1. 引言
苦瓜(Momordica charantia L.)为葫芦科苦瓜属草本植物，是药食同源的植物，最早入药的记录见于《滇南本草》第二卷的《苦瓜》篇[1]。苦瓜性味苦寒，具有清热解毒、养肝明目、补肾润脾、降低血糖、调节血脂、瘦身纤体、抗氧化、抗菌以及提高人体免疫力等药用和保健功能[2]，在我国传统医学上有很多苦瓜治病食疗的记载，国外也有很多相关的报道[3] [4]。
苦瓜在我国千年的食用历史中一直以初级农产品的形式存在。随着现代食品科技的发展，近年来国内外食品工业领域开发出各式各样以苦瓜作为基本原料的深加工食品，迎合国人日益增长的食疗保健、绿色健康等饮食追求，主要以苦瓜(籽)粉[5] [6]、苦瓜饮料[7] [8]、添加苦瓜成分的米面制品[9]、膳食补充剂[10]等形式供应市场，为相关企业带来丰厚的经济效益、展现出广阔的市场前景。
这些含有苦瓜成分的深加工食品在生产过程中经过粉碎、高压、搅拌等加工工艺，苦瓜原料原有的形态特征被完全破坏，难以通过简单的感官鉴别判断成品中是否真正添加了苦瓜原料，无形中为经济利益驱动的掺假行为(Economically Motivated Adulteration, EMA)提供了极大的可操作空间[11]。一些不法生产者用香精代替植物原材料进行各种以次充好、以假充真的掺假操作，严重妨碍公平贸易、损害消费者的利益，对食品安全监管提出了挑战[12]。为此，本文通过建立一项针对深加工食品中苦瓜成分的定性荧光PCR鉴别检测方法，作为现行食品检测标准体系中食品成分检测方法的补充，以此满足相关食品真实性检验监管的技术需求。
2. 材料与方法
2.1. 材料与试剂
苦瓜、水瓜、丝瓜、冬瓜、南瓜、青瓜、西瓜、香瓜、蒲瓜、燕麦、大米、小麦、罗汉果、花生、玉米、大豆、菜豆共17种农产品，18个苦瓜粉，苦瓜汁、苦瓜片、苦瓜茶、苦瓜籽粉、苦瓜荞麦挂面、苦瓜红豆薏米饼、苦瓜葛根燕麦片共11个苦瓜加工食品，购自本地超市或电商。
QuickGene DNA tissue kit S (日本KURABO公司)，TaqManTM Fast Advanced Master Mix(美国Thermo Fisher Scientific公司)，引物、探针(上海闪晶分子生物科技有限公司)。
2.2. 仪器与设备
ABI 7900 HT实时荧光PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，Nanospec微量核酸蛋白测定仪(日本岛津公司)，Centrifuge 5424小型高速离心机(德国Eppendorf公司)，IKA® Tube-Mill Control试管研磨机(德国IKA公司)，MS2旋涡混合器(德国IKA公司)，AB204-S METLER TOLEDO电子天平(瑞士特勒公司)。
2.3. 实验方法
2.3.1. 植物基因组DNA提取和浓度测定
用试管研磨机对实验样品进行均质，用基因组DNA提取试剂盒QuickGene DNA tissue kit S进行样品DNA提取，用Nanospec微量核酸蛋白测定仪测定样品DNA浓度后稀释至20 ng/μL，置于4℃备用。
2.3.2. 引物探针设计和特异性评估
用Primer Express5.0软件，在NCBI GeneBank中选取3条苦瓜的基因组DNA序列，分别设计苦瓜特异性引物探针(见表1中的1~3)。
利用苦瓜DNA进行引物探针的筛选，设置2个PCR平行。实时荧光PCR反应体系(25 μL)：2×实时荧光PCR预混液12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)和探针(10 pmol/μL)各1 μL，DNA模板5 Μl (50 ng ~500 ng)，ddH2O补足体积。反应条件为：50℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，45个循环。
提取1.1中17种农产品的植物基因组DNA，每个样品设置2个PCR平行，验证引物探针的特异性。
Table 1. Primers and probes
表1. 引物和探针
序号 |
基因名称 |
引物/探针序列(5’→3’) |
扩增片段大小/bp |
来源 |
1 |
几丁质酶基因 ChiA |
ChiA-F:GGTTGCCAGAGCCAGTGTG |
113 |
DQ407723.1 |
ChiA-R:TTTCGATACTTGAGCATTTGGTC |
ChiA-P:FAM-CACAAACCCGGGATCGGGAGAC-BHQ1 |
2 |
肌醇半乳糖苷合成酶基因GAS1 |
GAS1-F:TTTGTGTAGCGGCTAAGTCTCTC |
138 |
AY379780.1 |
GAS1-R:TGAAGGTTGATAGTTAGATGTTGGAG |
GAS1-P:FAM-TGGTGTCGACTTTGTGATTGCACAGC-BHQ1 |
3 |
核糖体失活蛋白基因 RIP |
RIP-F:TGGAAAATCAATGGTCTGCTCTC |
122 |
AY817142.1 |
RIP-R:AACATTGGTTACTTGAAACCGTTC |
RIP-P:FAM-CAAGGAGGAAAATTTAGAAATCCTGTCGAC-BHQ1 |
4 |
高等植物内源基因 tRNALeu |
tRNALeu-F:CGAAATCGGTAGACGCTACG |
/ |
SN/T 1202-2010 |
tRNALeu-R:TTCCATTGAGTCTCTGCACCT |
tRNALeu-P:FAM-GCAATCCTGAGCCAAATCC-BHQ1 |
2.3.3. PCR反应体系的优化
采用引物探针终浓度分别为F/R/P (nmol/L)：100/100/100、100/100/50、200/200/200、200/200/100、300/300/300、300/300/150、400/400/400、400/400/200、500/500/500、500/500/250、600/600/600、600/600/300的12种组合，对苦瓜DNA进行PCR，每个组合设置2个PCR平行。
2.3.4. 检测低限评估
用大豆DNA对100%苦瓜DNA进行浓度梯度稀释，分别得到浓度为100%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%和0.01%的苦瓜DNA溶液。用优化后确定的反应体系进行PCR，每个浓度设置2个PCR平行，评估PCR检测低限。
2.3.5. 稳定性评估
采用浓度为0.5%、0.1%和0.05%的苦瓜DNA进行PCR，每个浓度设置10个PCR平行。
2.3.6. 市售食品检测
对1.1的市售食品样品进行植物基因组DNA提取，用本文建立的实时荧光PCR定性检测方法进行苦瓜成分检测，并采用SN/T 1202-2010进行高等植物内源基因tRNALeu检测[13] (见表1中的4)，对检测结果进行分析判断，评价本方法的适用性。
3. 结果与分析
3.1. 引物探针特异性
特异性评估结果见图1和表2。由图表可知，采用ChiA、GAS1和RIP引物探针均能对苦瓜DNA有效扩增，Ct值平均值分别为21、21和22；对菜豆DNA有微弱扩增，Ct值平均值分别为38、36和37；对其他15种农产品均无交叉反应。ChiA对苦瓜DNA扩增的Ct值最小且对菜豆DNA扩增的Ct值最大，因此选取ChiA引物探针进行后续研究。
Table 2. Experimental results of specificity evaluation
表2. 特异性评估实验结果
样品编号 |
样品名称 |
ChiA |
GAS1 |
RIP |
1 |
水瓜 |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
2 |
丝瓜 |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
3 |
冬瓜 |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
4 |
南瓜 |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
5 |
青瓜 |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
6 |
西瓜 |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
7 |
香瓜 |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
8 |
蒲瓜 |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
9 |
燕麦 |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
10 |
大米 |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
11 |
小麦 |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
12 |
罗汉果 |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
13 |
花生 |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
14 |
玉米 |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
15 |
大豆 |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
16 |
菜豆 |
检出，Ct38 |
检出，Ct36 |
检出，Ct37 |
17 |
苦瓜 |
检出，Ct21 |
检出，Ct21 |
检出，Ct22 |
注：(a) ChiA扩增曲线；(b) GAS1扩增曲线；(c) RIP扩增曲线。
Figure 1. Experimental results of specificity evaluation
图1. 特异性评估实验结果图
3.2. PCR反应体系优化
结果见图2。当引物探针终浓度均为500 nmol/L时，Ct值平均值为21，Ct值最小且荧光信号最强。因此确定引物和探针终浓度为500 nmol/L。
Figure 2. Experimental results of reaction system optimization
图2. PCR反应体系优化实验结果图
3.3. 检测低限
结果见图3。以Ct值平均值 < 38为“检出”的判断条件，本方法可检出浓度为100%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%和0.05%的苦瓜DNA，不能检出浓度为0.01%的苦瓜DNA。因此确定检测低限为0.05%。
注：1~8分别为100%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%和0.01%的苦瓜DNA扩增曲线。
Figure 3. Experimental results of limit of detection evaluation
图3. 检测低限评估实验结果图
3.4. 稳定性评估
结果见图4。本方法对浓度为0.5%、0.1%和0.05%的苦瓜DNA能稳定检出，因此在DNA浓度低至0.05%时仍保持检测稳定性。
注：(a) 0.5%苦瓜DNA；(b) 0.1%苦瓜DNA；(c) 0.05%苦瓜DNA
Figure 4. Experimental results of stability evaluation
图4. 稳定性评估实验结果图
3.5. 市售食品检测
市售食品样品检测结果见表3。实验结果显示，在检出高等植物内源基因的18个苦瓜粉和10个苦瓜加工食品样品中均检出苦瓜成分。序号28的苦瓜汁不能检出高等植物内源基因，表明该样品未能有效提取植物基因组DNA，不能进行苦瓜成分PCR检测。实验结果表明，本方法可用于市售深加工食品中苦瓜成分的检测。
Table 3. Experimental results of detection of market foods
表3. 市售食品检测实验结果
序号 |
样品名称 |
产地 |
PCR检测结果Ct值 |
ChiA |
tRNALeu |
1 |
苦瓜粉 |
安徽亳州 |
22 |
17 |
2 |
苦瓜粉 |
福建泉州 |
23 |
17 |
3 |
苦瓜粉 |
安徽亳州 |
22 |
17 |
4 |
苦瓜粉 |
安徽亳州 |
23 |
17 |
5 |
苦瓜粉 |
河南郑州 |
23 |
17 |
6 |
天然纯苦瓜粉 |
河南南太行深山区 |
23 |
17 |
7 |
苦瓜粉 |
江苏徐州 |
23 |
17 |
8 |
苦瓜粉 |
福建泉州 |
22 |
15 |
9 |
苦瓜粉 |
安徽亳州 |
20 |
14 |
10 |
苦瓜粉 |
湖南长沙 |
22 |
15 |
11 |
苦瓜粉 |
安徽亳州 |
21 |
14 |
12 |
苦瓜粉 |
河北保定 |
22 |
16 |
13 |
苦瓜粉 |
安徽亳州 |
22 |
17 |
14 |
苦瓜粉 |
云南昆明 |
21 |
14 |
15 |
苦瓜粉 |
安徽亳州 |
22 |
15 |
16 |
苦瓜粉 |
江苏兴化 |
23 |
17 |
17 |
苦瓜粉 |
广西 |
22 |
15 |
18 |
苦瓜粉 |
广东广州 |
28 |
21 |
19 |
苦瓜片 |
长沙 |
21 |
16 |
20 |
苦瓜籽粉 |
吉林 |
30 |
25 |
21 |
苦瓜葛根燕麦片 |
徐州 |
35 |
17 |
22 |
苦瓜红豆薏米饼 |
东莞 |
28 |
20 |
23 |
苦瓜荞麦挂面 |
广汉 |
26 |
16 |
24 |
苦瓜茶 |
杭州 |
20 |
16 |
25 |
苦荞牛蒡茶 |
亳州 |
23 |
16 |
26 |
苦瓜柠檬茶 |
亳州 |
21 |
15 |
27 |
苦瓜汁 |
天津 |
36 |
34 |
28 |
韩国工艺苦瓜汁 |
青岛 |
— |
— |
29 |
苦瓜汁 |
广州 |
检出 |
检出 |
4. 结论与讨论
本文针对苦瓜特异性基因ChiA建立了一项定性荧光PCR检测方法，检测低限为0.05%，适用于各种市售深加工食品中苦瓜成分鉴别检测，为相关食品真实性检验监管提供一种技术手段，对现行食品安全检测技术体系进行有益补充，也为相关行业的产品研发、生产质控等环节提供帮助。
本方法规定，当Ct值平均值 < 38.0判定为检出苦瓜成分，当Ct值平均值 ≥ 38.0判定为未检出苦瓜成分，这是基于特异性评估实验结果的考虑。本方法对菜豆DNA有微弱扩增，Ct值平均值为38.0。本方法在应用中可能遇到含有菜豆成分的食品，为排除菜豆成分的非特异性扩增干扰，因而设置判断阈值为38.0。
在应用性研究中，本文发现1种名为“韩国工艺苦瓜汁”的市售食品未能检出高等植物内源基因tRNALeu，也未能检出苦瓜特异性基因ChiA。实验结果表明，该样品采用本文的DNA提取方法，不能有效提取植物基因组DNA，从而导致无法使用荧光PCR方法进行进一步基因检测。这说明，对于部分深加工食品，由于加工工艺和食品配方等原因造成的干扰，样品中含有的DNA含量很低或存在严重的背景干扰，采用现有常规DNA提取技术，无法从样品中有效回收DNA进行基因检测，需要进一步开展DNA提取技术的研发。另外一种可能性是深加工食品的自我声明与实际情况不符，声称采用植物原材料实际却不含有，因此不能从样品中检测出高等植物内源基因。
现代食品工业的发展和都市化进程对饮食习惯的改变，导致越来越多的以果蔬为原材料的深加工食品，以绿色健康、简单方便为特色出现在消费者的选择清单。为规范此类新食品的质量安全，近年来管理部门陆续出台相关产品标准，如《GH/T 1456-2024果蔬粉》[14]和《NY/T 434-2025绿色食品果蔬汁类及其饮料》[15]分别于2024年9月和2025年5月实施，反映出此类新食品在消费市场的日益流行。这些产品标准的颁布实施，必然对相应的质量安全检测技术提出迫切的需求，本文正是对这一需求的及时回应。本文作者前期已经发表的科研成果包括蓉沙馅料、谷物粉等深加工食品中绿豆和板栗[16]、莲子和芸豆[17]、红豆和赤小豆[18]、榛子[19]、芝麻和花生[20]等植物源性成分的定性或定量鉴别检测技术，为本文的研究奠定了比较扎实的技术基础。鉴于上述这类产品标准不断出台，有必要在这一细分领域开展更多的技术研究，为这类食品的质量安全管理提供更多的技术手段。
致 谢
感谢海关总署科研项目“进口农食产品真伪鉴别和品名鉴别检测关键技术研究”(2020HK190)课题组专家对本研究的指导和支持。
基金项目
海关总署科研项目(2020HK190)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。