1. 引言
咖啡作为饮料有着悠久的历史，适当饮用能起到消除疲劳、振奋精神、促进血液循环、提高劳动效率和思维活动能力等多种有益的功效。因此，它已成为当今人们饮食生活中的重要组成部分。另外，咖啡还有其独特的医疗疗效，如能醒脑提神、抗忧郁、抗氧化，降低发生糖尿病、肝硬化、消化道肿瘤等风险。
近年来，由于干旱和农作物疾病的影响，巴西等咖啡主要产地的咖啡产量显著下降，咖啡豆的短缺问题越来越突出。到2080年，全球咖啡产量估计将减少七成。咖啡生产大国巴西通常每年生产5500万包咖啡，而根据报告显示，2014年巴西咖啡的全年产量预计只有4500万包。在在供不应求的情况下，不少不法商贩往咖啡中掺入便宜的玉米、大麦、巴西莓果粉等物质 [1] [2] [3] [4] [5] 。尽管这些成分不会造成身体伤害，但它们会让咖啡商获得更高的利润，会影响产品质量和口感，损害消费者利益。根据国际咖啡组织(ICO)，掺假咖啡若进入咖啡市场，将给予最严重的处罚。
咖啡因其独特的风味口感及生理活性成为世界范围内最重要的食品类商品之一。咖啡的生理活性主要来自于咖啡中的咖啡因、绿原酸以及类黑精等功能性成分，目前，针对咖啡中某种成分的检测已有诸多报道 [6] - [15] 。但是因为产地、品种、生长周期等因素咖啡中具体成分会有很大范围的差异，只检测特定成分无法辨识咖啡是否掺假，只有对咖啡进行整体评价，才能准确、科学地鉴别咖啡是否掺假。目前，针对复杂样品的鉴别，国内外研究采用更多的是指纹图谱技术 [6] - [23] ，该技术可以呈现出复杂样品的“整体形态”。本文采用高效液相色谱(HPLC)技术与指纹图谱软件联用对咖啡进行掺假鉴别，建立起咖啡的标准指纹图谱，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版软件分析待测样品色谱图与咖啡标准指纹图谱的相似度，并根据相似度的计算结果鉴别咖啡是否掺假。本方法方便快捷，精密度好，鉴别能力强。
2. 材料与方法
2.1. 材料与仪器
试剂：去离子水由Milli-Q净化系统(美国Millipore公司)制得，甲醇(纯度 ≥ 99.5，分析纯)，乙醇(纯度 ≥ 99.7，分析纯)，正丁醇(纯度 ≥ 99.5，分析纯)和绿元酸标准品(纯度99.7%，CAS 327-97-9)等均为市购。
仪器：液相色谱仪–配制DAD检测器，Agilent 1200，美国Agilent公司；粉碎机(瑞典Foss KN195KnifetecTM)；离心机(德国SIGMA公司)；振荡器(德国IKA公司)。
软件：Agilent Chemstation工作站，中药色谱图分析和数据管理系统，中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版。
纯咖啡样品：由市场购置90种咖啡豆，粉碎制成纯咖啡样品。
掺假咖啡样品：将咖啡豆制作成粉，然后按不同比例加入黑大麦粉(黑大麦250℃炒制30 min，粉碎后得到)、巴西莓果粉、黑玉米粉(黑玉米烘干，粉碎后得到)制成掺假咖啡样品。
2.2. 实验方法
2.2.1. 样品前处理
精密称取1.0克纯咖啡样品或掺假咖啡样品，准确加入10 mL甲醇，剧烈震荡5 min，离心10 min，取上清液，过0.45 µm滤膜得高效液相色谱上机测试样液。
2.2.2. 色谱条件
色谱柱：Ultimate® XB-C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm)。
流动相：A相为甲醇，B相为体积分数0.1%的甲酸水溶液；流速1.0 mL/min；柱温：30℃；紫外检测波长：254 nm；流动相的梯度洗脱程序为：0~10 min，体积分数10%~15%的甲醇；10~40 min，体积分数15%~50%的甲醇；40~50 min，体积分数50%~100%的甲醇；50~55 min，体积分数100%~10%的甲醇；55~60 min，体积分数10%的甲醇。
2.3. 数据分析
采集步骤(1.2)检测所得纯咖啡样品和掺假咖啡样品的液相色谱图，用中药色谱图分析和数据管理系统和中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版进行数据分析，建立咖啡标准指纹图谱，进行峰面积相关系数法相似度、峰高相关系数法相似度、峰面积夹角余弦法相似度、峰高夹角余弦法相似度、全图谱相关系数法相似度和全图谱夹角余弦法相似度的计算。
3. 结果与讨论
3.1. 提取剂的选择
在选择样品前处理方法时，既希望尽可能多地提取咖啡的组分，又要考虑后续液相色谱测定的需要。考虑到通常饮用方法，首先尝试用水提取，但提取物十分复杂，呈棕色混悬液，离心10 min之后亦无改善，很难通过滤膜过滤，无法上机检测；水饱和的正丁醇提取成分由于糖类物质过多，导致色谱图基线显著提高，难以落平，色谱峰分离效果差，且液相色谱系统压力持续增大，多次测试会对液相色谱系统造成不利影响；考虑到糖类物质难溶于醇，所以尝试用乙醇提取咖啡组分，所得组分相对简单，也没有大量的糖类物质，但所得色谱图中除了氯原酸色谱峰比较突出外，基本无其它色谱峰，信息量太少，难以全面精确的表达咖啡的整体特征；采用甲醇提取咖啡组分，结果表明，提取物组分比较丰富，且无大量糖类物质，所得色谱图中氯原酸色谱峰突出，还有其它的不少的指纹峰，且分离度较好，信息量丰富，能够全面准确的表征咖啡本质特征，符合指纹图谱的要求，因此确定用甲醇作为咖啡指纹图谱前处理提取剂。
3.2. 流动相的选择
为了尽可能多地得到分离度较好的色谱峰，首先在很宽范围内120 min内有机流动相从5%增加到95%进行梯度洗脱尝试，结果发现，流动相的组成对色谱洗脱效果有显著影响。甲醇–水体系色谱峰响应较低，且基线不稳定，难以得到良好的色谱图；甲醇–乙酸铵体系，色谱峰的响应有所改善，但分离度不佳，众多小峰呈粘连状态；甲醇-0.1%甲酸水溶液体系，色谱峰响应高，约为甲醇–乙酸铵体系响应的两倍，且分离度较好，以绿原酸为主峰，左右各有数量不等的小峰，符合指纹图谱的要求，所以最终确定使用甲醇-0.1%甲酸水溶液体系作为流动相。在确定上述流动相体系后，在不显著降低色谱峰分离度的前提下进一步优化色谱条件，最终得到1.2.2节所述的色谱条件。
3.3. 咖啡标准色谱峰的建立
按照1.2节所述方法，采集90个纯咖啡样品的色谱图，经中药色谱图分析和数据管理系统分析处理获得咖啡标准图谱，作为对照指纹图谱，详见图1。
Figure 1. Standard fingerprint of coffee based on HPLC (the enlarge figure was the overlapping chromatograms of 1-10# coffees)
图1. 咖啡高效液相色谱标准指纹图谱(放大图为1-10#咖啡色谱图重叠结果)
3.4. 精密度实验
通过考察多次测定同一咖啡样品中主要成分绿原酸含量的结果，评价测定样品色谱图方法的精密度。首先配置绿原酸系列标准溶液，并按照1.2节所述色谱条件，建立起绿原酸的标准曲线，具体为Y = 8.56X + 0.94，R = 1.000。然后随机抽取90个纯咖啡样品中的1个样品，称取10个平行样品，并按照1.2节所述条件进行色谱测试，结合前述绿原酸标准曲线，计算出样品中绿原酸的含量。结果表明，10次平行测试结果的相对标准偏差(RSD)为3.4%，测定样品色谱图方法的精密度良好，具体数据如表1所示。
Table 1. Results of 10 times parallel measurements of chlorogenic acid content
表1. 同一样品绿原酸含量10次平行测定的结果
通过考察多次测定同一咖啡样品相似度的结果，评价测定样品相似度方法的精密度。随机抽取90个纯咖啡样品中的1个样品，称取6个平行样品，按照1.2节所述的测定样品色谱图，结合咖啡标准指纹图谱，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版计算出样品峰面积相关系数法的相似度，结果如表2和表3所示。
Table 2. Results of 17 characteristic peaks by 6 times parallel measurements HPLC fingerprint
表2. 同一咖啡样品6次平行测试液相色谱指纹图谱17个共有峰结果
Table 3. Results of similarity calculation by 6 times parallel measurements HPLC fingerprint
表3. 同一咖啡样品6次平行测试液相色谱指纹图谱相似度计算结果
由表2和表3可知，该样品的液相色谱图中17个共有色谱峰，其保留时间的相对标准偏差(RSD)均小于0.2%；峰面积的相对标准偏差(RSD)在10%以内。且液相色谱指纹图谱相似度皆大于0.99，测定样品相似度方法的精密度良好。
3.5. 相似度计算方法的选择
通过考察不同计算方法所得纯咖啡样品与标准指纹图谱相似度和掺假咖啡样品与标准指纹图谱相似度的差异，评价相似度计算方法的适用性。将黑大麦粉、巴西莓果粉、黑玉米粉按不同比例掺入咖啡样品中，得到咖啡掺假样品，按照1.2节所述的测定样品色谱图，结合咖啡标准指纹图谱，利用中药色谱图分析和数据管理系统计算出样品6种相似度。结果表明：峰面积相关系数法、峰高相关系数法、峰面积夹角余弦法、峰高夹角余弦法可以显著地反映出咖啡掺假结果。但是全图谱相关系数法和全图谱夹角余弦法效果不明显。在添加到10 wt%掺假物的情况下，全图谱相关系数法和全图谱夹角余弦法所得的相似度结果仍然居高不下，不利于结果的甄别。因此，本试验增加30 wt%和50 wt%的黑大麦粉掺假咖啡样品进行试验，结果如表4所示。
Table 4. Results of similarity calculation by using 6 methods of adulterated coffee from black barley flour
表4. 黑大麦粉掺假咖啡样品6种方法计算相似度结果
该试验中3#、4#、5#和6#为黑大麦粉掺假咖啡样品，其中5#和6#分别为50 wt%和30 wt%的大麦掺假咖啡样品，相对于其他4方法相似度在0.25以下，全图谱相关系数法相似度和全图谱夹角余弦法相似度均在0.75以上。很显然全图谱相关系数法和全图谱夹角余弦法相似度计算结果不符合纯咖啡样品相似度大于0.9，而掺假咖啡样品相似度小于0.4的标准，不适合用于鉴别咖啡方法中相似度的计算，而峰面积相关系数法、峰高相关系数法、峰面积夹角余弦法和峰高夹角余弦法适用于鉴别咖啡方法中相似度计算，且均由良好效果。
3.6. 可鉴别最小掺假量
通过考察本方法的可鉴别最小掺假量，评价本方法的鉴别能力。抽取纯咖啡样品和掺假咖啡样品组成测试组，按照1.2节所述的测定样品色谱图，结合咖啡标准指纹图谱，利用中药色谱图分析和数据管理系统计算出样品峰面积相关系数法相似度、峰高相关系数法相似度、峰面积夹角余弦法相似度和峰高夹角余弦法相似度，以纯咖啡样品相似度大于0.9，而掺假咖啡样品小于0.4为标准，确定本方法对各种掺假物的可鉴别最小掺假量，结果如表5、表6和表7所示。结果表明，本方法对黑大麦粉、巴西莓果粉和黑玉米粉可鉴别最小掺假量均低至1 wt%，具有很强的鉴别能力。
Table 5. Inspection results of minimum adulteration amount of black barley flour
表5. 黑大麦粉可鉴别最小掺假量的考察结果
表5中8#，9#，10#，11#，12#，13#样品为掺假咖啡样品，分别是含1 wt%、2 wt%、5 wt%、8 wt%、10 wt%黑大麦粉的掺假咖啡样品。测试结果满足纯咖啡样品相似度大于0.9，而掺假咖啡样品小于0.4的标准，可以确定本方法对黑大麦粉的可鉴别最小掺假量为1 wt%。
Table 6. Inspection results of minimum adulteration amount of Brazilian berry powder
表6. 巴西莓果粉可鉴别最小掺假量的考察结果
表6中1#、2#、3#、4#、5#、6#样品为掺假咖啡样品，分别是含1 wt%，2 wt%，5 wt%，8 wt%、10 wt%巴西莓果粉的掺假咖啡样品。测试结果满足纯咖啡样品相似度大于0.9，而掺假咖啡样品小于0.4的标准，可以确定本方法对巴西莓果粉的可鉴别最小掺假量为1 wt%。
Table 7. Inspection results of minimum adulteration amount of black corn flour
表7. 黑玉米粉可鉴别最小掺假量的考察结果
表7中5#，6#，7#，8#，9#，10#样品为掺假咖啡样品，分别是含1 wt%、2 wt%、5 wt%、8 wt%、10 wt%黑玉米粉的掺假咖啡样品。测试结果满足纯咖啡样品相似度大于0.9，而掺假咖啡样品小于0.4的标准，可以确定本方法对巴西莓果粉的可鉴别最小掺假量为1 wt%。
4. 结论
选择合理的提取试剂和流动相体系建立起科学可靠的测定咖啡样品高效液相色谱图的方法，利用90个纯咖啡样品建立起咖啡的标准指纹图谱，选择合理的相似度计算方法，建立起对黑大麦粉、巴西莓果粉和黑玉米粉可鉴别最小掺假量为1 wt%的一种基于高效液相色谱指纹图谱鉴别咖啡掺假的方法。本方法方便快捷，精密度好，鉴别能力强，既解决了实际检测中咖啡掺假鉴别的问题，也为高效液相色谱指纹图谱技术用于其他物种掺假鉴别提供了参考。
基金项目
国家质量监督检验检疫总局科技计划项目(2016IK054)；广东检验检疫局科技计划项目(2016GDK17)。