1. 引言
近年来有关新能源的研发日趋增多，生物柴油作为一种可再生资源有着巨大的开发潜力和发展前景，牟氏角毛藻是微藻燃油技术研究中理想的生物柴油生产者 [1] 。且随着海参养殖的迅速发展，关于海参育苗关键环节的开口饵料——牟氏角毛藻越来越受到人们的重视。牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)隶属于硅藻门(Bacillariophyta)盒形藻目(Biddulphiales) [2] 。为耐高温单胞藻类，具有细胞微小、细胞壁薄、生长快、营养丰富等优点，适于海参的摄食和消化 [3] 。牟氏角毛藻是一种小型的海洋浮游硅藻,细胞小、壁薄、多数单个生活,属广温广盐性藻类,在水温处于
20 ℃ ~
30℃盐度为30‰左右的条件下生长最快,其最适光度为1000~15000 Lux，最适PH为8.0~8.9 [3] ，与其它单细胞藻相比生长快、营养高、适合大规模生产。其多不饱和脂肪酸的含量较高，在较好的培养条件下，其二十碳五烯酸(EPA)占总脂肪酸含量的10.2%。牟氏角毛藻的生长过程中能够合成在医药、保健品行业中有着重要应用价值的亚麻酸、亚油酸、二十碳五烯酸(EPA)等不饱和脂肪酸，此外牟氏角毛藻还含有一定量的色氨酸。
牟氏角毛藻是良好的植物性生物饵料，生物饵料与人工配合饵料相比有如下优点 [4] ：生物饵料能在养殖水体中存活，且对养殖水体的水质影响较小；营养丰富，能满足水产动物的营养需求，而且生物饵料大多为未知的生物活性物质，对养殖对象的生长有利；生物饵料的大小可满足养殖对象饵料大小的需求，不同生物饵料可组合成系列饵料，满足养殖对象不同生长阶段的具体要求；生物饵料在水体中的分布特点有利于大多数水产动物更方便地摄食。
鱼、虾、蟹、海参等海产品是现代人们高质量生活永久的话题，人们对它们的需求量与日倍增，水产养殖随之兴起，达到前所未有的发展水平。生物饵料在许多水产动物的苗种生产中有着举足轻重的作用，牟氏角毛藻更是重中之重，可以投喂对虾、海参、双壳贝类、海胆、鲍等的幼虫 [5] ，因此牟氏角毛藻具有很好的开发利用价值。
由此可见牟氏角毛藻具有很好的开发利用价值。
牟氏角毛藻的培养方法有通气培养法和静止培养法，本论文的目的是比较在这两种不同培养方法下的牟氏角毛藻中营养物质含量的高低。其意义在于寻找一种能使牟氏角毛藻生长既快，营养含量又高的培养方法。此外，本实验对牟氏角毛藻在其他方面的进一步开发与利用也具有一定的指导意义。
2. 材料与方法
2.1. 材料
牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)由鲁东大学烟台市微藻工程技术研究中心经济海藻种质库提供。
2.2. 牟氏角毛藻培养
采用平板封闭式光生物反应器对牟氏角毛藻进行分批式培养。反应器光径为5 cm；培养条件为20℃~25℃，pH控制在7~9；以散射自然光为光源。
2.3 粗脂肪的提取和测定 [6]
2.3.1. 样品处理
将离心得到的牟氏角毛藻在36℃烘箱中烘12小时，取出冷却后准确称取通气培养的牟氏角毛藻和静止培养的牟氏角毛藻各0.80 g，研碎，将样品及因擦净研钵而带有残藻的脱脂棉一并用脱脂滤纸包好。
2.3.2. 抽提
将洗净的索氏提取瓶在105℃烘至恒重，记录重量W0。将无水乙醚加至提取瓶内约体积的1/2~2/3，将样品放入提取管中，把索氏提取器的各部连好，加热回馏2~4小时，回馏完毕，将提取管内的乙醚倒出，提取瓶内的乙醚完全蒸发，再将提取瓶置105℃烘箱烘至恒重，记录重量W。
2.3.3. 计算
粗脂肪的含量 = (W − W0)/样品重量 × 100%
2.4. 蛋白质含量的测定 [7]
2.4.1. 试剂
100 μg/mL牛血清蛋白：称取10 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100 mL，制成100 μg/mL的原液。
考马斯亮蓝G-250溶液：称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL的乙醇中，加入100 mL 85%的磷酸溶液，再用蒸馏水定容到1 L，贮于棕色瓶中。
2.4.2. 标准曲线的绘制
取6支试管按表1加入试剂，混合均匀后向各管中加入5 mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，放置2分钟后，以1号管为对照，用1 cm光径595 nm下比色测定吸光度，测定在1小时内完成。
以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线如图1。
2.4.3. 样品提取
将离心后的牟氏角毛藻放在36℃的烘箱中烘12小时，冷却后，准确的称取通气和静止培养的牟氏角毛藻各1.0 g，加2 mL蒸馏水在冰浴中研成匀浆，转移，定容至30 mL，在4000 r/min冷冻离心10分钟，取上清液待测。
2.4.4. 样品中蛋白质含量的测定
取另2支试管，一支加入通气培养的牟氏角毛藻提取液0.4 mL，另一支加入静止培养的牟氏角毛藻提取液0.4 mL，再各加入0.6 mL蒸馏水和5 mL的G-250溶液，充分混合，放置2分钟后在595 nm下比色测定吸光度，静止条件下培养的藻的吸光值为0.753，通气条件下培养的藻的吸光值为0.448。通过标准曲线方程可算出蛋白质含量。
2.5. 碳水化合物含量的测定(Somogyi法) [8]
2.5.1. 试剂
5%的硫酸锌溶液；5 mol/L的NaOH溶液；2%的HCL溶液；
Table 1. The standard curve of protein measurement
表1. 蛋白质标准曲线测定表
Figure 1. The standard curve of protein measurement
图1. 蛋白质标准曲线
1%酚酞溶液：1 g酚酞溶解在100 mL的95%的酒精溶液中。
饱和氢氧化钡溶液：将蒸馏水煮沸，除去水中的二氧化碳，冷却后加入固体Ba(OH)2盖好，过夜，次日过滤。
铜碘试剂：
溶液A：取硫酸铜6.5 g溶于100 mL水中。
溶液B：取酒石酸钠12 g，无水碳酸钠20 g，碳酸氢钠25 g，溶于500 mL水中。
溶液C：取碘酸钾0.8 g，碘化钾10 g，草酸钾18 g，溶于200~300 mL水中。
用时将溶液B倒入溶液A中，再倒入溶液C中，混合后稀释至1000 mL混匀。
2.5 mol/L的H2SO4溶液：浓硫酸143 mL加入水中，稀释至1000 mL，混匀。
淀粉指示剂：1g淀粉溶解在100 mL水中，加热使之溶解即可。
0.005 mol/L硫代硫酸钠标准液：首先制备近似0.01 mol/L的Na2S2O3溶液(称取Na2S2O3.5H2O 2.4823 g，Na2CO30.02 g，加新煮沸经冷却的蒸馏水至1000 mL)，放暗处8~14天，然后标定。
比重1.103的HCL溶液：取浓盐酸528 mL，加蒸馏水稀释成1000 mL。
1.25%硫酸溶液：取比重1.84的浓硫酸13 mL加水稀释至1 L。
1.25%氢氧化钠溶液：15 g氢氧化钠溶解在1 L蒸馏水中，然后用标准酸来标定其准确程度，计算再应加蒸馏水的量，使其浓度准确为1.25%。
2.5.2. 还原糖含量的测定
(1) 抽提
将离心后的牟氏角毛藻在36℃烘箱中烘12小时。研碎，准确称通气培养的牟氏角毛藻和静止培的牟氏角毛藻各1.0 g，分别放入250 mL的三角烧瓶中，加入80%的酒精50 mL，均放在70℃水浴锅中抽提3小时，过滤，留滤液，再加入20 mL酒精，抽提过滤，如此3~5次，各合并所有滤液，定容至500 mL。最后将残渣烘干，留作淀粉分析用。
(2) 澄清
分别吸取酒精提取液25 mL，在水浴锅上蒸干。若溶液有酸性，可先用固体碳酸钠中和，以免酸对蔗糖的分解，蒸干后加入少量水，边搅边加入饱和Ba(OH)2溶液2~10 mL，沉淀完全后，加入1滴酚酞指示剂，边搅边滴入ZnSO4溶液，以沉淀钡盐，滴至红色退去，再滴饱和Ba(OH)2溶液，恢复淡红色为终点。过滤并用蒸馏水洗涤沉淀，将滤液放入50 mL容量瓶中稀释至刻度，便可测定还原糖和蔗糖的含量。
(3) 测定
分别吸取糖液5 mL，放入带塞的试管中。分别加入5 mL铜碘试剂，盖塞，置沸水浴中保持100℃ 15分钟，取出放入30℃水浴中，杯内温度与水浴温度相一致时为止。加入2.5 mol/L的H2SO4溶液1 mL，盖好，放置2分钟，使沉淀物完全溶解，用水把盖上的碘冲洗下来。分别用0.005 mol/L的Na2S2O3溶液滴定，边滴定边搅拌，滴至淡黄色时，加淀粉指示剂1 mL，再滴至淡蓝色时为终点。
记录：通气培养的牟氏角毛藻糖液用Na2S2O3溶液27.9 mL，静止培养的牟氏角毛藻糖液用Na2S2O3溶液27.7 mL。另取蒸馏水和铜碘各5 mL，做空白滴定，用Na2S2O3溶液28.15 mL。
2.5.3. 蔗糖含量的测定
分别吸取清洁后的可溶性糖液10 mL，均放入25 mL容量瓶中，各加入比重1.103的HCL溶液2 mL，煮沸5分钟，使之转化成还原糖后用5 mol/L的NaOH溶液中和，用酚酞为指示剂加至淡红色为止。中和后用水稀释至刻度，吸取5 mL测定其总可溶性糖含量。
记录：静止培养的牟氏角毛藻糖液用Na2S2O3溶液为27.2 mL，通气培养的牟氏角毛藻糖液用Na2S2O3溶液27.5 mL。
2.5.4. 淀粉含量的测定
取酒精提取后的残渣0.1 g，放入三角烧瓶中，加2%HCL溶液25 ml，盖上，在沸水浴锅中沸腾3.5小时，用5 mol/L的NaOH溶液中和，再依照测定还原糖的方法加入清洁剂，过滤，稀释至50 mL。吸取5 mL测定其还原糖含量。
记录：静止培养的牟氏角毛藻糖液用Na2S2O3溶液24.1 mL，通气培养的牟氏角毛藻糖液用Na2S2O3溶液26.0 mL。
2.5.5. 粗纤维含量的测定 [9]
将两张滤纸分别放在80℃~90℃的烘箱中烘干，称重，重量分别为W01和W02。
将离心后的牟氏角毛藻放在36℃的烘箱中烘12小时，冷却后，准确的称取通气和静止培养的牟氏角毛藻各1.0 g，研碎，分别放入250 mL三角烧瓶中。在烧瓶外壁上，相当200 mL容量处，作一记号，然后将200 mL的1.25%的硫酸溶液倒入瓶中，加热至沸腾后应继续加热30分钟，加热时为防止激烈沸腾，应经常搅拌。每5分钟要向瓶内倒入沸水，使其内容物达到记号，以保持酸的浓度不变。
煮沸之后，分别用烘干的滤纸过滤，并用热蒸馏水冲洗烧杯及漏斗3~4次。用1.25%氢氧化钠溶液将滤纸上的沉淀物完全洗入瓶内，将其加热至沸腾再继续30分钟(操作同上)。煮沸后冷却，分别用原来的所用滤纸过滤，用蒸馏水冲洗2~3次，再用酒精冲洗2~3次直至滤液无色为止。将带有沉淀的分别称重，在80℃~90℃的烘箱中烘至恒重，称重，分别为W1和W2。
粗纤维的百分含量 = (W − W0)/样品重量 × 100%
3. 结果与讨论
3.1. 脂肪含量
通气培养的牟氏角毛藻的粗脂肪含量 = (86.0569 − 85.8617)/0.80 × 100% = 24.396%；
静止培养的牟氏角毛藻的粗脂肪含量 = (86.0470 − 85.8356)/0.80 × 100% = 26.425%。
由此可见，静止培养的牟氏角毛藻粗脂肪含量高于通气培养的牟氏角毛藻粗脂肪含量。
3.2. 蛋白质含量
静止培养的牟氏角毛藻蛋白质含量为0.816%；通气培养的牟氏角毛藻蛋白质含量为0.474%。可见，静止培养的牟氏角毛藻蛋白质含量高于通气培养的牟氏角毛藻蛋白质含量。
3.3. 还原糖含量
通气培养的牟氏角毛藻每5 mL糖液中含还原糖0.055 mg
静止培养的牟氏角毛藻每5 mL糖液中含还原糖0.085 mg
所以：通气培养的牟氏角毛藻还原糖含量为1.1%，而静止培养的牟氏角毛藻还原糖含量为1.7%。
4. 蔗糖含量
静止培养的牟氏角毛藻每5 mL糖液总糖含量为0.155 mg
通气培养的牟氏角毛藻每5 ml糖液总糖含量为0.105 mg
蔗糖量 = (总可溶性糖含量 − 还原糖含量) × 0.95
由此：静止培养的牟氏角毛藻含蔗糖量为3.325%，通气培养的牟氏角毛藻含蔗糖量为2.375%。前者高于后者。
5. 淀粉含量
静止培养的牟氏角毛藻每5 mL糖液中还原性糖含量为0.495 mg
通气培养的牟氏角毛藻每5 mL糖液中还原性糖含量为0.365 mg
葡萄糖含量 × 0.9 = 粗淀粉含量
由此：静止培养的牟氏角毛藻淀粉含量为4.455%，通气培养的牟氏角毛藻淀粉含量为3.285%。前者高于后者。
6. 粗纤维含量
静止培养的牟氏角毛藻粗纤维的含量为：(36.3938 − 36.3816)/1.0 × 100% = 1.22%；
通气培养的牟氏角毛藻粗纤维的含量为：(48.9681 − 48.9573)/1.0 × 100% = 1.08%。
静止培养的牟氏角毛藻碳水化合物含量高于通气培养的牟氏角毛藻碳水化合物含量
用以上方法测定的静止培养和通气培养的牟氏角毛藻营养物质含量如表2。
由此可见：不同的培养方法对牟氏角毛藻细胞内的营养物质含量有一定的影响，静止培养的牟氏角毛藻营养物质含量高，通气培养的牟氏角毛藻营养物质含量低。
现已有报道表明：培养的环境条件对单细胞藻类的营养物质价值会产生影响 [10] ，实验结果与此基本一致。静止培养的牟氏角毛藻生长相对慢，理论上讲营养物质含量高，理论与实际也相符，说明本实验结果有一定的参考价值。
Table 2. The content of nutrimental substances in Chaetoceros meulleri of different methods
表2. 不同培养方法牟氏角毛藻的营养物质含量
由此可以得出结论：静止培养的牟氏角毛藻中脂肪、蛋白质等营养物质含量高于通气培养的牟氏角毛藻中脂肪、蛋白质等营养物质的含量。
目前，水产养殖与育苗领域对水产养殖动物开口饵料的不同培养方法的营养成分对比研究很少，本研究对该领域的生产工艺优化具有一定的指导意义，并对微藻燃油技术的发展有一定意义。
基金项目
山西省煤艺重点科技攻关项目，微藻燃油关键技术研发与中试(FT-2014-01)。