1. 引言
随着工业化进程的加快，环境污染加剧，重金属暴露愈来愈多。重金属毒物在生物体内蓄积会影响细胞的正常生理功能，主要是通过引起DNA损伤及蛋白质构象的改变，进而触发细胞凋亡、细胞周期改变以及细胞的恶性转化。镉被世界卫生组织的国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)认定为I类致癌剂。环境中镉对生物体包括人类有毒，它污染大气、水体、或者土壤，经由呼吸、接触、以及食物进入体内，即使低水平的暴露也会造成较大的健康损害 [1] [2]。
多年来，研究人员研发出各种基于微生物、植物、昆虫与哺乳细胞培养的短期测试体系，用于筛选环境中致突变、致畸和致癌(统称为“三致”)的物质。Ames试验是基于沙门氏菌的回复突变测试系统，在检测化学物质的致突变性方面有敏感、便捷的优点。大量证据表明超过90%致突变剂具有已知的致癌性，而且Ames试验体系对已知的非致癌剂没有响应。然而Ames试验存在不足：首先，检测不同类型的突变原需要几种菌株；其次，许多作用于DNA、抑制DNA复制、致细胞死亡的物质对致突变性仅有微弱的直接影响，标准的Ames试验检测不出这些物质的致突变性；最后，Ames试验在细菌中进行，细菌基因组结构、遗传调控与代谢完全不同于真核细胞。因此，亟需建立起基于不同生物概念与生物体的遗传毒测试体系。
根据许多导致DNA损伤的物质都具有致突变性，在一定剂量范围能诱发真核细胞微核现象的发生，本研究选择了模式生物裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)作为研究对象，通过构建DNA损伤的标志基因Rad22 C端带荧光标记的酵母细胞株Rad22-GFP，以对数期的酵母胞内GFP荧光点(DNA修复灶)作为评价终点，观察并比较镉暴露、以及未经暴露的酵母细胞中该荧光点的发生频率，进而监测环境中镉导致的健康风险。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2.1.1. 培养基、菌种与质粒
裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)菌株PT 286为本实验室保藏的野生型(WT)单倍体，SPBC776.03Δ是SPBC776.03基因敲除的单倍体细胞株，为本实验室前期构建并保藏；裂殖酵母日常培养采用YE5S (Yeast extract with5 supplements)培养基：5 g/L酵母提取物，30 g/L葡萄糖，225 mg/L亮氨酸，225 mg/L组氨酸，225 mg/L赖氨酸，225 mg/L腺嘌呤，225 mg/L尿嘧啶)；大肠杆菌感受态DH5α菌株购自天根生化科技(北京)公司；含人工微型染色体的裂殖酵母CF824菌株、质粒pFA6a-GFP KanMX6由宾夕法尼亚大学医学院Phong Tran教授惠赠。
2.1.2. 试剂
Taq DNA polymerase、dNTPs、T4 DNA 连接酶、PrimeScriptTM first-strand cDNA synthesis kit、DNA marker DL2000购自TaKara公司；pfu DNA polymerase、2×SYBR RealUniversal Premix、质粒小提试剂盒、酵母基因组提取试剂盒、DNA marker D15000购自天根生化科技(北京)公司；KOD DNA polymerase购自东洋纺(TOYOBO CO.，日本)公司；引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；抗生素G418 (也称遗传霉素)、诺尔丝菌素分别购自生工生物工程(上海)有限公司、北京中成谨念科技有限公司，溶壁酶Lyticase购自生工生物工程(上海)有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxiod公司，CdSO4 (481882)购自Sigma-Aldrich公司。
2.1.3. 仪器
SimpliAmp™ PCR仪(ThermoFisherScientific Co.，美国)，ABI 7500 real-time PCR仪(ABI Life Technologies，美国)，荧光显微镜(奥林巴斯Olympus，日本)，分光光度计(翱艺仪器上海有限公司)，全自动数码凝胶成像仪(上海培清科技有限公司)。
2.2. 实验方法
2.2.1. 构建Rad22 C端带荧光标记的酵母株Rad22-GFP
1) 用于酵母同源重组的GFP-kanMX6 DNA片段的扩增与纯化
酵母中DNA损伤由其染色体上C端荧光标记的Rad22来指示 [3]。本研究采用同源重组技术在其染色体Rad22基因(下游) 3'端带上GFP基因标签，使得Rad22-GFP在基因组内源性启动子控制下融合表达。参照Bähler et al.方法 [4]，以质粒pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6为模板PCR扩增得到GFP-kanMX6 module (图1)用于后续的同源重组，该PCR所用的引物5'端为靶基因Rad22特异性同源臂[Rad22-GFP5 KanMX-Fwd：5' (AACAAATTCTGATCCTCAGTCGGCAATGAGGTCGCGAGAAAACTACGATGCTACG GTGGATAAGAAAGCCAAAAAAGGA)-CGGATCCCCGGGTTAATTAA3'；Rad22-GFP5KanMX-Rev: 5' (TAAACAAATCATTAGTCATAAAACAGAAAATACTTGGTAAAAAACAAGTTGCCAATCATCACATTTTGCCTCATTACTT)-GAATTCGAGCTCGTTTAAAC-3'，圆括弧里序列表示与酵母染色体基因同源序列，下划线处分别是质粒pFA6a-GFP-kanMX6骨架上限制性内切酶BamHI, PacI以及EcoRI, PmeI位点序列]；0.85%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收GFP-kanMX6 DNA片段；回收纯化的GFP-kanMX6 DNA每3管合并成1管，溶于10μl TE缓冲液(pH 8.0)中，进行后续的转化实验。
Figure 1. The GFP-KanMX6 module of plasmid pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6
图1. 质粒pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6上的GFP-kanMX6组件
2) 基于乙酸锂化学法的酵母转化
采用乙酸锂化学法转化酵母感受态(野生型菌株PT 286、以及SPBC776.03Δ)，涂布YE5S琼脂平板，30℃，18 h培养长出菌苔之后，影印转接到含100 μg/ml G418的YE5S平板上，30℃继续培养2~3天；挑取G418抗性转化子，于YE5S/G418液体培养基中200 rpm振荡培养约12 h，采用酵母基因组提取试剂盒，按照操作说明提取转化子的基因组DNA，进行colony PCR鉴定。将鉴定成功的转化子分别−80℃冷冻保存于20%甘油(v/v)。
2.2.2. 荧光显微镜观察DNA修复灶
分别接种Rad22-GFP/PT286 (野生型)以及Rad22-GFP/SPBC776.03D (敲除株)细胞于5 mL YE5S液体培养基中，25℃培养直到对数生长期中期。收获细胞、离心、弃上清，将离心管中细胞团(沉淀)以及少量YES培养基置于冰上，取2 µL细胞悬液于载玻片上，盖上22 mm × 22 mm盖玻片。荧光显微镜下观察~200个细胞，拍照。
2.2.3. SPBC776.03敲除株(SPBC776.03D)的微型染色体丢失测定
微型染色体丢失检测根据Niwa et al.方法 [5] 稍加改进：CF824菌株是含有额外的人工微型染色体(Ade+，G418抗性)的酵母单倍体，基于CF824菌株与染色体分离异常的菌株杂交后，后代由于染色体分离异常，微型染色体(mini-chromosome)无法平均分配到两个子细胞中，导致一部分子细胞在缺乏腺嘌呤(Ade−)的YE4S平板无法正常生长，从而出现红色菌落。据此对有丝分裂染色体分离异常菌株进行快速筛查、鉴定。细胞计数采用OD600监测，将含有人工微型染色体的细胞约600个，涂布于YE4S (Ade−)平板，30℃培养3 d。出现的粉红色菌落占总菌落的比率代表着有丝分裂中染色体分离异常事件的频率。
2.2.4. 实时荧光定量PCR (qPCR)
采用SYBR green实时荧光定量PCR方法测定酵母在Cd暴露下的SPBC776.03基因转录水平，实验组的酵母液体培养中Cd2+终浓度100 μM，未经Cd处理的酵母野生株PT 286作为对照。收获对数生长期的酵母细胞，用TRIzol试剂提取总RNA；总RNA (3μg)通过PrimeScriptTM第一链cDNA合成试剂盒、按照试剂盒说明书进行反转录得到相应cDNA；荧光定量PCR检测SPBC776.03的qPCR引物如下：Primer-Fwd-SPBC776.03：5'-ACTGCCTCTGAAGCAATCGCT-3'，Primer-Rev-SPBC776.03：5'-TTTAC GAGCGACATCCATGCC-3'；以看家基因β-actin作为内参，其用于qPCR的引物如下：Primer-Fwd-actin：5'-GGATTCCTACGTTGGTGAAGCTC-3'；Primer-Rev-actin：5'-GGGTTCAAAGGAGCCTCAAAC-3'；每次qPCR取1 μL cDNA作为模板，用2×SYBR RealUniversal Premix建立20 μL反应体系：2×SYBR RealUniversal Premix 10 μL，一对引物(10 μM)各0.6 μL，cDNA模板1 μL，RNase-free dd H2O 7.8 μL。在ABI 7500 real-time PCR仪上按照以下反应参数运行：95℃预变性15 min，40循环的95℃ 10 sec，55℃ 20 sec，72℃ 32 sec。实验组与对照组各4个生物学样品重复，每轮qPCR反应每个样品至少3个复孔。采用Nature Protocols (2008)报道的相对Ct法(6)对基因转录水平进行相对定量，即通过计算Cd暴露组(实验组)与未经Cd处理组(对照组)的2^ − DCt = 2^ − (CtTarget − Ctβ-actin)的比值，来探讨Cd胁迫对酵母SPBC776.03转录水平的效应。
3. 结果与分析
3.1. Rad22 C端携带GFP标签的酵母株(Rad22-GFP)构建
1) 用于同源重组的GFP-kanMX6片段的扩增
以质粒pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6为模板进行PCR扩增，得到GFP-kanMX6 module DNA片段；引入KanMX抗生素抗性标记是为了方便后续的转化子筛选；更为重要的是，设计基因特异性的长引物以便PCR产物能与酵母Rad22基因3'-末端序列通过同源重组而实现交换，即GFP-kanMX6标签镶嵌到Rad22蛋白C端。这一对PCR引物5'端为靶基因Rad22特异性的同源臂(~80 bp长，详见实验方法1.2.1)；根据文献 [4]，PCR扩增产物应为两端带有同源臂序列(酵母基因组上紧挨靶基因Rad22终止密码子的上下游对应序列)、中间为源于pFA6a-GFP(S65T)-kanMX6质粒的GFP-kanMX6组件DNA，长度约2.6 kb。
通过以上设计的PCR引物，采用高保真的KOD DNA聚合酶进行扩增，PCR热循环参数为：94℃预变性4 min，30循环的98℃ 15 sec，66℃ 5 sec，72℃ 40 sec，最后72℃延伸10 min，PCR产物经0.85%琼脂糖凝胶电泳得到条带符合预期(图2，~2.6 kb)，说明用于同源重组的GFP-kanMX6组件DNA扩增成功。3管样品目标条带经割胶回收后合并成1管，用于后续的转化实验。
Figure 2. Electrophoresis of GFP-KanMX6 DNA fragment that was PCR-amplified using pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 as the template. The resulting PCR products were loaded on the 0.85% agarose gel. Th left lane was DNA marker D15000 (M/bp) and S1~S3 represented sample No.1~3; the GFP-KanMX6 DNA fragment was obtained by PCR amplification as expected, which was marked by the yellow rectangle in the gel
图2. 以质粒pFA6a-GFP(S65T)-kanMX6为模板扩增GFP-kanMX6片段的电泳图，PCR产物上样0.85%琼脂糖凝胶，最左边为DNA marker D15000 (M/bp)，S1~S3为1~3号样品；黄色框内表示约2.6 kb大小的电泳条带，符合预期，即为GFP-kanMX6片段，可用于后续转化
2) 阳性转化子Colony PCR鉴定
转化实验中在YE5S/G418影印平板上出现的抗性转化子，接种于2 mL YE5S/G418液体培养基中培养11 h~12 h至其OD600 ≈ 0.5，用酵母基因组提取试剂盒，提取其基因组DNA，然后进⾏Colony PCR鉴定及琼脂糖凝胶电泳；Colony PCR所用的正向引物GFP-F：5'-GGTCCTTCTTGAGTTTGTAAC-3'、与GFP-kanMX6组件上GFP相匹配的序列(图3(a))，反向引物Rad22-R-GFP-C-tag：5'-CATCGTAGTTTTCTC GCGACC-3'、与Rad22基因末端距终止密码子50 bp~30 bp处对应。Colony PCR鉴定结果如图3(b)，构建成功的转化子电泳条带预期为740 (= 731 – 41 + 50) bp。
(a)
(b)
Figure 3. Colony PCR verification of positive transformants (a) Schematic diagram of the genomic DNA (partial) from Rad22-GFPKanMX transformants illustrating the 3'-terminal tagging of Rad22 coding sequences (CDS) with GFP-KanMXcassette, achieved by homologous integration and PCR-based gene targeting. The primers used in colony PCR verification, namely GFP-F, and Rad22-R-GFP-C-tag, matched their respective chromosomal locus nucleotides, as indicated by the arrows. The numbers in the brackets following the BamHI and GFP-F, respectively, represented their nucleotide locus on the GFP-KanMXmodule; (b) Electrophoretic graph of colony PCR products. The left lane was DNA marker DL2000 (M/bp), and 1~2 being the transformants 1~2. The expected band was 740 bp
图3. 转化子的colony PCR鉴定(a) Rad22-GFPKanMX转化子基因组Rad22编码序列3'端通过同源重组而实现GFPKanMX融合共表达的示意图，Colony PCR所用的正向引物GFP-F、反向引物Rad22-R-GFP-C-tag各自与模板(基因组DNA)结合位置见图中箭头所示，GFP-KanMXmodule的BamHI (41)以及引物GFP-F (711……731)的括弧中数字代表它们在GFPKanMXmodule上的核苷酸位置；(b) colony PCR产物的电泳图，最左边为DNA marker DL2000 (M/bp)，1~2分别为转化子1~2号，预期条带为740 bp
3.2. 显微镜检荧光点标记的DNA修复灶
Figure 4. Microscopic examination of Rad22-GFP DNA repair foci: (a) wild type (WT); (b) SPBC776.03Δ (SPBC776.03 D) strain; (a)~(b) are in unstressed conditions; (c) Cd-treated WT cells, Scale bar: 10 μm
图4. Rad22-GFPDNA修复灶(荧光点)的显微镜检图：(a) 野生菌株(WT)细胞；(b) SPBC776.03Δ (SPBC776.03D)菌株；(a)~(b)均未受Cd暴露；(c) Cd处理的WT细胞，比例尺10 μm
为了直观观察活细胞中的DNA损伤，我们采用在其染色体内源启动子控制下表达Rad22-GFP融合蛋白的酵母细胞 [3]。DNA损伤相关蛋白Rad22是单链DNA结合蛋白，在同源重组过程靶向到双链断裂点以及其它有单链DNA裸露的位点，在S期于DNA损伤位置形成Rad22-GFPDNA修复灶(荧光点)。
我们通过荧光显微镜观察(图4)，发现与未受Cd胁迫的野生菌株(WT)相比，镉暴露的酵母菌株在细胞周期S期出现多个(>2个)荧光点，表明镉具有致DNA损伤的效应，即遗传毒性。与此同时，阳性对照SPBC776.03Δ菌株即使未受镉胁迫，其细胞周期S期仍然高频出现多个(>2)荧光点，提示SPBC776.03基因为酵母的遗传稳定性所必不可少。
3.3. 染色体丢失检测
通过人工微型染色体丢失检测，敲除株SPBC776.03Δ体现出显著的染色体丢失比率，迥异于野生型酵母株，结果如图5所示，红色菌落占菌落总数的比率表示染色体丢失率。
Figure 5. Artificial mini-chromosome loss assays for SPBC776.03Δ (a) versus WT (b) cells. SPBC776.03Δ cells displayed some frequency of mini-chromosome losses as evidenced by red colonies (marked by black arrows), Scale bar: 1 cm.
图5. 染色体丢失检测实验：相比于野生型酵母株(b)，SPBC776.03Δ敲除株(a)表现出一定比率的微型染色体丢失(图中箭头所指的红色菌落)，比例尺1 cm
基于以上DNA修复荧光点检测以及人工微型染色体丢失测定结果，与酵母野生株相比，SPBC776.03Δ敲除株体现S期DNA修复的明显异常，说明SPBC776.03基因在裂殖酵母DNA受损之后的修复过程中起作用。已有文献报道，镉暴露导致酵母的高突变率 [6]，机制研究认为，Cd的致突变性与Cd造成酵母复制后错配修复(mismatch repair, MMR)能力下降密切相关，然而具体的MMR靶点尚未明了。敲除株SPBC776.03Δ的染色体丢失测定，表明其有丝分裂(M期)染色体分离行为存在异常，这佐证了SPBC776.03基因敲除所致的S期DNA修复失常是酵母M期染色体不能准确分离的重要原因。
3.4. Cd暴露下酵母SPBC776.03转录水平的检测(qPCR)
Figure 6. Real-time fluorescence quantitative PCR (qPCR) analysis of transcriptional levels of fission yeast SPBC776.03 under cadmium exposure. The untreated WT yeast cells were set as the control. The housekeeping gene β-actin served as the internal control
图6. 实时荧光定量PCR (qPCR)测定Cd暴露下酵母细胞的SPBC776.03基因转录水平，未经Cd处理的野生型酵母作为对照；qPCR中采用β-actin作为内参基因
为了进一步探讨Cd暴露是否会影响酵母细胞周期有丝分裂相关基因SPBC776.03转录，我们进行实时荧光定量PCR (qPCR)测定其mRNA；基于Nature Protocols (2008)文献中相对Ct法(comparative Ct method) [7] 进行目标基因转录的相对定量，即：通过分别计算Cd暴露组(实验组)与未经Cd处理组(对照组)的2^ −ΔCt = 2^ − (CtTarget − Ctβ-actin)，并将transcriptional fold change = 2^ − (CtTarget − Ctβ-actin) Cd-treated／2^ − (CtTarget − Ctβ-actin)untreated用于评价Cd胁迫对酵母SPBC776.03转录水平的影响。实验结果表明，经100 μM Cd2+处理的酵母细胞中，SPBC776.03基因转录下调3倍(图6)，说明细胞通过调低一些信号通路以应激镉胁迫。这提示我们，SPBC776.03基因可能是酵母细胞受重金属镉离子胁迫的响应基因。
4. 讨论
重金属镉对人体有毒，多个国家禁止其在某些产品里使用，比如儿童玩具、文具；世界卫生组织WHO对于人体的镉摄取每周限量设为7 μg/kg体重 [8]；研究证据表明，镉暴露诱导基因组不稳定性；基因组不稳定性源于细胞周期中基因组变化的累积，被公认为癌症发生的主要驱动因素 [9]。寻找并建立镉的遗传毒性的快速监测方法和技术，非常必要。
迄今，一系列采用微生物、植物和哺乳动物培养细胞的体外测试系统以及体内测试体系比如微核实验、染色体畸变等，已建立并普遍应用在筛选环境中潜在的遗传毒物质。Ames试验是应用最为广泛的遗传毒性测试方法，然而受制于其所用的细菌(沙门氏杆菌)细胞迥异于真核生物细胞——基因组结构、基因调控以及细胞代谢，Ames试验存在着明显的不足。某些哺乳动物培养细胞，比如来源于肿瘤细胞系的细胞可能对DNA损伤更敏感或者更具抵抗性，不合适作为遗传毒性测试体系 [10]。酵母是真核生物，在单倍体、二倍体状态均能生长，并在实验室条件下相互转换，具有遗传可操纵性、生长快等特点；Jia等在出芽酵母Saccharomyces cerevisiae构建了基于DNA损伤诱导基因RNR3表达的报道菌株来测试遗传毒性物质 [11]。裂殖酵母与出芽酵母都是基因组全测序的模式生物；与出芽酵母相比，裂殖酵母在细胞周期调控、rRNA合成以及基因表达调控等方面与哺乳动物细胞具有更高相似性。
研究公认，DNA修复是镉毒害的重要靶点，镉暴露导致细胞的内源和外源DNA损伤不能及时修复，从而大大提高了基因组改变的频率 [8]。本研究工作聚焦于酵母DNA损伤相关基因Rad22，已建立起用于镉暴露的生物监测体系——Rad22-GFP酵母株，该生物监测周期短，简便(只需酵母培养、荧光显微镜)、易行，可作为环境中镉的遗传毒性的初筛监测系统。
5. 结论
本研究基于酵母DNA损伤相关基因Rad22，已成功建立生物监测体系——Rad22-GFP酵母株，可作为环境镉暴露及其镉遗传毒性的初筛系统。
基金项目
国家自然科学基金项目(42176211)资助。
NOTES
*通讯作者。