1. 引言
细胞转染技术是采用除病毒感染外的方法，例如化学、生物学或物理方法将核酸(DNA或RNA)人工导入细胞的过程。导入的外源性核酸在细胞内或生成重组蛋白，或特异性地提升或抑制某个基因表达，从而用于细胞中基因或蛋白功能的研究。转染技术是一种功能强大的细胞生物学分析技术，可用于基因或基因产物的功能和调控研究，用于生成转基因生物，并用作基因治疗方法。在研究生组织及细胞培养实验教学中，细胞转染技术是一个重要的组成部分，以往实验方案使用携带荧光蛋白GFP基因的质粒转染细胞后，使用荧光显微镜进行观察，通过对细胞中绿色荧光蛋白表达情况，可以定性分析转染是否成功。对表达绿色荧光蛋白的细胞及细胞总数计数，可以粗略计算转染效率，但对于质粒所表达的蛋白携带其他标签而没有融合荧光蛋白时，质粒转染细胞后的分析检测方法在教学上尚有欠缺。
本实验针对这个问题，在检测方法中加入了斑点免疫印迹技术。斑点免疫印迹杂交(Dot blot, DB)是指将被检标本点到膜上干燥固定后直接进行抗原抗体杂交的蛋白质印迹检测方法，是经常会被人们忽略掉的一种优良实验技术。与聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行酶联免疫印迹检测的传统方法相比，这种方法操作简单，耗时很短，而且一张膜上可同时检测多个样品，非常适应于高通量样本中某特定蛋白半定量检测和教学实验。本文对实验方案及分析方法进行了探索，以帮助学生掌握更全面的细胞生物学分析技术。
2. 材料、仪器与试剂
2.1. 材料
HEK-293T细胞和EGFP-C3质粒均由北京师范大学窦非教授实验室惠赠。
2.2. 仪器
CO2培养箱(SANYO, MCO-15AC)；生物安全柜(Thermo, 1300-A2)；水浴锅(华利达，HS-2)；冰箱(上菱，BCD-183D)；倒置荧光显微镜(Zeiss, Observer-Z1)；低温离心机(Eppendorf, 5424-R)；细胞计数仪(Thermo, CountessII-FL)；迷你离心机(Baygene, QSpin)；漩涡振荡器(SCI-Logiex, MX-S)；水平摇床(其林贝尔，TS-2000A)；超声细胞破碎仪(上海泸析，JY96-II/N)；恒温箱(上海精宏，DNP-9082)；酶标仪(BMG, POLARstar-Omega)；化学发光成像仪(Tanon, 5200)；微量移液器(Gilson, 2 μL; 10 μL; 100 μL; 1000 μL)；电动助吸器(Eppendorf, Easypet-3)等。
2.3. 耗材
枪头(Axygen, T-1000-B/200-Y/10-W-R-S)；1.5 mL离心管(Axygen, MCT-150-C)；50 mL离心管(Crystalgen, 23-2262)；移液管(Costar, 4487; 4489)；10 cm培养皿(Corning, 430166)；6孔板(Corning, 3516)；96孔板(Corning, 3599)；硝酸纤维素膜(BBI, 0.22 μm, F619511)等。
2.4. 试剂
DMEM (Gibco, 10566016)；胎牛血清(FBS, AusSeneX, FBSSA500-S)；TrypLE (Gibco, 12604021)；TurboFect转染试剂(Thermo, R0531)；PBS (Gibco, 10010031)；RIPA (Pplygen, C1053)；BCA蛋白定量试剂盒(Thermo, 23227)；脱脂奶粉(BD, 232100)；TBST洗液(Sangon, C520009)，小鼠抗TUBB1单克隆抗体(BBI, D198906-0100)，小鼠抗GFP单克隆抗体(BBI, D190750)，HRP标记兔抗小鼠IgG (BBI, D110098)，HRP化学发光底物(Millipore, WBKLS0500)，蛋白酶抑制剂(Roche, 04693132001)等。
3. 方法
3.1. HEK-293T细胞的培养与传代
在37℃，5% CO2的条件下，用10~12 mL含10% FBS的DMEM培养基培养HEK-293T细胞于10 cm培养皿中，每3天传代1次。传代需先37℃预热全部试剂，弃去全部培养基，加入2 mL TrypLE消化细胞30~60 s，弃去TrypLE并用2 mL DMEM重悬细胞，弃去1.7 mL细胞悬液后补加10~12 mL含10% FBS的DMEM培养基，十字铺匀后继续培养。
3.2. EGFP-C3质粒转染与荧光显微观察
如3.1中方法制备细胞悬液并计数，之后稀释至10万/mL，每孔2 mL接种至6孔板，十字铺匀后静置15~20 min使细胞沉降，后平稳转移至CO2培养箱中培养至汇合度40%~50%。6孔板中第一排为对照组，第二排为实验组。在1.5 mL离心管中加入1.2 mL无血清的DMEM和4 μg EGFP-C3质粒，颠倒混匀。加入6 μL TurboFect，即刻颠倒混匀，室温静置孵育15 min。对照组在等量DMEM中加等量无质粒溶剂，其余操作完全相同。向每个孔中加入孵育后的混合物400 μL，十字铺匀后平稳转移至CO2培养箱中，培养4 h后换液。继续培养32 h后于倒置荧光显微镜AF-488荧光通道下观察并拍照。
3.3. 细胞裂解液的制备与蛋白浓度定量分析
弃去全部培养基，每孔用2 mL PBS轻柔洗涤2次。吸干洗涤液，加0.5 mL PBS，稍用力吹打悬浮贴壁细胞，并将全部细胞悬液转移至1.5 mL离心管中，冰上静置15~20 min使细胞沉降。取1片蛋白酶抑制剂(PI)，加1 mL ddH2O漩涡震荡至充分溶解，制备50*PI储液并按照比例添加到RIPA裂解液中。在4℃下500 g离心8~10 min收集细胞，吸净全部上清。向细胞中快速打入250 μL含1*PI的RIPA，立刻吹打15~20次使细胞完全分散，冰上裂解30 min。13,000 g离心15 min，取200 μL上清并转移至一个新的1.5 mL离心管。取5 μL裂解液，用含1*PI的RIPA稀释10倍后，依照BCA试剂盒说明书方法进行蛋白定量。
3.4. 斑点印记免疫杂交检测
将细胞裂解液点在硝酸纤维素膜上，每次点10 μg总蛋白，每个点复点2次，室温下充分风干1 h后用含有10%脱脂奶粉的TBST室温慢摇封闭1 h。弃去封闭液，加5 mL用含有5%脱脂奶粉的TBST稀释1000倍的一抗(Anti-EGFP/TUBB1)，4℃下孵育过夜。弃去一抗，用10 mL TBST洗涤4次，每次10 min。加入5 mL用含有1%脱脂奶粉的TBST稀释5000倍的二抗(HRP标记兔抗小鼠IgG)，室温孵育1 h。弃去二抗，用10 mL TBST洗涤4次，每次10 min。将HRP化学发光底物的A、B液1:1混合，均匀淋在膜上，室温孵育2~3 min后置于化学发光成像仪下曝光并观察。EGFP印迹报光时间10 min，TUBB1印迹曝光时间30 s。
3.5. 图像处理与数据统计
图片的灰度和荧光强度通过Image-J程序(NIH)计算获得。条形图和曲线图使用GraphPad Prism 6或微软Excel获得。组间差异分析方法为单因素方差分析，图示中的“*”表示P < 0.05，“**”表示P < 0.01，“***”表示P < 0.001，“n/s”表示P > 0.05。误差线代表样本S.D.用于支持本文结果的数据可在读者的合理要求下获得。
4. 结果
4.1. EGFP-C3转染HEK-293T细胞的荧光显微成像分析
如图1(a)所示，转染36 h后可以观察到细胞发出明显的绿色荧光。相同条件下，对照组细胞观察不到显著的荧光信号，表明细胞株本身几乎不合成绿色荧光物质，实验观察到的荧光信号是外源基因表达的结果。进一步使用Image-J程序分析各组细胞图像荧光信号强度，并进行统计学检验后发现：实验组细胞荧光信号显著高于对照组，P < 0.001，如图1(b)所示。该结果从定性和定量两个角度说明TurboFect转染试剂转染EGFP-C3质粒后，HEK-293T细胞有良好的转染效果。
Figure 1. HEK-293T cells emitted green fluorescence after transfection with EGFP-C3 plasmid. (a) Compared with negative control, HEK-293T cells after transfection with EGFP-C3 plasmid emitted green fluorescence, and the fluorescence was mainly localized in the cytoplasm; (b) Compared with negative control, the relative fluorescence intensity observed after transfection of EGFP-C3 plasmid was significantly increased (P = 0.0003)
图1. 转染EGFP-C3质粒后HEK-293T细胞发出绿色荧光。(a) 与对照相比，转染EGFP-C3质粒后HEK-293T细胞放出绿色荧光，且荧光主要定位于细胞质；(b) 与对照相比，转染EGFP-C3质粒后视野中的相对荧光强度显著增大(P = 0.0003)
4.2. EGFP-C3转染不影响HEK-293T细胞裂解液蛋白浓度
为定量比较各组细胞裂解液样本中转染蛋白表达量，需要总蛋白加样量一致，因此使用BCA蛋白定量试剂盒对样品蛋白浓度进行了测定。测试过程中，需要绘制标准曲线，结果显示，本次实验样本蛋白浓度(Y, μg/mL)与样本吸光度(X, OD)线性回归拟合后的关系式为Y = 892.22X，线性回归系数R2 > 0.999，如图2(a)所示，可以判定本次总蛋白定量的结果准确可信。与对照组相比，实验组细胞裂解液总蛋白水平无显著性差异，P > 0.05，如图2(b)所示。该定量结果说明，在实验条件下，EGFP-C3质粒转染对HEK-293T细胞的蛋白合成能力无明显影响，该实验方法不影响对后续酶联斑点免疫印迹实验结果的判读。
Figure 2. HEK-293T cells expressed EGFP protein after transfection with EGFP-C3 plasmid. (a) Standard curve for protein quantification by BCA method. (b) There was no significant difference in protein concentration between the experimental and the control samples (P = 0.6219). (c) Cell lysates DB analysis of the experimental and control samples. (d) Compared with the control samples, the chemiluminescence signal of EGFP was significantly enhanced after transfection of EGFP-C3 plasmid (P = 0.0001)
图2. 转染EGFP-C3质粒后HEK-293T细胞表达EGFP蛋白。(a) BCA法蛋白定量标准曲线。(b) 实验组与对照组细胞裂解液蛋白浓度无显著差异(P = 0.6219)。(c) 实验组和对照组细胞裂解液的DB分析。(d) 与对照相比，转染EGFP-C3质粒后EGFP相对TUBB1的化学发光信号显著增强(P = 0.0001)
4.3. 斑点免疫印迹实验结果
图2(c)结果表明，转染EGFP-C3质粒后，HEK-293T细胞裂解液中出现了较强的EGFP抗原抗体杂交信号。对照组中虽然也检测到了微弱的杂交信号，但其强度显著低于实验组，且在先前的实验中，未观察到对照组细胞发出明显的绿色荧光，推测该杂交信号的出现可能与实验中所用的EGFP抗体与细胞裂解液中某些蛋白发生非特异性结合有关。以TUBb1斑点的灰度作为内参对所有样本EGFP信号强度进行均一化后，统计组间差异显著性，结果如图2(d)所示。实验中，实验组EGFP信号灰度显著高于对照组，P < 0.001，说明GFP-C3转染后的HEK-293T细胞成功表达EGFP蛋白。
5. 讨论
实验细胞选用HEK-293T细胞，此细胞株细胞持续表达SV40抗原，具有较好的外源质粒摄取能力和外源基因的表达能力，常用于转染实验，转染效率较高 [1] 。Thermo Scientific TurboFect转染试剂是一种高效、易于使用的非免疫原性转染试剂，用于将DNA质粒和表达载体送入真核细胞中。特点是针对多种细胞类型有高转染效率，大多数细胞系不需要优化，较低的细胞毒性，即用型——无需复溶、稀释或处理，因此比较适合在实验教学中使用并得到较好的结果 [2] 。在本实验中，借助TurboFect转染试剂用EGFP-C3质粒转染HEK-293T细胞得到了很好的转染效率。
总蛋白的加样量是蛋白免疫印迹实验中需要被控制的重要变量，对后续定量分析影响很大，因此实验中我们使用BCA蛋白定量试剂盒对样品进行检测，确认该方法在实验中测得数据可信，保证后续的定量分析可行。BCA蛋白定量是通过比色检测进行总蛋白质定量的常用方法。相比基于考马斯染料的定量方法(Bradford 法定量)，Pierce BCA蛋白定量试剂具有独特的优势，因为它们可以兼容含有多达5%表面活性剂(去垢剂)的蛋白样品，并且受蛋白组成差异的影响小得多，从而具有更高的蛋白间均一性 [3] 。BCA蛋白定量实验也验证了EGFP-C3质粒转染对HEK-293T细胞的蛋白合成能力无明显影响，该实验方法不影响对后续酶联斑点免疫印迹实验结果的判读。
由于实验条件的影响，样品中蛋白质总量可能会存在差异，因此需要使用内参蛋白消除实验条件等因素的影响，准确地比较不同样品中待检测蛋白的含量变化。微管蛋白TUB [4] 是细胞重要的内参蛋白，主要参与细胞骨架的构建，常被用作细胞总蛋白或胞质蛋白相对定量过程中的内参。我们的实验证明，选用TUBb1作内参，可以在分子水平上半定量地说明转染EGFP-C3质粒后，HEK-293T细胞中蛋白表达情况变化。
综上，经过实验摸索，我们设计了可以用于研究生实验课教学的，细胞转染及后续蛋白表达检测实验，通过实验学生可以得到稳定可靠的实验结果，从而掌握相关实验技术以及分析方法。
NOTES
*通讯作者。