白梨SOT基因家族成员组织表达特性的分析

Analysis of Tissue Specific Expression of SOT Gene Family in White Pear

摘要: 本文旨在鉴定出白梨山梨醇转运蛋白(SOT)基因家族成员，利用生物信息学和基因组织表达特性的分析，明确梨各组织中参与山梨醇运输的主要SOT基因。基于全基因组测序结果，采用生物信息学方法鉴定出苹果、白梨、桃、梅、草莓和黑树莓6个蔷薇科果树物种SOT基因家族序列信息，并进行基因结构、理化特性等相关分析，并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定PbSOTs基因在白梨各个器官组织中的表达特性。从六个蔷薇科果树物种分离出SOT基因家族成员62个，其中，PbSOT11、PbSOT12、PbSOT14、PbSOT16、PbSOT23和PbSOT24在白梨各组织中几乎都不表达；PbSOT5仅在花中表达；PbSOT4在白梨各组织中基本也都不表达，PbSOT7/8仅在茎、花、果中表达；PbSOT10和PbSOT13在白梨各组织中同样都不表达，PbSOT9仅在果实中表达；PbSOT6和PbSOT20在所有组织中均表达；PbSOT1/2仅在根、茎、花和种子中表达，而PbSOT3和PbSOT19/21和PbSOT22在根、茎、花、叶和果实中都表达，但在种子中基本不表达。PbSOT20是梨山梨醇“源–库”迁移过程各组织的主要调控基因。而PbSOT6和PbSOT19/21是根组织中山梨醇转运主要调控基因。

Abstract: The purpose of this paper is to identify sorbitol transporter (SOT) gene family members in white pear and the major SOT genes for sorbitol transport in pear tissues, using bioinformatics and the analysis of gene expression characteristic. Based on the sequenced results of whole genome from Malus domestica, Fragaria vesca, Prunus mume, Prunus persica, Pyrus bretschneideri and Rubus occidentalis, the gene sequences, gene structure, physical and chemical properties were analyzed by the method of bioinformation, the expression characteristics of PbSOTs gene in the various or-gans of white pear were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR). In this study, a total of 62 SOT genes were identified from six Rosaceae species. PbSOT11, PbSOT12, PbSOT14, PbSOT16, PbSOT23 and PbSOT24 were almost not expressed in Chinese white pear tissues; PbSOT5 was only expressed in flowers; PbSOT4 was also almost not expressed in all tissues of Chinese white pear, and PbSOT7/8 was only expressed in stem, flower and fruit; PbSOT10 and PbSOT13 were equally unexpressed in the white pear tissues, PbSOT9 was only expressed in fruit; PbSOT6 and PbSOT20 were expressed in all tissues; PbSOT1/2 was just expressed in root, stem, flower, and seed, and PbSOT3 was expressed in roots, stems, flowers, leaves and fruits, but not in seeds, as well as PbSOT19/21 and PbSOT22. PbSOT20 is the main regulatory gene for sorbitol transportation from source to sink in all kinds of tissues in pear, while PbSOT6 and PbSOT19/21 are the possible regulatory genes for sorbitol transportation in root tissue.

1. 引言

糖是影响果实品质和风味的重要因素，果实中糖主要包括蔗糖、果糖、葡萄糖和山梨醇。山梨醇是一种六碳糖醇，是蔷薇科果树的主要光合产物、运输物质以及储藏物质，在代谢和生长过程中起着重要的作用。作为主要运输物质，山梨醇在不同组织中的含量差异较大，在韧皮部的含量为65%~70% [1] [2] ，在成熟叶片细胞中的含量为30%~40% [3] 。山梨醇的运输是一个主动运输过程，主要由山梨醇转运蛋白(SOT)协助完成 [4] 。目前，Gao等(2003, 2005)分别从苹果和酸樱桃中分离出两个与山梨醇有很高的亲和性的运输蛋白基因PcSOT1和PcSOT2 [5] [6] 。Watari等(2004)从苹果叶片分离出三个参与山梨醇运输的基因：MdSOT3、MdSOT4和MdSOT5 [7] 。此外，在苹果果实中还发现了定位在质膜上且与细胞色素b5间存在胞内互作的MdSOT6，该基因可调控细胞相应细胞内外山梨醇浓度的变化 [8] 。近年来，Zhang等(2014)和Wang等(2016)从鸭梨果实中分别克隆出PbSOT1和PbSOT2 [2] [9] 。戴美松等(2015)利用RNA-seq技术从砂梨果肉中鉴别出了22个可能表达的SOT基因家族成员 [10] 。然而，这些SOT基因在不同组织间表达水平的差异一直未得到关注。

梨是蔷薇科中重要的经济果树之一，近年来，随着白梨(Pyrus bretschneideri) [11] 、苹果(Malus domestica) [12] 、草莓(Fragaria vesca) [13] 、梅(Prunus mume) [14] 、桃(Prunus persica) [15] 和黑树莓(Rubus occidentalis) [16] 等相继完成全基因组测序，为从全基因组水平研究蔷薇科果树SOT提供了重要数据。本研究基于已公布的蔷薇科果树全基因组数据，筛选出梨、苹果、草莓、梅、桃和黑树莓等物种全部的SOT基因家族成员，通过生物信息学方法分析其基本理化性质、结构特征和进化关系，并通过荧光定量PCR技术检测梨PbSOT家族成员在各个器官组织中的表达特性，为进一步分析其功能及梨山梨醇积累机制提供理论基础。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

供试材料梨品种为“砀山酥梨”，采自南京农业大学园艺教学与科研基地梨种质资源圃。试验于2016年至2017年进行，分别采集砀山酥梨的根，茎，叶，花，种子和果实为待测样品。样品采后即用液氮速冻，并保存于−80℃冰箱备用。

2.2. 实验方法

2.2.1. 蔷薇科果树SOT基因的筛选与鉴定

SOT基因序列信息分别从白梨基因组数据库(http://peargenome.njau.edu.cn/)、梅基因组数据库(http://prunusmumegenome.bjfu.edu.cn)、黑树莓基因序列信息从蔷薇科基因组数据库(GDR；https://www.rosaceae.org/)以及苹果、桃、草莓数据库(Phytozome； https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)获取。此外，从拟南芥基因组数据库 (http://www.arabidopsis.org/index.jsp)获得拟南芥AtPLT1-6基因序列和苹果中已经报道 [11] 的MdSOT1 (AY237400)、MdSOT2 (AY237401)、MdSOT3 (AB125646)、MdSOT4 (AB125647)和MdSOT5 (AB125648)蛋白序列为模板在蔷薇科6个果树物种基因组数据库中进行Blastp，获得同源序列比对，将获得的拟南芥蛋白序列和苹果MdSOTs序列分别与各物种同源序列利用软件MEGA7.0构建系统进化树，与AtPLT、MdSOT亚家族聚为一类的为候选基因。通过Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)分析所有候选基因保守结构域，移除与MdSOT家族基因保守结构域不一致的序列，并在NCBI保守结构数据库CCD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)中进一步验证保守结构域，确定目的基因。

2.2.2. 蔷薇科果树SOT基因序列分析

蔷薇科果树SOT基因序列从各基因组数据库中获得，基因的内含子/外显子特征利用在线软件GSDS2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)进行分析 [17] 。氨基酸序列分子量、理论等电点、脂溶指数和不稳度指数等蛋白理化特性利用在线工具ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/)进行分析。亚细胞定位利用MBC (http://cello.life.nctu.edu.tw/)进行预测 [18] 。PbSOT基因启动子序列分析采用基因上游的1500 bp序列通过在线软件PlantCAREWebsite (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) [19] 进行。蛋白序列motif利用在线工具MEME (http://meme-suite.org/) [20] 进行分析,参数设置：motif数量为20个，motif的宽度最小为6，最大为50。染色体信息从各基因组数据库注释信息中获得，染色体定位图利用软件circos完成。

2.2.3. 蔷薇科果树SOT基因进化分析

蔷薇科果树SOT基因的进化树以SOT的蛋白序列为模板，系统进化树利用软件MEGA7.0采用NJ的方法来构建，采用泊松分布来构建NJ模型，Bootstrap值设置为1000 [21] ，参数选择p-distance和两两删除选项。

同源基因对从基因组的复制数据库中进行的(PGDD)中获得 [22] ，Ka、Ks和Ka/Ks值利用软件KaKs_Calculator 2.0在默认参数的条件下计算。

2.2.4. 白梨PbSOT基因定量表达分析

采用多酚多糖RNA提取试剂盒(有晴生物技术有限公司)提取总RNA，采用试剂盒TransScript^® One-Step RT-PCR SuperMix (北京全式金生物技术有限公司)反转录RNA为cDNA，合成的cDNA用于实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析。荧光引物利用软件Primer5.0设计，荧光定量PCR仪为罗氏lightCycler 480Ⅱ，反应试剂为SYBR Premix ExTaq^TM (TaKaRa)，以Pbrtublin为内参基因,不同样品得到的数据经内参基因均一化处理后，采用2^­-ΔΔCt 法 [23] 计算基因的相对表达量。应用Microsoft Excel 2010版本进行试验数据的处理与分析。实时荧光定量PCR的引物见表1。

3. 结果与分析

3.1. 蔷薇科果树SOT基因的筛选与鉴定

以MdSOT1、MdSOT2、MdSOT3、MdSOT4和MdSOT5蛋白序列为模板分别在各蔷薇科果树基因组数据库进行Blastp，获得同源序列共81个：梨26个、苹果23个、桃12个、草莓4个、梅12个、黑树莓4个。通过Pfam数据库分析所有候选基因保守结构域，移除与AtPLT家族基因保守结构域Sugar_tr(PF00083.22)不一致的序列，并在NCBI保守结构数据库CCD中进一步验证其保守结构域，将获得的拟南芥蛋白序列分别与各物种同源序列利用软件MEGA7.0构建系统进化树进行聚类分析，与苹果已经报道的5个MdSOT基因聚为一类的为候选基因。并通过在线软件MEME进一步分析目的基因蛋白序列保守motif，最终获得六个蔷薇科果树物种SOT基因62个：梨24个，苹果17个，桃9个，草莓2个，梅9个，黑树莓2个见表2。

Table 1. Forward (F) and reverse (R) primers of PbSOT for qRT-PCR

表1. PbSOT基因家族成员用于qRT-PCR分析的引物序列

Table 2. SOT genes in fruit tree of Rosaceae

表2. 蔷薇科果树SOT基因

3.2. 蔷薇科果树SOT基因的基本信息

蔷薇科果树SOT基因CDS序列长度在1062 bp (MdSOT1)-2430 bp (MdSOT2.8)之间。其中，苹果MdSOT1 (1062 bp)基因序列最短，MdSOT2 (8591 bp)基因序列最长。SOT基因家族编码的蛋白序列长度为524 aa，相对分子质量在38.5 kda (MdSOT1)~88.326 kda (MdSOT2.8)之间。除了PbSOT19理论等电点(pI) < 7，显酸性，其他SOT基因的理论等点(pI) > 7，显碱性。最大疏水系数在0.251~0.561之间(>0)，为疏水性蛋白见表2。对SOT基因家族蛋白序列进行跨膜结构分析发现，SOT基因均存在10个以上跨膜结构，且在第六和第七个跨膜区间存在一个100 aa大小的亲水loop。

3.3. 蔷薇科果树SOT基因系统进化及结构分析

蔷薇科62个SOT基因家族基本上有一个相似的内含子外显子结构，但内含子和外显子数量以及位置是不一样的。蔷薇科果树SOT基因包含0-5个内含子，大多数SOT基因的内含子数量在1~3之间，除了MdSOT1没有内含子，MdSOT2.8、MdSOT3.3、MdSOT4有4个内含子，MdSOT2、PmSOT7有5个内含子(图1右)。motif分析表明，蔷薇科果树SOT基因的motif数量和分布具有相似性，其中motif 1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、16、17是SOT基因家族比较重要且保守的结构(图1中)。蔷薇科果树SOT基因家族所有成员均含有motif1和motif17，几乎所有SOT基因均motif2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、16。SOT家族成员的在各个亚枝的核苷酸水平和蛋白水平的序列结构差异小，说明SOT是典型的同源进化 [24] 。

3.4. 共线性分析

蔷薇科果树SOT基因家族中，一共有24对直系同源基因和2对旁系同源基因见表3。直系同源基因对的Ka/Ks的值均小于1，说明纯化选择在SOT基因家族进化过程中起主要作用。其中，FvSOT1-MdSOT5的Ks值比较大，说明FvSOT1和MdSOT5分化早，然而相对其他Ks较大的基因对其Ka/Ks的值比较小，说明从FvSOT1到MdSOT5的进化过程比较保守。

Figure 1. Evolutionary analysis of SOT genes in Rosaceae

图1. 蔷薇科果树SOT基因进化分析

Table 3. The Ka/Ks analysis of homologous SOT genes in fruit tree of Rosacea

表3. 蔷薇科果树SOT基因家族直系和旁系同源基因Ka/Ks值

注：P：旁系同源；O：直系同源Nd: P: Paralogs; O: Ortholog

SOT基因进化中比较保守也体现在结构的变异度比较小。PbSOT6-PmSOT3，PbSOT6-PpSOT4和RoSOT1-PbSOT6的Ka/Ks偏小，PbSOT6，PmSOT3，PpSOT4和RoSOT1基因结构上都具有2个内含子和3个外显子的特征，说明在选择压力下，核苷酸序列保持相对一致性，所以PbSOT6，PmSOT3，PpSOT4和RoSOT1在进化过程中比较保守。蔷薇科果树物种SOT基因的Ks值如表3所示，其中一部分同源基因对的Ks值比较大(Ks~2.3~4.6)，说明它们起源于一个更古老的重复事件。

3.5. PbSOTs基因家族基因启动子序列分析

在白梨中，PbSOTs基因对逆境有一定的抵抗作用。为了确定启动子区域与逆境相关的元件，通过在线软件PLantCARE分析PbSOTs基因上游1500 bp序列。PbSOTs基因启动子区除了存在大量的启动子元件CAAT-box和TATA-box外，还丰富存在参与光相应顺式调控元件，例如：ACE、ATCT-motif、Box 4、G-Box、GAG-motif、I-box、Sp1、TCCC-motif、chs-CMA1a、GT1-motif等，并包含大量与逆境相关的元件，包括厌氧相关的元件ARE、真菌诱导元件Box-W1、热激相关元件HSE、干旱诱导元件MBS、低温响应元件LTR、预防和胁迫应答的相应元件TC-richrepeats等。与激素相关的元件，如：MeJA响应元件CGTCA-motif、脱落酸响应元件ABRE、乙烯反应元件ERE、水杨酸响应元件TCA-element、赤霉素应答顺时调控元件 GARE-motif等(图2)。

3.6. 白梨PbSOTs基因组织表达特性

PbSOTs在白梨中存在明显的时空表达特异性。由于PbSOT1和PbSOT2,PbSOT7和PbSOT8以及PbSOT19和PbSOT21两两之间存在高度的序列相似性，无法设计特异引物，因此设计的引物的扩增结果为这两个成员的表达之和，以PbSOT1/2，PbSOT7/8和PbSOT19/21标识。在根中，PbSOT6和PbSOT19/21的表达水平很高，PbSOT1/2、PbSOT3、PbSOT20和PbSOT22表达水平较低，而其他基因几乎不表达。在茎中，PbSOT1/2、PbSOT3、PbSOT7/8、PbSOT19/21和PbSOT20的表达水平很高，PbSOT4、PbSOT5、

Figure 2. Types of stress-related elements in the promoter regions of PbSOTs genes

图2. PbSOTs启动子区域和逆境相关的元件类型

PbSOT6、PbSOT9和PbSOT22均有表达，其他基因几乎不表达。在花中，PbSOT1/2、PbSOT19/21和PbSOT20的表达水平很高，PbSOT3、PbSOT5、PbSOT6、PbSOT7/8和PbSOT22表达水平相对较低，其他成员几乎不表达。在叶中，PbSOT20的表达水平极高，PbSOT3、PbSOT6、PbSOT19/21和PbSOT22表达水平相对较低，其他成员几乎不表达。在果实中，PbSOT20的表达水平也极高，PbSOT3、PbSOT6、PbSOT7/8、PbSOT 9、PbSOT19/21和PbSOT22表达水平相对较低，其他成员几乎不表达。在种子中，PbSOT20同样表现出了极高的表达水平，PbSOT6表达水平次之，其它成员表达量极低或不表达。因此，根中的山梨醇转运主要依赖于PbSOT6和PbSOT19/21，茎中的山梨醇转运主要依赖于PbSOT1/2、PbSOT3、PbSOT7/8、PbSOT19/21和PbSOT20，花中的山梨醇转运主要依赖于PbSOT1/2、PbSOT19/21和PbSOT20，叶、果和种子中的山梨醇转运均依赖于PbSOT20 (图3)。

4. 讨论

4.1. SOT基因家族的基本特性

山梨醇转运蛋白(SOT)是PLT家族的一个亚家族，主要定位在质膜上，属于高疏水性性蛋白，具有典型的MFS超家族的结构域“sugar_tr”，是山梨醇运输过程的主要转运蛋白。本文从蔷薇科梨、苹果、桃、梅、草莓和黑树莓6个果树物种中共筛选鉴定出62个SOT基因，并对其进行理化性质、系统进化、基因结构、motif和基因表达量等分析。结果表明，SOT家族基因主要显碱性，有10个以上的跨膜结构。在第六和第七个跨膜区间有一个100 aa大小的亲水loop结构。PbSOT6-PmSOT3，PbSOT6-PpSOT4和RoSOT1-PbSOT6在进化过程中比较保守，通过比较它们的motif发现这四个基因中有个别基因没有motif15和motif18，推测这两个motif并非是SOT保守蛋白结构所特有的。

山梨醇是重要的渗透调节物质，在植物响应生物和非生物胁迫中起作用。PbSOTs基因的上游启动子区存在一些顺式作用元件可调控基因的表达并响应胁迫作用。有研究表明，如受干旱胁迫时苹果根、韧皮部及叶片等源器官内山梨醇含量上升，同时MdSOT3和MdSOT5在上述部位的表达量也显著上升 [24] 。冷藏期间PpSOT3、PpSOT4、PpSOT8、PpSOT25、PpSOT32和PpSOT33表达明显上调，与冷藏期间果实山梨醇含量趋于下降相对应 [10] 。PbSOTs家族基因启动子区不仅有光响应顺式调控元件对果实生长发

Figure 3. Tissue specificity of gene family members of PbSOTs gene

图3. PbSOTs基因家族成员的组织特异性表达

育和糖分的分配有一定的作用，还存在逆境相关元件，说明PbSOTs不仅参与了山梨醇转运，同时参与了植物抗逆过程。

4.2. 蔷薇科果树SOT基因进化关系

蔷薇科果树中SOT基因分布不均，白梨24个、苹果17个、桃9个、梅9个、草莓2个、黑树莓2个。

基于Ks的研究，苹果进化过程中出现过两次全基因组重复事件：三倍体加倍(γ) (Ks~1.6)和近代全基因组复制(Ks~0.2) [11] ；梨进化过程中三倍体加倍(γ) (Ks~1.5-1.8)发生在1.40亿年前 [15] ，近代全基因组复制(Ks~0.15~0.3)发生在0.30~0.45亿年前 [11] [15] ，SOT基因家族的祖先基因(Ks~2.3~4.6)发生在三倍体事件之前。对蔷薇科果树SOT基因家族直系同源基因对分析发现，其Ka/ks值均小于1，结合蛋白水平和核苷酸水平的分析比较，SOT基因家族在进化过程中高度保守，因此在进化过程中纯化选择(阳性选择)在SOT基因家族中有主要作用。

4.3. PbSOTs基因的组织表达特性

果实中糖的含量由植物中的碳分配系统决定，碳分配是植物通过光合作用转化而来的化学能量的一个重要过程。梨及其它多数蔷薇科物种中“源–库”系统与多数陆生植物相比存在差异，主要体现在从“源”到“库”的迁移形式上，前者主要是山梨醇，而后者主要是蔗糖 [25] 。果实中的糖分是由糖转运蛋白从源器官通过韧皮部装载、卸载，以蔗糖或山梨醇形式运输而来的。在光合产物从叶运输到果实的过程中，有关运输糖类物质的糖转运蛋白及跨膜运输具体过程和部位引起研究者的广泛关注。苹果基因组中有17个表达的MdSOT基因家族成员，呈现各不相同的组织与时空特异性表达模式 [26] 。其中，MdSOT3、MdSOT4和MdSOT5在种子和幼果种不表达，但MdSOT3仅在成熟叶片中表达，在幼叶中检测不到表达；MdSOT4、MdSOT5不仅在幼叶和成熟叶中都有表达，而且在花和冬芽中都有表达 [6] 。MdSOT7在不同叶龄叶片中都有少量表达，且表达量基本不变；MdSOT8和MdSOT10在幼叶中基本不表达，但随着叶片的成熟表达量开始增加，老叶中的表达量最大；MdSOT9的表达模式与MdSOT8和MdSOT10相似，但当叶片衰老时表现出相反的趋势 [27] 。在梨中，我们发现PbSOT11、PbSOT12、PbSOT14、PbSOT16、PbSOT23和PbSOT24在白梨各组织中几乎都不表达；PbSOT5仅在花中表达；PbSOT4在白梨各组织中也都不表达，PbSOT7/8仅在茎、花、果中表达；PbSOT10和PbSOT13在白梨各组织中同样都不表达，PbSOT9仅在果实中表达；PbSOT6和PbSOT20在所有组织中均表达；PbSOT1/2在根、茎、花和种子中表达，而PbSOT3和PbSOT19/21和PbSOT22在根、茎、花、叶和果实中表达。比较同一组织中的基因表达水平，发现根、茎和花中存在多个表达水平较高的SOT基因，而叶、果和种子中仅存在一个表达水平极高的PbSOT20基因，且该基因在茎和花中的表达水平也极高，说明PbSOT20是梨山梨醇“源–库”迁移的主要调控基因。而在“源–库”之外的根组织中，山梨醇的转运更有可能依赖于PbSOT6和PbSOT19/21的协同作用。