1. 前言
自然流产(spontaneous abortion, SA)是临床常见的异常妊娠，反复自然流产极大地影响着育龄妇女的身心健康。复发性流产(recurrent spontaneous abotion, RSA)是指妊娠早期连续三次(包括三次)以上的自然流产，其发生率逐年上升，目前占所有女性发生自然流产的15%~20% [1]。导致流产的因素非常复杂，除最常见的遗传因素、内分泌因素、免疫因素、感染性疾病及血栓性疾病等之外，尚有约半数患者流产原因不明，称不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA) [2] [3] [4] [5] [6]。URSA的病因病机复杂多样，现代医学的发展必须从全新的领域探索复发性流产的发病机制。
H19就是人类最早发现的印记基因之一，父源印记而母源表达，参与染色体沉默及修饰、基因组印记印象、转录激活等，进而影响了许多重要的生物过程。本研究通过比较URSA患者的绒毛组织和正常妊娠者的绒毛组织二者印迹基因H19单核苷酸多态性方面的差异，从而深入地探讨URSA的发病机理，为临床诊治开拓新的思路。
2. 资料与方法
2.1.标本来源
选取2020年1月~2021年3月在本院就诊的URSA患者再次妊娠胚胎停育行人工流产术的患者34例(观察组)，同期要求行人工流产术正常早期妊娠者42例(对照组)。观察组纳入标准：① 有3次及3次以上自然流产史，② 单胎妊娠，③ 2次及以上B超证实宫内胚胎无心管搏动。④ 女方无基础疾病：例如高血压病、糖尿病、肾脏系统疾病、心脑血管系统疾病、甲状腺疾病、自身免疫性疾病；前1月内未患感染性疾病，亦未服用过任何药物；无生殖道畸形；无生殖道感染；内分泌激素均正常；月经周期规律，有正常的排卵；抗子宫内膜抗体、抗精子抗体、抗心磷脂抗体、抗核抗体等阴性。⑤ 妊娠前３个月未进行免疫治疗和疫苗接种。⑥ 男方精液检查正常。夫妻双方染色体核型分析正常，无家族遗传病史。⑦ 流产绒毛染色体检查正常。对照组纳入标准：① 同期在我院妇科就诊的健康妇女，均排除以上疾病，且无不良孕史。② 至少有1次或以上正常分娩史。③ 均经盆腔B超检查证实。④ 无妊娠高危因素，自愿要求终止妊娠。
本研究经本院伦理委员会审核并批准。所有研究对象及家属均签署知情同意书。
2.2. 标本采集及处理
上述患者均于人工流产时留取绒毛组织，尽早行基因组DNA提取或−80℃冰箱保存。
DNA提取采用：TIANNamp Genomic DNA Kit基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司，目录号DP304，采用可以特异性集合DNA的离心吸附柱和缓冲液系统。提取基因组DNA，溶解于保存液(dd H2O)，置−20℃冰箱保存。
2.3. 基因型分析
利用Taqman探针实时荧光PCR分型等位基因技术(ABI公司)分析上述基因SNP位点。PCR反应和基因分型在荧光定量PCR仪上完成PCR反应体系。
2.4. 统计学处理
采用SPSS19.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，以p < 0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. 受试者临床基础指标
URSA组及对照组患者年龄、孕周及BMI均无明显差异(p > 0.05，表1)。
Table 1. Basic clinical indexes of subjects
表1. 受试者临床基础指标
3.2. Hardy-Weinberg平衡检验
URSA组及对照组的H19基因rs217727、rs2107425、rs3741219位点的检测结果显示：满足Hardy-Weinberg平衡定律，差异无统计学意义(p > 0.05)，证明研究对象具有样本代表性。
3.3. H19基因rs217727位点情况分析
URSA组H19基因rs217727 GG基因型频率为55.8%，高于对照组26.2%，G等位基因频率为74.6%，同样高于对照组50%，两组人群中该位点基因型、等位基因分布情况差异具有统计学意义(p < 0.05)。H19基因rs2107425、rs3741219位点基因型、等位基因的分布情况差异无统计学意义(p > 0.05)。见表2。
Table 2. Comparison of genotype and allele frequency of SNP locus of H19 gene between the two groups
表2. 两组H19基因SNP位点基因型及等位基因型频率的比较
4. 讨论
目前，由于我国许多城市均出现人口负增长，因此降低复发性流产的发生率势在必行，然而，目前尚无明确的预测复发性流产的指标，以及有效提高治疗成功率、预防复发性流产的方法。因此，基因干预已成为学者的研究热点之一。
印记基因在人类生长发育过程中起着重要作用。以往研究证实，印记基因在胚胎生长和肿瘤发生中起重要作用。目前，印记基因在自然流产机制研究中的作用已受到重视。印记基因不符合孟德尔遗传学的规律，是仅依赖单亲的基因进行相关表达。相关研究结果表明，印记基因在哺乳动物胚胎发育进程中起到重要作用，印记基因功能异常很容易导致胎儿发育不良，严重者易导致死产。
印记基因H19属于长链非编码RNA，位于人类染色体11p15.5，在胚胎发育过程中，主要在内胚层和中胚层来源的组织中表达,出生后主要表达于心肌、骨骼肌、乳腺、子宫、卵巢和睾丸 [7]。既往关于印记基因H19的研究，多集中在恶性肿瘤的发生、发展和代谢等方面。WU等 [8] 与赖慧超等 [9] 研究结果均提示LncRNA H19的高表达可能与上皮性卵巢癌的发生与进展密切相关。通过相海云等 [10] 的研究，发现H19在宫颈癌组织中高表达，可通过抑制H19的表达从而抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力。
许多研究指出，H19还与精子及胚胎的生长发育有关。Clealon MA等 [11] 在动物实验中敲除胚胎的H19基因，导致胚胎死亡，进而得出胚胎发育及胎盘形成均可能与H19有关等结论。精子和卵子都是胚胎发育过程中不可缺少的部分，任何一方异常均能极大地影响胚胎发育，所以部分关于H19的研究围绕精子进行。例如李建波等 [12] 发现精子浓度及畸形率会影响H19甲基化水平，H19可通过影响精子质量从而调控胚胎生长发育。Santi等 [13] 通过分析18项临床研究，发现不育患者精液中H19甲基化平均水平明显低于正常对照，这表明H19可能在精子发生中扮演重要角色。
近年来，H19引起了越来越多的关注，很多研究表明H19基因在复发性流产中的作用不容忽视。Bai Ruxia等 [14] 通过多种实验发现长链非编码RNA H19通过调节Bcl-2、Bax和磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶的表达促进细胞凋亡，从而在SA中发挥重要作用。崔进等 [15] 的研究结果显示，LncRNA H19在RSA患者的胚胎组织中的高表达，引起了基因表达缺陷、细胞增殖异常等，从而导致RSA发生。然而He [16] 等的研究结果却与之相反，他们发现在RSA患者绒毛组织中，H19和ITGB3的表达均下降，故总结出H19的低表达是导致胚胎植入受阻和不良妊娠结局发生的原因之一。
上述证据表明印记基因H19可能在胚胎生长发育过程中扮演积极的角色，本研究结果中自表2可以看出，rs217727 GG基因型频率为55.8%，高于对照组(26.2%)，G等位基因频率为74.6%，同样高于对照组(50%)，两组人群中该位点基因型、等位基因分布情况差异具有统计学意义(p < 0.05)。H19基因rs2107425、rs3741219位点基因型、等位基因的分布情况差异无统计学意义(p > 0.05)。故考虑H19基因rs217727位点SNP可能与不明原因的复发性流产发生相关。由此分析，H19基因rs217727位点对流产的发生具有一定的相关性，H19基rs2107425位点、rs3741219位点与流产发生的暂无明显相关性。故得出结论：H19基因的单核苷酸多态性可能在URSA中发挥着重要作用。
目前关于H19与URSA相关性的报道多集中于相关性观察，对于妊娠结局的改善研究不足，但随着研究的深入，H19的作用机制将更加明确，将为URSA的诊断及治疗提供有效依据 [17]。绝大多数关于复发性流产的诊断均侧重于病因诊断，故治疗前应进行系统全面的病因筛查，H19基因的SNP筛查可考虑用于原因不明的流产人群，对于存在基因异常者进行个性化治疗。但本研究标本量较少，且并未明确相关具体机制，今后还需加强研究，进行更入的调查分析。
基金项目
山东省医药卫生科技发展计划项目。
NOTES
*通讯作者。