1. 引言
龙胆草是多年生草本植物，生长范围较广，具有清热利胆，杀菌，消炎，健胃，保肝等功效，在临床上有较多应用。龙胆草中包含许多种化学成分，其中龙胆草有效成分之一为三萜类。研究发现其兼有抗炎，抗抑郁，抗肿瘤的效果，但现有较少的关于三萜化合物提取的报道。本课题采取超声波振荡提取龙胆草中三萜化合物 [1] [2] [3] [4] ，用紫外可见分光光度法对提取物进行检测，以齐墩果酸为参照标准，用于三萜化合物含量的计算 [5] 。并且用正交试验法筛选最优提取工艺路线，为后期的药理活性研究打下基础。
2. 材料与方法
2.1. 试剂
95%乙醇(分析纯)；龙胆草购自亳州；齐墩果酸标准品(>98.9%)购于合肥博美生物科技有限公司。
2.2. 仪器
Varian Cary 100紫外可见分光光度计；超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)；中草药磨碎机(郑州驰邦机械设备有限公司)；电子天平(德国赛多利斯公司)；抽滤瓶(郑州兴华玻璃仪器厂)；容量瓶(北京玻璃仪器厂)；移液管(泰州市恒博医疗机械有限公司)；KDM型调温电热套(天津塞得利斯实验分析仪器制造厂)；圆底烧瓶。
3. 实验过程
3.1. 标准曲线的绘制 [6]
称取齐墩果酸粉末10 mg于烧杯中，加入约2 mL 95%的乙醇溶液溶解，完全溶解后转移至50 mL容量瓶中，95%乙醇定容，盖紧瓶塞，混合均匀，配成0.2 mg/mL的标准溶液。分别移取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL的标准溶液于5个编号分别为1、2、3、4、5的10 mL容量瓶中，另外移取1 mL 95%乙醇溶液至另一个10 mL容量瓶中，并将其编号为6，再用95%乙醇定容、混匀。先用0.2 mg/mL的标准溶液在200~800 nm的紫外波长下扫描，观察到在250 nm的波长处有最大紫外吸收，在此条件下，用6号空白溶液调零后，依次测定标准溶液的吸光度值，横坐标为浓度，纵坐标为吸光度值时，作浓度–吸光度值曲线，如图1所示。
校正方程Abs = 9.46294 * C + 0.03203相关系数0.99908
Figure 1. Concentration absorbance curve
图1. 浓度–吸光度曲线
3.2. 实验样品的处理
将干燥的龙胆草研碎，过筛，选用细碎的粉末，将所用的样品粉末收集于袋中，封口，保存在低温干燥处待用。
3.3. 实验操作过程
精密称取20 g龙胆草粉末于50 mL锥形瓶中，按料液比1:25加入95%的乙醇溶液，加塞，摇匀，使药材充分浸泡。
打开超声波清洗器开关，设置温度为60℃，当水温达到设置的温度时，打开超声波，将盛有样品溶液的锥形瓶放入上述水中，超声振荡2 h。反应过程中可摇晃几次锥形瓶，使药材充分受热和振荡。
反应完毕后，停止加热和振荡，取出锥形瓶，摇晃，静置，抽滤，滤液呈澄清淡黄色。将滤液倒入圆底烧瓶中，打开电热套开关，设置温度为80℃，圆底烧瓶固定在铁架台上，滤液加热被浓缩成浸膏后，用80%的乙醇将其溶解，待溶解完全后，转移到50 mL容量瓶中，再用80%的乙醇定容至刻度线，混匀，在最优吸收波长处检测吸光度值，再带入标准曲线计算浓度值，最后计算出提取率。
3.4. 三萜化合物提取率的计算 [7] [8] [9]
三萜化合物提取率(%) = 三萜化合物的浓度/龙胆草的质量*100%
3.5. 设计单因素实验
影响提取率的因素主要有反应时间、乙醇含量、料液比、反应温度，为了解各个因素变化对实验结果的影响，现采用控制变量法 [10] ，分别对单个因素进行试验，每次5组实验，记录数据，画图，获得该因素的最佳反应条件。
3.6. 正交试验的设计
根据单因素实验的结果，设计乙醇含量、反应时间、反应温度、料液比4个因素三个水平的正交试验 [11] ，探究龙胆草中三萜化合物提取的最佳工艺路线。
4. 实验结果与分析
4.1. 反应时间改变对实验结果的影响
在乙醇含量为95%、料液比为1:25 (g∙mL−1)、反应温度为60℃时，考察不同反应时间对龙胆草中三萜化合物提取率的影响，按照2.3实验操作流程，得出以下结果(见图2)。
Figure 2. Effect of extracting time on the extraction rate of triterpenoids
图2. 反应时间对三萜化合物提取率的影响
上图结果表明，当其他条件不变时，提取率随着反应时间的增加先升高后下降，在反应时间为2 h时，有最大提取率0.397%。继续延长时间后提取率下降，可能是超声时间过长破坏了三萜化合物的结构，此结论还需进一步证实。折线变化幅度较大，可知反应时间对三萜化合物的提取率影响较大，所以提取时间最好控制在2 h。
4.2. 乙醇含量变化对实验结果的影响
在反应时间为2 h、料液比为1:25 (g∙mL−1)、反应温度为60℃时，考察不同含量的乙醇对三萜化合物提取率的影响，按照2.3实验操作流程，得出以下结果(见图3)。
Figure 3. Effect of ethanol concentration on the extraction rate of triterpenoids
图3. 乙醇含量对三萜化合物提取率的影响
由以上图可得，其他条件不变时，随着乙醇浓度的增加，提取率先升高后下降，在90%乙醇含量时，有最大提取率0.409%。继续加大乙醇浓度会降低溶剂的极性，而龙胆草中三萜类具有较强的极性，所以其溶解度降低从而提取率下降。
4.3. 料液比变化对实验结果的影响
在乙醇含量为90%、反应时间为2 h、反应温度为60℃时，考察不同料液比对三萜化合物提取率的影响，按照2.3操作流程，得出以下结果(见图4)。
Figure 4. Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of triterpenoids
图4. 料液比对三萜化合物提取率的影响
由以上图可得，其他条件不变时，随着料液比的增加，提取率先升高后下降，在料液比为1:35时，有最大提取率0.510%。溶剂乙醇量的增加有助于样品基质更好地扩散，从而使样品与溶剂接触面积增大，提高提取率，但是溶剂过量会产生稀释效应会使提取率下降。
4.4. 反应温度变化对实验结果的影响
当反应时间为2 h、料液比为1:35 (g∙mL−1)、乙醇含量为90%时，考察不同反应温度对三萜化合物提取率的影响，按照2.3操作流程，得出以下结果(见图5)。
Figure 5. Effect of reaction temperature on the extraction rate of triterpenoids
图5. 反应温度对三萜化合物提取率的影响
上图结果表明，其他条件不变时，随着反应温度的增加，提取率先升高后下降，在55℃反应温度时，有最大提取率1.273%。由此可得恰当地升温有助于溶质的扩散和溶剂向样品渗透，进而有利于提高提取率。但是温度太高时会改变三萜化合物结构，使得提取率降低。
4.5. 正交试验设计
通过以上单因素实验的结果可以得到，当反应条件分别为反应时间2 h、乙醇含量为90%、料液比为1:35、反应温度为55℃时，对龙胆草中三萜化合物有最大的提取率。为最大限地设计一条反应路线得到最大提取率，现采用正交试验的方法，选取主要的四个因素，每个因素设计三个水平：乙醇含量分别为80%、85%、90%；料液比分别为1:25、1:30、1:35；超声时间分别为1.5 h、2 h、2.5 h；反应温度分别为55℃、60℃、65℃ (见表1)。按L9 (34)进行正交试验 [12] [13] [14] ，得出以下正交试验因素水平表(见表2)。
Table 1. Orthogonal factor level table
表1. 正交因素水平表
Table 2. Results of orthogonal test
表2. 正交试验数据结果
由结果可得，最佳提取工艺条件为80%乙醇、1:35的料液比、2.5 h的超声时间、65℃的反应温度，可以得出最大提取率1.578%。为检验最佳提取工艺条件的可实施性，实施三次关于最佳方案的平行实验，得出以下结果(见表3)。
Table 3. Results of optimum process conditions
表3. 最佳工艺条件验证结果
由结果可知，按A1B3C3D3方案提取龙胆草中三萜化合物的平均提取率为1.578%，高于其他方案所得的提取率，因此方案A1B3C3D3可行。
5. 实验结果讨论
由以上单因素试验得到各因素对龙胆草中三萜化合物提取率的影响为：当反应条件分别为反应时间2 h、乙醇含量为90%、料液比为1:35、反应温度为55℃时，对龙胆草中的三萜化合物有最大的提取率。从正交试验中得出对提取率的影响的4个因素，它们由小到大为：反应温度 < 料液比 < 超声时间 < 乙醇含量，且单因素实验的结果与分析的结果大致相同。为实现高的提取率，需对乙醇的含量和超声时间严格控制，可得最佳工艺条件为80%的乙醇含量、2.5 h的超声时间、1:35的料液比和65℃的反应温度。此条件下，龙胆草中三萜化合物的提取率可达最大为1.578%，这为后期进一步研究药理活性奠定了基础。
基金项目
滁州学院科研启动基金资助项目，2015qd16。