1. 引言
艾草为菊科蒿属多年生草本植物，是我国广泛分布的一种药食同源性资源[1]，《中华本草》明确记载其具有温经散寒、祛湿抑菌的效果[2]。艾草精油作为艾草的核心活性成分，在国际上被誉为“植物软黄金”，通过气相色谱–质谱法分析，可知其含有樟脑、松油醇、侧柏酮等多种活性物质[3]。艾草经济易得、富含抗氧化性物质[4]，其精油也被视为兼具抗氧化与抗菌活性的天然活性物质[5] [6]，在天然抗氧化剂、天然抗菌剂领域极具应用潜力。
大肠杆菌(Escherichia coli)是一种广泛分布于自然界的革兰氏阴性菌，既是人体肠道内的正常菌群，又是食品感染和临床感染的常见致病菌，其致病性菌株易引发食品腐败变质及人类肠道炎症、尿路感染等病症[7]，对食品工业发展及公共卫生安全构成严重威胁。目前防控大肠杆菌的主要手段仍旧是化学合成抑菌剂，但长期使用化学类抑菌剂易导致细菌耐药性增强、药物残留超标及污染环境等系列问题。因此，在食品工业及公共卫生安全领域，亟需开发高效、安全的天然抑菌剂。艾草精油的天然抑菌特性恰好契合这一需求。
基于此，本研究以艾草精油为研究对象，大肠杆菌为供试菌，利用琼脂扩散法通过体外抑菌实验明确艾草精油对大肠杆菌的抑制效果，又通过趋化实验和生物膜形成能力测定等实验手段进一步探究艾草精油对大肠杆菌的抑菌作用机制，以期为艾草精油在天然抑菌剂领域的产业化开发提供理论支撑。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
供试细菌：大肠杆菌。
供试培养基：LB培养基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠10 g、琼脂12 g、1000 mL水，灭菌。
试剂及材料：艾草精油、无水乙醇、无菌生理盐水、结晶紫染色液、PI荧光探针、NPN荧光探针、PBS缓冲液、HEPES缓冲液。
2.2. 艾草精油抑菌活性的评估
参考文献[8]中的方法，将保藏的大肠杆菌菌株接种至LB液体培养基中，置于37℃、180 r/min的恒温摇床中振荡培养12~16 h，活化至对数生长期。将艾草精油配制成20、40、80 μg/mL。取上述各浓度样品溶液，分别取100 μL均匀涂布于LB固体培养基表面，以LB作为对照，每个处理设置3个重复实验。涂布完成后将平板置于超净工作台内通风干燥。待平板干燥后，取对数生长期的大肠杆菌菌液100 μL，均匀涂布于已干燥的样品平板表面。待培养基完全吸收菌液后，将平板倒置，置于37℃的恒温培养箱中培养24 h。培养结束后，观察并记录各个平板上大肠杆菌的生长情况，评估不同浓度艾草精油对大肠杆菌的抑菌活性。
2.3. 艾草精油抑菌机制的探究
2.3.1. 大肠杆菌趋化运动能力的测定
参考文献[9]的方法进行趋化实验：空白对照组(LB组)、溶剂对照组(无水乙醇组)、艾草精油处理组(20, 40, 80 μg/mL)，每组设置3个重复实验。大肠杆菌振荡培养至对数生长期后收集菌体，用无菌生理盐水重悬沉淀，调整菌液浓度至1 × 108 CFU/mL，分装至5个无菌离心管中(各10 mL)。取5支内径0.5 mm的无菌毛细管分别吸满不同浓度的艾草精油，以LB和无水乙醇作为对照，垂直插入对应组菌悬液中37℃孵育60 min。孵育结束后取出毛细管，将管内液体洗脱至1 mL无菌生理盐水中，涡旋混匀后按10−1~10−3梯度稀释，取100 μL稀释液涂布于LB固体培养基，37℃培养24 h后选取各组最适稀释梯度对应平板进行菌落计数，计算每毫升菌悬液中的菌落数(×106 CFU/mL)并记录。
2.3.2. 大肠杆菌生物膜形成能力的测定
参照文献[10] [11]的方法设置实验：空白对照组(LB组)和艾草精油处理组(20, 40, 80 μg/mL)。96孔细胞培养板中每孔加入100 μL大肠杆菌悬液，然后对照组加入100 μL LB培养基，处理组加入100 μL对应浓度的艾草精油，确保每孔总体积为200 μL，封膜后置于37℃恒温培养箱中静置培养24 h。培养结束后弃去培养液，用pH7.4的PBS缓冲液轻轻洗涤每孔3次，每孔加入100 μL 0.1%结晶紫染色液于室温静置染色30 min。染色结束后弃去染色液，用无菌蒸馏水洗涤3次至无多余染色液，倒置晾干后每孔加入100 μL无水乙醇，室温静置脱色15 min。待结晶紫完全溶解后，用酶标仪在590 nm波长下测定各孔吸光值。
2.3.3. 大肠杆菌内、外膜通透性的测定
内膜通透性通常利用PI荧光探针来测定。PI属于核酸嵌入染料，能够插入DNA碱基对并激发出红色荧光。PI荧光探针带正电且分子较大，无法直接穿越完整的磷脂双分子层，只有在膜屏障破损时才能进入胞内与DNA结合，故荧光强度能够直接反映内膜完整性[12]。外膜通透性通常采用1-N苯基萘胺(n-pheny1-1-naphthylamine, NPN)荧光探针来测定。NPN荧光探针是疏水荧光探针，作为革兰氏阴性菌的大肠杆菌外膜被破坏的时候，NPN能够嵌入多糖和磷脂的疏水区并发出荧光，荧光强度能够精准反应外膜通透性变化[13]。参照文献[10] [11]的方法将过夜培养的大肠杆菌用HEPES缓冲液洗涤菌体2次，再用PBS调整菌液至OD600 = 1.0。每组取1 mL菌悬液加入无菌离心管，加入不同浓度的艾草精油，涡旋混匀后37℃、150 r/min振荡孵育1 h，每组设置3个重复实验。孵育结束后，向离心管内加入终浓度为10 μmol/L的PI或NPN探针。将反应液转移到96孔酶标板中，每孔200 μL，使用多功能酶标仪测量样品在激发波长535 nm和发射波长615 nm处的荧光强度。
3. 结果与分析
3.1. 艾草精油对大肠杆菌的抑菌效果
实验结果(图1)显示CK (无水乙醇)组大肠杆菌生长旺盛，无抑菌现象，表明无水乙醇对大肠杆菌没有抑菌作用，排除溶剂对实验结果的干扰。20 μg/mL艾草精油处理后有少量大肠杆菌生长，当艾草精油浓度提高到40和80 μg/mL时没有大肠杆菌生长，表明艾草精油对大肠杆菌有显著的体外抑菌活性，且呈现浓度依赖性差异。
Figure 1. Experimental results of the agar diffusion method
图1. 琼脂扩散法实验结果
3.2. 艾草精油对大肠杆菌的趋避作用
如图2所示，空白对照组(LB组)与溶剂对照组(无水乙醇组)菌落数无显著差异(P > 0.05)，说明溶剂对大肠杆菌趋化能力没有影响，排除溶剂对实验结果的干扰。与对照组相比，各浓度艾草精油处理组菌落数均显著降低，且随浓度升高，菌落数减少，即抑菌效果增强，呈现明显的浓度依赖性抑制效应。综上表明艾草精油对大肠杆菌具有显著的趋避效应，削弱其向营养物质迁移及宿主体内定植的能力。
Figure 2. Chemotaxis effects of different concentrations of A. argyi essential oil on E. coli
图2. 不同浓度艾草精油趋化实验结果
3.3. 艾草精油对大肠杆菌生物膜形成的影响
如图3所示，空白对照组(LB组)的生物膜OD590值最高，表明大肠杆菌在体外培养条件下有较强的生物膜形成能力。经不同浓度艾草精油处理后的大肠杆菌生物膜OD590值呈显著的浓度依赖性下降，表明艾草精油对大肠杆菌的生物膜形成有较强的抑制作用，能够削弱大肠杆菌的生物膜屏障。
Figure 3. Effects of different concentrations of A. argyi essential oil on biofilm formation of E. coli
图3. 不同浓度艾草精油对大肠杆菌生物膜形成的影响
3.4. 艾草精油对大肠杆菌内外膜通透性的影响
Figure 4. Effects of different concentrations of A. argyi essential oil on the permeability of inner and outer membranes of E. coli
图4. 不同浓度艾草精油对大肠杆菌内外膜通透性的影响
大肠杆菌内膜通透性以PI荧光强度表征，外膜通透性以NPN荧光强度表征。如图4所示，与空白对照组(LB组)相比，随艾草精油浓度升高，PI荧光强度逐步下降，NPN荧光强度显著升高，说明艾草精油能够破坏大肠杆菌外膜结构，增加外膜通透性，导致外源抑菌物质容易穿透外膜进入胞内，继发内膜损伤；降低内膜通透性，引发胞内代谢失调、环境紊乱，抑制大肠杆菌的生长。
4. 讨论
艾草为菊科蒿属多年生草本植物，是一种传统中草药，兼具抗菌、抗炎、抗肿瘤等价值。有研究表明，从艾叶中提取出的精油含有多种活性成分，如松油醇、樟脑、侧柏酮等，且具有抗菌、抗炎等活性抑制作用。由于艾草经济易得且富含抗氧化性物质，其精油也被视为兼具抗菌和抗氧化性的天然活性物质，在天然抑菌剂、天然抗氧化剂领域极具应用潜力。大肠杆菌既是人体正常菌群，又是食品感染和临床感染的常见致病菌，其致病性菌株易引发食品腐败变质及人类肠道炎症、尿路感染等问题，对食品工业及公共卫生安全领域构成严重威胁。近年来，防控致病性大肠杆菌的主要手段是化学合成抑菌剂，但长期使用化学药品容易导致环境污染、大肠杆菌耐药性增强等问题。因此，在食品工业及公共卫生安全领域亟需开发新的高效安全的天然抑菌剂，而艾草精油的天然抑菌特性恰好契合这一需求。目前已经有一部分有关艾草及其抑菌作用与机制的研究，张赟、张涛等[14]研究发现艾草水提取物能够破坏大肠杆菌细胞膜导致细胞内容物流出，谢娟平、侯国良等[15]研究表明秦岭艾草提取物对大肠杆菌有良好抑菌作用，豆佳媛、赵亮等[16]提取的艾草精油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有较好的抑菌作用。
本研究基于这样的研究背景下专注于艾草精油与大肠杆菌这一特定菌种开展，通过多种实验手段系统探究艾草精油对大肠杆菌的抑菌作用以及潜在的作用机制。琼脂扩散法的实验结果显示，艾草精油对大肠杆菌有很强的体外抑菌活性，且其抑菌能力有浓度依赖性，随着艾草精油浓度的降低，其抑菌能力也有所下降。趋化实验的结果表明，高浓度的艾草精油会对大肠杆菌的趋化能力产生显著抑制，降低大肠杆菌向营养物质迁移的能力及定植能力。根据对大肠杆菌的生物膜形成能力的测定可见，艾草精油对大肠杆菌的生物膜形成也具有浓度依赖性抑制作用，能够削弱大肠杆菌的生物膜屏障。生物膜对大肠杆菌而言意义重大，它是细菌抵御外界不良环境的重要屏障，生物膜被破坏意味着大肠杆菌的耐药性也会被削弱[17]。内外膜通透性测定的结果显示，艾草精油会降低大肠杆菌内膜通透性，提高其外膜通透性，导致胞内代谢失调、环境紊乱，触发菌体应激反应，抑制大肠杆菌的生长，严重时会导致菌体死亡。本研究表明，破坏大肠杆菌的生物膜、改变其内外膜通透性导致其胞内环境失衡可能是艾草精油产生显著抑菌效果的主要机制。然而，本研究只针对大肠杆菌进行了体外抑菌实验，艾草精油在体内的抑菌效果以及长期接触高浓度艾草精油的安全性还有待进一步研究。
5. 结论
本研究探究了艾草精油对大肠杆菌的抑菌作用及其内在机制。研究发现，艾草精油对大肠杆菌具有显著的体外抑菌活性，且抑菌效果具有浓度依赖性，随艾草精油浓度的上升，抑菌效果增强。机制研究表明艾草精油能够有效抑制大肠杆菌的趋化运动能力，削弱其向营养物质迁移的能力和定植能力。同时，艾草精油还会提高大肠杆菌外膜通透性，降低其内膜通透性，导致胞内代谢废物无法正常排出、环境紊乱失衡，外部抑菌物质更容易穿过外膜进入胞内，继发内膜损伤，进而抑制大肠杆菌的生长，起到抑菌作用。本研究为食品工业及公共卫生安全领域对大肠杆菌的生物防治提供了一定的理论支撑，为进一步推动该天然提取物向实际应用转化奠定了一定的理论基础。
NOTES
*通讯作者。