1. 引言
阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)是一种以隐匿起病和进行性认知损害为特征的中枢神经系统退行性病变 [1] ，是最常见的痴呆类型，占所有痴呆的60％~80％，在老年人致死原因中居于第5位 [2] 。目前，我国AD患者已经超过600万人，据预测，到2050年我国AD患者将超过2000万，是世界上AD患病人口最多、增长速度最快的国家，给患者、家庭、社会和医疗均造成沉重负担 [3] 。AD因目前仍未明确，多数学者认为中枢神经胆碱能神经受损是其发病的主要原因 [4] 。目前尚无逆转或根治AD的特效药物，且药物治疗可能会带来一定的不良反应 [5] ，因此，寻求新的治疗靶点和药物显得日益重要。
灵芝是指隶属于担子菌门(Basidiomycota)伞菌(Agaricomycetes)多孔菌目(Polyporales)灵芝科(Ganodermataceae)寄生于腐木中的灵芝属(Ganoderma)真菌 [6] 。灵芝有独特的疗效，作为药用在我国已有2000多年的历史，《神农本草经》记载，灵芝能够补中、益气、益精气，长期食用轻身不老、延年益寿。现代科学研究发现，灵芝主要化学成分包括三萜、多糖、甾醇、生物碱、核苷酸、类固醇等 [7] ，灵芝及灵芝制品具有抗氧化、抗肿瘤、保肝护肝、降血糖、治疗神经衰弱等药理作用 [8] ，同时能提高老年免疫功能，对抗氧化应激所致的组织损伤，抑制AD的产生和发展 [9] ，其代谢产物灵芝多糖能显著改善AD大鼠的学习记忆功能以及认知功能 [10] 。
2. 材料与方法
2.1. 灵芝有效成分及靶点的筛选
选择中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP (Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform)，获取灵芝的有效成分和相应的靶点，以“灵芝”为关键词搜索，以口服生物利用度(Oral Bioavailability, OB) ≥ 30%及药物相似度(Drug-Likeness, DL) ≥ 0.18作为筛选条件，获得灵芝的有效成分，筛选灵芝的活性成分，并应用蛋白质序列和功能信息资源数据库Uniprot将有效成分的靶点与基因名进行匹配，删除重复值，得到灵芝的靶点，把数据上传至Cytoscape 3.6.0软件绘制有效成分–靶点网络图。
2.2. 筛选和建立疾病靶点
以“Alzheimer’s Disease”作为检索词，在GeneCards数据库进行关键词检索，将数据库所获得的靶标删除重复项后得到阿尔茨海默病的疾病靶标，把检索到疾病靶标与灵芝有效成分靶标共同导入Venny 2.1中，取两者交集并绘制韦恩图。
2.3. 药物–成分–靶标网络的构建
将灵芝与阿尔茨海默病相交靶点提交到String数据库中，同时设定生物种类为“Homo Sapiens”进行PPI分析，设置最低置信度为0.9，同时勾选隐藏游离的点，构建PPI网络。将PPI网络图下载TSV格式并上传至Cytoscape 3.6.0软件中，应用“Network Analyzer”插件进行分析，筛选灵芝抗阿尔茨海默病作用的核心靶点。
2.4. GO富集分析与KEGG通路富集分析
利用DAVID数据库进行GO生物功能分析，将阿尔茨海默病–灵芝共有靶点通过DAVID数据库中进行基因本体论(GO)生物过程富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析，结果用气泡图显示。
2.5. 药物核心成分与核心靶点的分子对接
将Cytoscape 3.6.0软件中筛选出的Degree值排名前三位的靶点CASP3 (ID: 1rhj)、PTGS2 (ID: 5f19)、JUN (ID: 1jnm)作为对接受体，度值前3的有效成分作为配体，下载于RCSB PDB数据库，化合物通过TCMSP、Pub Chem进行下载，并使用Chem 3D进行能量最小化，启动运行SYBYL-X 2.0软件模块中的“Dock Ligand”模块对CASP3、PTGS2和JUN的晶体结构进行对接进行加氢处理、修复侧链、并选择自动寻找活性位点等。
3. 结果
3.1. 筛选药物活性成分
利用TCMSP数据库，把口服生物利用度 ≥ 30％且药物相似度 ≥ 0.18作为筛选条件，筛选出灵芝化学成分242个以及14个具有靶点的活性成分，如丹芝酸E (MOL011256)等，潜在靶点共43个，具体见表1。
Table 1. Active components and target number of Ganoderma lucidum
表1. 灵芝活性成分及靶标数
3.2. 筛选疾病和药物相关靶点
Figure 1. Wayne diagram of pharmaceutical active components and disease targets
图1. 药物活性成分与疾病靶点韦恩图
以“Alzheimer’s Disease”作为检索词，在GeneCards数据库进行关键词检索，共获得与阿尔茨海默病相关靶点基因4457个，利用Veeny 2.1.0作图，见图1，黄色代表灵芝有效成分的作用靶点(5个)，蓝色代表疾病AD的作用靶点(4457个)，中间重合部分为灵芝有效成分与AD的交集靶点(22个)。
3.3. 灵芝有效成分与AD PPI网络的构建以及主要靶点的筛选
将灵芝与AD的22个交集靶点提交到String数据库，构建PPI网络并进行PPI分析，得到PPI互作网络，见图2，结果显示，网络共包含22个节点，44条边，平均节点度值为4，其中，22个节点代表22个蛋白质，44条边代表蛋白质之间有44个关联信息，平均节点度值为4，代表有效成分靶点–疾病靶点网络中的每个节点平均相连4条边(见图2)。将PPI网络图下载TSV格式并上传至Cytoscape 3.6.0软件中，运用Cytoscape 3.6.0选项中“网络分析仪”对共有靶点的程度、中间中心性和接近中心性分析，结果发现，JUN (程度 = 8)、PTGS2 (程度 = 8)、CASP3 (程度 = 9)和CHRM1 (程度 = 6)等综合排名比较靠前，如图3所示，这提示这些靶点在对灵芝治疗阿尔茨海默病具有重要的影响。
Figure 2. Network diagram of Ganoderma lucidum active component-AD disease target PPI
图2. 灵芝活性成分-AD疾病靶点PPI网络图
Figure 3. Protein interaction diagram of top ten targets
图3. 前十靶点蛋白互作图
3.4. GO生物学功能的富集分析
运用DAVID数据库对灵芝成分-AD靶点进行GO分析，获得104条GO生物学富集结果，排名前5的富集过程有：腺苷酸环化酶抑制G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、脂多糖反应、上皮细胞凋亡过程、外源物刺激反应、雌二醇反应。前20条富集以气泡图(见图4)的形式展示，这说明灵芝在阿尔茨海默病治疗过程中可能通过对上述生物过程的调控来起到一定作用。
Figure 4. Bubble chart of Ganoderma lucidum-AD target enrichment results (GO analysis)
图4. 灵芝-AD靶点富集结果气泡图(GO分析)
3.5. KEGG通路分析
Figure 5. Bubble chart of Ganoderma lucidum-AD target enrichment results (KEGG)
图5. 灵芝-AD靶点富集结果气泡图(KEGG)
将灵芝和AD共有的22个靶点上传至DAVID平台，把物种定义为“human”，开展KEGG富集通路分析，获得60条信号通路，选取关系最密切的前20条通路展示，前20条信号通路有：凋亡–多物种、乙型肝炎、神经变性的途径–多种疾病人类免疫缺陷病毒1感染、人类免疫缺陷病毒1型感染、脂质和动脉粥样硬化、神经活性配体–受体作用、凋亡、麻疹、铂耐药性、p53信号通路、直肠癌、小细胞肺癌、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、AGE-RAGE信号通路、病毒感染、癌症信号通路、胆碱能突触、人类巨细胞病毒感染、羟色胺能突触、钙离子通路，这些通路与灵芝对阿尔茨海默病作用机制有密切关系(见图5)。通过Cytoscape 3.6.0软件对灵芝的活性成分靶点与AD共有靶点利用网络进行可视化分析(见图6)，通过对药物–成分–靶点网络图的构建，可以更加直观、清晰地看到各成分对应的靶点调控情况。
Figure 6. Network diagram of Ganoderma lucidum active component-target-biological pathway
图6. 灵芝活性成分–靶点–生物通路网络图
3.6. 分子对接结果
MOL011256-JUN MOL011282-PTGS2 MOL011282-CASP3
选取灵芝跟阿尔茨海默病共同靶点中综合排名靠前的关键靶点(CASP3、PTGS2和JUN)开展分子对接，将关键靶点分别与灵芝活性成分进行分子对接验证，选取对接结果比较好的化学成分，筛选条件为总打分值(Total Score) ≥ 5 [11] [12] ，总打分值越高表示结合较为稳定。灵芝相关活性成分包括ganoderal B (灵芝醇B)、ganolucidic acid E (赤灵芝酸E)、beta-sitosterol (植物甾醇)。最后，直观地展示了对接结果比较理想的化学成分及蛋白晶体，结果见图7。与成分分子的关键靶标相结，氨基酸残明显，氢键以虚线显示，各化合物的对接得分见图8。研究发现，植物甾醇和其他三个化合物可能在抗阿尔茨海默病中发挥着重要作用。
4. 讨论与总结
近年来，网络药理学已被广泛应用于中医药领域，成为中医药学研究新技术和新方法 [13] 。网络药理学将系统生物学、药理学、信息网络学和计算机科学相互交融在一起 [14] ，基于药物与疾病间相互作用的整体性和系统性，把传统研究“一个成分对一个靶点”转变为将化学成分–靶点–疾病组成包含多个体、多层次相互作用的复杂网络，这种“多成分–多靶点–多途径”模式更加符合中医药辨证论治的整体思路 [15] [16] 。
阿尔茨海默病属于中医的“痴呆”、“痴证”、“呆病”等范畴 [17] [18] 。中医认为，脑为髓之海；肾为先天之本，肾主藏精，主骨生髓。滋养脑髓需依赖肾之精气，肾精充盛，则髓海得以充养，脑神得健 [19] 。中医认为，AD的病位在脑，与心、肝、脾、肾功能失调密切相关，其中尤以心肾两脏最为重要，灵芝性平味甘，归心、肺、肝、肾经。AD的发病机制异常复杂，目前，主要存在Aβ聚集假说、Tau蛋白异常假说、胆碱能假说、神经炎症及代谢障碍及血管损伤等 [20] 。临床上治疗AD的方法有药物治疗(如美金刚、多奈哌齐、喹硫平等)、干细胞治疗、物理治疗等，上述治疗方法均不能根治AD，因此有效防治AD的方法有待研究发现 [21] 。由于阿尔茨海默病是一种不可逆的中枢神经系统退行性病变，因此AD的防治较AD的治疗更重要。近年来，中医药在改善AD症状方面取得了一些进展，越来越多学者开始深入研究中医药在AD治疗中的机制 [22] 。
灵芝是一种具有食用和药用价值的真菌，其主要活性成分灵芝多糖是一种重要的天然免疫调节剂，具有多种抗炎和免疫调节作用 [23] 。灵芝多糖能抑制AD学习记忆障碍模型大鼠脑中海马IL-6的表达，改善AD大鼠的学习记忆能力 [24] [25] [26] 。研究发现，高剂量的灵芝水煎剂可明显改善AD症状，研究表明，灵芝能明显提高小鼠大脑中5-羟色胺和多巴胺的神经递质的含量，从而增强小鼠的学习记忆能力 [27] 。此外，研究发现，灵芝三萜可减轻Aβ的神经毒性以及减少脑内Aβ沉积，进一步证实灵芝有防治AD的作用 [28] 。童晓云等 [29] 研究发现，灵芝益寿丸能有效改善AD患者的认知功能障碍，改善患者生活质量。这些研究表明，灵芝防治AD有多成分、多途径、多层次的特点。
本研究从网络药理学角度系统分析了灵芝防治AD的分子机制，通过筛选获得14个活性成分、22个潜在作用靶点和60条信号通路，提示灵芝可能是通过灵芝醇B、赤灵芝酸E、植物甾醇等多种活性成分调节JUN、PTGS2、CASP3等靶点改善细胞凋亡、氧化应激反应等，干预AD的发生和发展。胆碱能神经元是维持神经功能的重要细胞，在AD患者中胆碱能神经元严重缺失，因此胆碱能神经元是治疗老年痴呆的一个靶点 [30] ，有研究发现，灵芝醇提取可能是通过作用于中枢胆碱能系统来改善记忆障碍模型动物的学习记忆能力 [31] 。PTGS2花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶，参与炎症反应，在阿尔茨海默病的发生进展中发挥重要作用 [32] [33] 。CASP3为细胞凋亡途径中最关键的酶，能诱导细胞DNA裂解，从而促进细胞凋亡，当细胞发生凋亡时，CASP3活化形成Cleaved Caspase-3，大量研究证实CASP3的活化可诱导AD神经元凋亡，抑制CASP3的活化则可改善AD病理 [34] 。
综上，本论文采用网络分析、分子对接和文献研究相结合的方法，对灵芝化学成分、作用靶点及相关信号通路进行探索性研究，揭示灵芝可能通过抗炎与抗凋亡、保护突触及调节神经递质、抗氧化作用等方式起到防治AD的作用，为后续灵芝抗AD试验研究奠定了部分理论基础。
基金项目
贵州省科技基金项目(黔科合基础[2020] 1Y391)；贵州省科技创新人才团队(黔科合平台人才[2020] 5010)；贵州省高层次创新型人才项目(黔科合平台人才[2020] 6005)；贵州省发改委工程研究中心建设项目(黔发改高技[2020] 896)。
参考文献
NOTES
*通讯作者。