环节，直接影响生物大分子的靶向运输效率 [32]。因此，SNARE通路核心蛋白的系统性下调，提示蛤仔黑白壳区域外套膜组织间的囊泡运输与蛋白分泌活动可能受到显著抑制。
在贝类壳体形成过程中，囊泡介导的分泌系统承担着核心转运功能，负责将壳基质蛋白、糖类物质及色素分子精准运输至壳形成前缘的外套膜外侧，为壳体矿化及色素沉积提供物质基础[25]。已有研究证实，外套膜细胞可通过高效的SNARE复合体介导分泌过程，调控壳基质的沉积模式及有机和无机相界面结构的构建[27]。结合矿化速率差异分析，白壳区域SNARE通路活性相对较高，囊泡运输与蛋白分泌效率较强，可快速转运壳基质组分至矿化位点，支撑壳体快速矿化，快速形成的无机矿化结构可掩盖色素分子，呈现白壳表型；而黑壳区域SNARE通路功能受抑，色素分子及壳基质组分的胞外排泌效率显著下降，导致壳体矿化速率减慢，色素分子无需被快速矿化的壳体结构掩盖，得以在壳体中正常显现，进而驱动壳色表型差异的形成[33]。尤其是Syntaxin蛋白的显著下调(FC = −4.10)，意味着Qa-SNARE介导的膜融合过程受到强烈抑制，可能造成色素囊泡在细胞内滞留或外排延迟、矿化速率进一步降低，同时可能造成色素囊泡在细胞内短暂滞留后缓慢释放，使色素分子能够稳定沉积于矿化较慢的壳体结构中，直接影响黑色素等关键色素的沉积位置与浓度分布，最终参与黑白壳色的分化调控。
SNARE蛋白复合体的功能发挥与能量代谢、膜系统状态密切相关。研究表明，SNARE蛋白复合体的组装与解离过程依赖ATP能量供给及Ca2+信号通路调控，其活性状态受细胞能量代谢水平的直接影响[34]。而在贝类中，壳体形成过程伴随高度活跃的能量代谢活动，线粒体氧化磷酸化通路与膜运输过程存在紧密的耦合关系，可为囊泡运输、蛋白分泌提供充足能量[29]。因此，本研究中观察到的SNARE通路核心蛋白系统性下调，可能与能量代谢水平降低及溶酶体通路受抑形成协同作用，共同反映出黑壳区域外套膜细胞分泌功能与物质转运活性的整体减弱，这一变化或许是蛤仔黑白壳区域在代谢活动与壳基质沉积方面呈现差异的重要分子基础。
4.3. Spliceosome通路差异蛋白对蛤仔壳色形成的转录后调控作用
剪接体(Spliceosome)通路中富集的差异蛋白几乎全部呈现下调趋势，且这些蛋白主要集中于剪接体的核心结构及催化模块，包括SF3B/U2复合体(K11097，表达倍数FC = −2.51)、PRPF/SF蛋白(K12858, FC = −2.80)、SF3A复合体(K12870, FC = −1.60)等。上述蛋白均为剪接体装配、剪接位点识别及催化反应的关键功能因子，共同构成mRNA前体剪接的核心分子基础，直接调控转录后RNA加工的效率与精度 [35] [36]。因此，这类蛋白的系统性下调，提示蛤仔黑、白壳区域外套膜组织在转录后RNA加工及成熟水平上存在稳定的功能性差异，该差异或为壳色表型分化过程中的伴随现象。
真核生物的mRNA剪接是基因表达转录后调控的核心环节，剪接体通过精准识别内含子边界序列，完成内含子去除与外显子拼接，最终生成具有功能活性的成熟mRNA，为后续蛋白翻译提供模板[37]。这一动态过程中，U1、U2、U4/U6、U5等小核核糖核蛋白复合体(snRNPs)及其关联蛋白共同组装形成剪接体功能系统[38]。其中，SF3B复合体(由SF3B1-6蛋白组成)作为U2 snRNP的核心组分，可特异性识别RNA分支点序列，对剪接位点的精确定位至关重要，直接影响mRNA剪接的准确性[39]。本研究中SF3B复合体的下调，可能导致mRNA剪接精度降低，引发错剪或可变剪接事件增多，进而改变关键壳基质蛋白的翻译产物丰度或结构，间接参与壳色表型分化。
已有研究表明，剪接调控机制与贝类壳形成过程密切相关。在太平洋牡蛎(C. gigas)与马氏珠母贝(P. fucata)中，其转录组研究发现剪接体组分在外套膜与壳形成区显著富集，提示外套膜细胞可通过活跃的RNA剪接机制，为壳形成所需的大量功能蛋白合成提供保障[25] [27]。结合本研究结果推测，蛤仔黑白壳区域Spliceosome通路核心蛋白的系统性下调，可能导致外套膜细胞的mRNA剪接效率下降，进而降低下游与壳基质形成、色素沉积相关蛋白的翻译效率，最终驱动壳色差异的形成。
此外，剪接体蛋白的活性状态与细胞能量代谢、信号转导通路存在紧密调控关联。已有研究证实，mTOR信号通路及氧化磷酸化通路的活性变化，可通过调节SF3B1、PRPF等剪接体核心蛋白的磷酸化水平，影响剪接体的组装效率与功能发挥[40] [41]。结合本研究中能量代谢通路相关蛋白的同步下调，推测蛤仔不同壳色区域可能存在“能量代谢、剪接体功能、蛋白翻译”的协同调控模式：能量代谢水平受限使得剪接体复合体装配效率下降导致功能性mRNA生成不足进而对壳色相关功能蛋白合成产生抑制效应，最终在蛋白质组水平上驱动黑白壳区域的表型分化。
Spliceosome通路核心蛋白的系统性下调提示，蛤仔壳色表型的形成不仅受代谢活动与色素沉积的直接调控，还受到转录后RNA加工能力差异的深层影响。该结果从RNA加工调控视角，为解析贝类壳色形成的复杂分子网络提供了新的研究方向，也进一步印证了壳色分化是多通路、多层面协同调控的结果。
5. 结论
本研究通过对蛤仔黑白壳区域外套膜组织的DIA蛋白质组学分析，发现1500个显著差异表达蛋白，其中下调蛋白数量远超上调蛋白，表明蛋白表达抑制是壳色分化的主导趋势。差异蛋白主要富集于溶酶体、SNARE和剪接体三条通路，它们分别通过影响基质蛋白降解、色素分泌和RNA剪接来调控壳色形成。本研究揭示了剪接体通路在贝类壳色形成中的重要作用，并完善了其与能量代谢的耦合调控网络，为蛤仔壳色育种提供了重要靶点和理论依据。
基金项目
山东省重点研发计划(农业良种工程) (2023LZGCQY001)；国家贝类产业技术体系专项(CARS-49)；辽宁省科技重大专项(种质创新工程) (2024JH1/11700010)；辽宁省渔业补贴专项(2024, 2025)；辽宁省科技厅，辽宁省科技计划联合计划(技术攻关计划项目) (2024JH2/102600078)。