1. 引言
沙杵菇是一种生长在内蒙古自治区鄂尔多斯市准格尔旗沙漠地的野生食用菌。该地区气候干燥，地表有砾石，土壤为砂壤质草原土，因此当地生长出此类菌种十分罕见。本地农牧民喜食沙杵菇，因其味道鲜美常常用来做调味品，它外表类似棒槌，故称其为“沙棒槌”。每年夏、秋季雨后在沙漠地中不时生长出沙杵菇的菌体，由于其数量稀少而又过度采摘，导致沙漠地中野生沙杵菇数量急剧下降。迄今为止，人们尚不清楚沙杵菇的种属类别以及生物学分类地位，对其鲜美味道的呈味物质鲜也未知。当地菌菇公司为保护这一罕见菌种而对其进行了种属鉴定以及呈味物质分析，这对人工驯养沙杵菇以及进一步开发、利用和保护提供了有效的科学资料。
ITS (internal transcribed spacer)序列分析是用于食用菌分子鉴定的主要手段 [1]。ITS是真菌核糖体DNA内转录间隔区，作为非编码区，其承受的自然选择压力较小，相对变化较大，将其序列进行分析，可用于对真菌的同种属进行分类鉴定。氨基酸是蛋白质的组成成分，是人体各项生理活动不可或缺的物质，同时还是食用菌重要的呈味物质之一。食用菌中可以呈味的游离氨基酸含量丰富，每种氨基酸都必须达到它的味道阈值才会呈现出味道 [2]。呈味物质的含量与其阈值的比值称为TAV (taste activity value)值，TAV值大于1，则说明这种呈味物质对该食品的风味做出了贡献 [3]。利用髙效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)可以检测并分析呈味核苷酸 [4] 和有机酸 [5]。氨基酸分析仪是对样品氨基酸的组分含量进行分析 [6]。可溶性糖醇可以使用离子色谱法进行检测，是一种可以连续检测分离离子的方法 [7]。为了更加全面评价食用菌的鲜味，一般采用味精当量(Equivalent umami concentration, EUC)来衡量鲜味强度。味精当量表示食物中呈鲜氨基酸与呈鲜核苷酸协同作用能产生的鲜味强度相当于多少浓度味精所产生的鲜味强度 [8]。
本文采用形态学和ITS序列分析法来鉴定沙杵菇菌种，并且利用现代检测技术分析野生沙杵菇中主要呈味物质。目的为了弄清沙杵菇的生物学分类地位以及其呈现鲜美味道的原因，为沙杵菇的市场推广和今后的各项研究提供理论依据和参考资料。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
新鲜的沙杵菇样本采集于鄂尔多斯市准格尔旗布尔陶亥苏木尔圪壕嘎查沙漠地，−20℃冰箱冷冻保存。6种不同地区毛头鬼伞样本分别取自于云南、江西、上海、福建、浙江、江苏等地。
2.2. 实验药品
主要试剂：十六烷基三基溴化铵(CTAB)、乙二胺四乙酸(EDTA)、Taq DNA聚合酶、Gelview核酸染料、混合氨基酸标准溶液、17种氨基酸标准品、茚三酮溶液、混合氨基酸标准溶液、核苷酸标准液、有机酸标准品、葡萄糖标准溶液。真菌通用引物ITS4、ITS5由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR反应预混液Premix PrimeSTAR® HS购于宝日医生物技术(北京)有限公司。
2.3. 实验仪器
仪器：高速离心机、PCR仪、凝胶成像分析系统、GM-0.20隔膜真空泵、酒精喷灯、DHG-9146A电热鼓风干燥箱、日立L-8900氨基酸分析仪、超声波提取设备系统、岛津LC-20AT高效液相色谱仪、高速组织捣碎机。
2.4. 生长环境形态学观察
观察野生沙杵菇子实体的生长环境和形态，生长环境主要包括地理位置、出菇条件和周边物种等，形态主要包括观察菌盖与菌柄的外观、菌褶的颜色及其连接处的外形，测量菌盖大小、菌柄长度与宽度、菌褶的宽度等各项形态学特征 [9]。
2.5. 野生沙杵菇基因组DNA提取
采用CTAB法提取沙杵菇以及采自云南、江西、上海、福建、浙江、江苏的同类别食用菌(分别标记为：YN、JX、SH、FJ、ZJ、JS)的基因组DNA [10]。
2.6. 沙杵菇ITS序列的PCR扩增
PCR 引物：PCR所用到的真菌ITS序列通用引物ITS4、ITS5均由生工生物工程(上海)有限公司合成，序列如下：ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；ITS5:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ [9]。PCR扩增：50 μl扩增反应体系：25 μl Premix PrimeSTAR® HS、1 μl稀释的沙杵菇基因组DNA、1 μl引物ITS4、1 μl引物 ITS5、22 μl蒸馏水。扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min 45 s，35个循环；72℃延伸10 min。
2.7. PCR扩增产物的检测
PCR扩增产物检测用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法来分析，检测完毕后将PCR扩增产物送往华大基因测序，将结果在NCBI上做BLAST对比，记录下同源性较高的物种，确定沙杵菇的生物类别。
2.8. 野生沙杵菇系统发育研究
将7种测序结果和从NCBI中搜索到的10种同源性较高的序列进行比对，并辅以人工校对截取序列。将截取后的序列用MEGA-X软件采用最大邻接法构建进化树。
2.9. 沙杵菇呈味物质分析和鲜味评价
2.9.1. 游离氨基酸测定
参考Wen Li [11] 的方法并适当修改对氨基酸进行提取，使用L-8900氨基酸分析仪测定氨基酸含量。
2.9.2. 主要呈味核苷酸测定
参照S. Beluhan [12] 的方法提取核苷酸，使用LC-20AT高效液相色谱仪测定核苷酸含量。
2.9.3. 有机酸测定
参考张陈 [13] 提取有机酸，使用LC-20AT高效液相色谱仪测定有机酸含量。
2.9.4. 可溶性糖测定
参照薛俊杰 [14] 的方法对样本进行提取，采用LC-20AT高效液相色谱仪测定可溶性糖。
2.9.5. 鲜味评价
使用味精当量(Equivalent umami concentration, EUC)来评价沙杵菇的鲜味强度，根据所测量的呈鲜氨基酸和呈鲜核苷酸的数据代入公式EUC = ∑aibi + 1218 (∑aibi) (∑ajbj)，计算出沙杵菇的鲜味强度 [15]。EUC为味精当量，g MSG/100g；ai 为鲜味氨基酸(Asp或Glu)的浓度，g/100g；bi为鲜味氨基酸相对于MSG的相对鲜度系数(Glu = 1, Asp = 0.077)；aj为呈味核苷酸(5’-IMP、5’-GMP、5’AMP、5’-XMP)的浓度，g/100g；bj为呈味核苷酸相对于IMP的相对鲜度系数(5’-IMP = 1, 5’-GMP = 2.3, 5’-AMP = 0.18, 5’-XMP = 0.61)；1218为协同作用常数 [16]。
2.9.6. 野生沙杵菇氨基酸营养价值评价
根据FAO/WHO建议的氨基酸模式和全鸡蛋蛋白质的氨基酸模式，氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS)分别按以下公式计算：AAS = aa/AA(FAO/WHO)；CS = aa/AA(Egg) [17]。[式中：aa为试验样品氨基酸含量(mg/g)；AA(FAO/WHO)为FAO/WHO评分标准模式该种氨基酸含量(mg/g)；AA(Egg)为鸡蛋蛋白质中该种氨基酸含量(mg/g)。]必需氨基酸指数(EAAI)根据下列公式计算：EAAI = (100异亮氨酸t/异亮氨酸s × 100色氨酸t/色氨酸s × 100亮氨酸t/亮氨酸s × 100苯丙氨酸t/苯丙氨酸s) 1/n。[n为比较的氨基酸数；t为实验蛋白质的氨基酸含量；s为标准蛋白质的氨基酸含量。]
3. 结果与分析
3.1. 野生沙杵菇的分类鉴定
3.1.1. 生长环境和形态学描述
沙杵菇采集地位于鄂尔多斯市准格尔旗西北部的沙漠地，该菌株每年夏秋季，天气转凉的雨后出菇，生长地主要是长满蒿属植物的沙地。
沙杵菇子实体菌盖为圆柱形，高约10 cm，直径约4 cm，菌盖与菌褶表面为白色或浅灰色，较为光滑，颜色随成长逐渐加深，菌盖表皮开裂成鳞片状。菌柄为细长的白色光滑圆柱体，根部粗壮，长度约15 cm，直径约2 cm。菌肉呈白色，孢子呈黑色，椭圆形(见图1)。初步判断沙杵菇属于毛头鬼伞。
Figure 1. Morphological map of shachu mushroom
图1. 沙杵菇形态图
3.1.2. PCR扩增产物的检测与分析
用真菌ITS通用引物ITS4和ITS5对沙杵菇进行了PCR扩增获得了在500~750 bp之间的单一条带(见图2)。
Figure 2. The PCR result of ITS of shachu mushroom. M: DL5000 Marker; 1: PCR results of shachu mushroom
图2. 沙杵菇ITS序列PCR结果。M：DL5000 Marker；1：沙杵菇PCR结果
3.1.3. ITS序列分析
PCR扩增产物经华大基因测序，得到633 bp的沙杵菇ITS序列(见图3)。经BLAST比对得到相似度较高的序列全部来源于鬼伞属的毛头鬼伞，最高相似度可达98%。为构建这株鬼伞属的系统发育树，从NCBI上下载其他10个相似度最高的毛头鬼伞序列(登录号为：JF907838.1、MN622775.1、EU326221.1、KX015766.1、FJ501551.1、EU520190.1、EU520139.1、JQ901433.1、KR733588.1、JQ901440.1)。
Figure3. Base sequence in the ITS region of shachu mushroom
图3. 沙杵菇ITS区域碱基序列
3.1.4. ITS序列琼脂糖凝胶电泳检测
经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，可以看到以CTAB法提取的6份来自不同地区的毛头鬼伞基因组 DNA为模板PCR扩增的ITS序列均在750 bp左右，条带单一明亮，无拖尾(见图4)。
Figure 4. ITS sequence of 6 areas of the Coprinucomatus. M: DL5000 Marker; 1~6: The PCR results of Coprinucomatus ITS sequences were obtained from Yunnan, Jiangxi, Shanghai, Fujian, Zhejiang and Jiangsu
图4. 6个地区毛头鬼伞ITS序列PCR扩增结果。M：DL5000 Marker；1~6：分别为云南、江西、上海、福建、浙江、江苏毛头鬼伞ITS序列PCR结果
3.1.5. 测序结果和BLAST序列比对结果分析
将沙杵菇ITS序列与6份不同地区采集的毛头鬼伞ITS序列以及NCBI上相似度最高的10个毛头鬼伞ITS序列进行对比。沙杵菇ITS序列和6分不同地区采集的毛头鬼伞(Coprinu comatus)的ITS序列同源性高达100%，与NCBI上毛头鬼伞ITS序列同源性最低为97%。
3.1.6. 系统发育分析结果
NCBI上选取与沙杵菇ITS序列相似度最高的10株毛头鬼伞，以及从6个不同地区(浙江、江苏、云南、上海、福建、江西)采集的毛头鬼伞，使用MEGA-X软件，采用最大邻接(Neighbor-Joining method)法构建系统发育树(见图5)。由系统发育树可以看出，17份毛头鬼伞分为两大支。沙杵菇与来自江西、上海、江苏、福建、云南、浙江的毛头鬼伞聚为一支，其中与来自江西的毛头鬼伞亲缘关系最为接近，而数据库中相似性最高的10株被聚在另一支。
Figure 5. A phylogenetic tree of shachu mushroom based on ITS sequence
图5. 基于ITS序列构建的沙杵菇系统发育树
3.2. 沙杵菇呈味物质分析和鲜味评价
3.2.1. 游离氨基酸
沙杵菇样品中呈鲜氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)和呈甜氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸)含量丰富，占游离氨基酸总量的41.44%，各组分浓度均大于味道阈值，说明呈味氨基酸对于沙杵菇的鲜美口感有较高贡献(见表1)。
Table 1. The contents of fresh and sweet amino acids in shachu mushroom
表1. 沙杵菇中呈鲜和呈甜氨基酸含量
注：鲜味(Asp + Glu)；甜味(Ser + Gly + Thr + Ala + Pro)；苦味(His + Ile + Leu + Phe + Arg + Met + Val)；无滋味(Cys + Lys + Tyr)。
3.2.2. 主要呈味核苷酸
沙杵菇中含有较为丰富的5’-腺苷酸和5’-鸟苷酸，未检出5’-肌苷酸，其中5’-鸟苷酸超过阈值对沙杵菇的呈鲜有一定贡献(见表2)。
Table 2. The content of 5’-nucleotide in shachu mushroom
表2. 沙杵菇中5’-核苷酸的含量
3.2.3. 有机酸
沙杵菇鲜样和干样中有机酸含量丰富，乙酸与柠檬酸的含量显著，其次是苹果酸和丁二酸，酒石酸、抗坏血酸、富马酸在沙杵菇含量稍低(见表3)。
Table 3. The contents of various organic acids in the shachu mushroom
表3. 沙杵菇中各种有机酸的含量
3.2.4. 可溶性糖
经过检测，沙杵菇内可溶性糖的含量为4.5%。
3.2.5. 鲜味评价
经过计算得出，沙杵菇的EUC值为37.43 g MSG/100g。其含义为每1 g沙杵菇干粉所能产生的鲜味强度相当于0.3743 g味精所产生的鲜味。EUC值被分为4个水平：第一水平为 1000 g MSG/100g干重以上，第2水平为介于100~1000g MSG/100g干重，第3水平为介于10~100g MSG/100g干重，小于10 g MSG/100g属第4水平 [18]。可以看出沙杵菇属于第3水平。
3.2.6. 野生沙杵菇氨基酸营养价值评价
沙杵菇总氨基酸含量丰富，共检测到17种氨基酸(色氨酸未检测)，其中人体必需氨基酸7种，非必需氨基酸10种。必需氨基酸含量占总氨基酸含量的49.73%，总氨基酸含量有11.369 mg/100mg干样品(见表4)。参考FAO/WHO提出的理想模式，必需氨基酸含量在40%左右的蛋白质质量较优。沙杵菇蛋白质氨基酸属优质蛋白食材，是一种氨基酸含量丰富的营养食品。按照FAO/WHO的标准和全鸡蛋模式，沙杵菇的EAAI分别为139.17和105.69 (高于常见的松蘑：74.46、肉蘑：86.83、牛肝菌：70.97)，说明沙杵菇中必需氨基酸比例较适宜，容易被人体消化和利用。由AAS和CS可知，沙杵菇的第一限制氨基酸是赖氨酸，第二限制氨基酸是亮氨酸(见表5)。
Table 4. Total amino acid content of shachu mushroom
表4. 沙杵菇样品总氨基酸含量
Table 5. AAS, CS and EAAI of the shachu mushroom
表5. 沙杵菇的AAS、CS、EAAI
4. 讨论与结论
食用菌种类繁多，形态易受环境因素影响，很多种类用传统方法难以鉴别。ITS序列是真核生物核糖体内转录间隔区，属非编码区，因此承受自然选择的压力较小，可以存在更多变异，用于区分关系很近的种。本实验通过传统形态学鉴定结合ITS序列分析技术明确了生长在内蒙古西部地区沙漠中沙杵菇的种属关系，系统发育树显示沙杵菇与中国江西的毛头鬼伞亲缘关系较近，基本明确了野生沙杵菇的生物学地位。通过系统发育树，发现江西、上海、江苏、福建、云南、浙江的毛头鬼伞聚为一类亲缘关系较近，NCBI上序列同源性高度相似的毛头鬼伞亲缘关系较远。
野生沙杵菇呈鲜氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)含量达0.695 g/100g，呈甜氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸)含量达2.494 g/100g。游离氨基酸是食用菌最主要的呈味物质之一，很多食用菌是因为其游离氨基酸含量高而具有特殊的鲜味。张璐等研究显示，常见食用菌如香菇，呈鲜和呈甜氨基酸含量分别为0.113 g/100g、0.316 g/100g，远低于野生沙杵菇的含量。因此，我们通过检测游离氨基酸含量，发现远高于常见食用菌的游离氨基酸含量是野生沙杵菇独特鲜味的物质基础 [19]。野生沙杵菇中5’腺苷酸和5’-鸟苷酸含量分别为0.135 mg/g和0.250 mg/g。呈味核苷酸与谷氨酸、天冬氨酸一起呈现鲜味，一些常见的香菇中，这两种核苷酸含量为0.35 mg/g和1.23 mg/g。可见呈味核苷酸虽然参与了形成沙杵菇的鲜味，但与其他常见食用菌相比，野生沙杵菇呈味核苷酸含量并不突出。因此，可以断定呈味核苷酸对野生沙杵菇鲜美味道形成有贡献，但作用较小。
沙杵菇中有机酸含量丰富，乙酸与柠檬酸的含量显著高于其他几种有机酸，其中乙酸通常作为增香剂使用，这两种有机酸可能对沙杵菇风味的形成起到了一定的作用。苹果酸和丁二酸含量次之，苹果酸香菇的鲜味强度有关 [20]，丁二酸与钠离子形成的盐类物质可呈现出鲜味，因此这两种有机酸在一定程度上参与了沙杵菇鲜美口感形成。酒石酸、抗坏血酸、富马酸在沙杵菇含量低，酒石酸作为食品添加剂的主要作用是抗氧化，抗坏血酸就是维生素C，富马酸与柠檬酸一样都是常见的酸味剂，它们在一定程度上影响了沙杵菇的口感。有研究表明，口蘑中主要有机酸是乙酸、琥珀酸、草酸、苹果酸、焦谷氨酸、一酮戊二酸延以及胡索酸，其中琥珀酸与草酸的含量在数种有机酸中占优势；香菇中的有机酸含量最高的是苹果酸，还含有少量的琥珀酸和柠檬酸。因此，不同的食用菌所含有机酸种类和含量不一，野生沙杵菇在有机酸种类和含量上与其他食用菌的差异，也是造成其独特口感的原因之一。
野生沙杵菇内可溶性糖的含量为4.5%。有研究显示，在一些常见食用菌中，平菇可溶性糖达6.9%，香菇达5.3%，黑木耳达2.9%。可溶性糖与呈甜氨基酸一样都是食用菌内呈现甜味的物质。中国人的烹饪习惯中，食用菌常用来炒菜、煲汤等，烹饪过程中常放入大量食盐，使得食用菌内甜味并不呈现出来。食用菌中的一些甜味物质的存在可以掩盖一些不愉快的味道，如呈现苦味的游离氨基酸常常不能表现出味觉活性，就是因为甜味物质的作用，这样会有助于提升食用菌的整体风味。其中一些甜味物质含量较高的食用菌，食用起来往往会有爽口的甜味。所以可溶性糖的存在也为形成沙杵菇的整体口感，做出了一定的贡献。
氨基酸是食物中重要的营养物质，其种类和含量直接反映了食物的营养价值。本实验研究通过对野生沙杵菇总氨基酸种类和含量测定，计算出各氨基酸的氨基酸评分、化学评分。计算了野生沙杵菇的必需氨基酸指数，在FAO/WHO的标准和全鸡蛋模式下，必需氨基酸指数分别为139.17和105.69。与一些其他食用菌和常见的普遍认为蛋白质含量比较高的食材相比，沙杵菇的氨基酸营养价值较为突出 [21] [22] [23]。
综上所述，野生沙杵菇是一种氨基酸营养价值较高的食物。
基金项目
内蒙古准格尔旗科技局科技计划项目(2019008)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。