1. 引言
半夏属(Pinellia Tenore)植物属于天南星科(Araceae)南星亚科(Aroideae)，是一种常用的中药，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效 [1] ，现代药理学研究表明，半夏还具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗癫痫、抗衰老、抗新型冠状病毒肺炎等药理作用 [2] [3] 。目前发现半夏中有90个化学成分，定性80个化学成分，分别为生物碱类7个、醇醚类８个、脂肪酸甘油脂类12个、黄酮类5个、溶血磷脂酰胆碱类12个、醇氨类10个、氨基酸类11个、酰胺类11个、其他类型４个化合物 [4] [5] ，而生物碱被认为是半夏药理作用的主要有效成分之一 [6] 。赫章县属于典型的喀斯特地貌，气候和地理环境独特，中草药资源得天独厚，是全国最大的半夏生产基地之一，2013年2月，赫章半夏通过国家质监总局地理标志产品认证。近年来，该县因地制宜、区域推进、连片开发，促进半夏产业向规模化、集约化发展，全县半夏种植面积1.615万亩。半夏中生物碱含量是评价药材质量的重要标准，因此对赫章半夏生物碱的提取和含量测定对半夏发展有着重要意义，本研究通过超声波提取法 [7] 对赫章半夏生物碱的提取工艺进行研究和含量测定。
2. 实验仪器及试剂
2.1. 药材和试剂
赫章半夏，盐酸麻黄碱标准品，二水磷酸二氢钠，十二水磷酸氢二钠，25%氨水，乙酸乙酯，溴麝香草酚蓝。
2.2. 仪器
UV-2500PC紫外分光光度计，超声波清洗器，其他玻璃常规仪器。
3. 实验前处理
将半夏放在烘箱中干燥后粉碎机粉碎分别过40、60、80、100目筛，用保鲜袋分装至于阴凉干燥处备用。
4. 实验部分
4.1. 溶液配置
磷酸缓冲液(pH = 6)：精密称取15.6 g二水磷酸氢二钠加适量蒸馏水溶解后定容在500 mL容量瓶中，配置成0.2 mol/L二水磷酸氢二钠溶液；精密称取35.8 g十二水磷酸氢二钠加适量蒸馏水溶解后定容在500 mL容量瓶中，配置成0.2 mol/L的十二水磷酸氢二钠溶液；将两种溶液以87.7:12.3的比例混合即成磷酸缓冲液(pH = 6)。
溴麝香草酚蓝指示液：精密称取0.1 g溴麝香草酚蓝置于200 mL容量瓶中，加0.05 mol/L氢氧化钠溶液3.2 mL溶解，再加蒸馏水至刻度摇匀。
4.2. 标准品溶液的配制
精密称取盐酸麻黄碱10 mg，至50 mL的容量瓶中加入适量乙酸乙酯溶解，并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.2 mg/mL的盐酸麻黄碱标准品溶液。
4.3. 样品处理
精密称取半夏粉末1.0 g，加入2 mL的25%氨水搅拌使湿润，加入样品量18倍乙酸乙酯浸泡 [7] 3 h，超声波提取1 h后过滤，滤渣以10 mL乙酸乙酯分三次洗涤，合并滤液，蒸干，加入少量乙酸乙酯溶解，转移到50 mL容量瓶中，加入乙酸乙酯至刻度线，取5 mL提取液至分液漏斗中，加入蒸馏水5 mL，加入5 mL磷酸缓冲液(pH = 6)，再加入1滴溴麝香草酚蓝指示液，搅匀，静置，分取乙酸乙酯层作为供试液 [8] 。
4.4. 最大吸收波长的选择
取标准品溶液2 mL，供试液2 mL在UV-2500PC紫外分光光度计上进行全波长扫描，结果盐酸麻黄碱在420 nm处有最大吸收峰，供试液在416 nm处有最大吸收峰，故本含量测定选定420 nm为测定波长。
4.5. 标准曲线绘制 [9]
分别量取3.2下的溶液1、2、3、4、5 mL于分液漏斗中，加入蒸馏水至5 mL，在各分液漏斗中加入5 mL磷酸缓冲液，加入5 mL乙酸乙酯，再加入1滴溴麝香草酚蓝水溶液，搅匀，静置，分取乙酸乙酯层，在420 nm波长处分别测定吸光度。以浓度为x，吸光度为y求得标准曲线为y = 4.325x − 0.0383，相关系数R2 = 0.9902，见图1。
Figure 1. Standard curve of ephedrine hydrochloride
图1. 盐酸麻黄碱标准曲线
4.6. 测定含量
将3.2制备的供试液用紫外分光光度计在420 nm波长下测定吸光度，把吸光度值带入标准曲线方程计算总生物碱的含量值。
5. 单因素实验
5.1. 样品粒径对提取效果的影响
分别称取粒径为40、60、80、100目的半夏粉末各1.0 g，加入2 mL的25%氨水搅拌使湿润，加入样品量18倍乙酸乙酯浸泡3h，超声波提取1 h。过滤，滤渣以10 mL乙酸乙酯分三次洗涤，合并滤液，蒸干，加入少量乙酸乙酯溶解，转移到50 mL容量瓶中，加入乙酸乙酯至刻度线，取5 mL提取液至分液漏斗中，加入蒸馏水5 mL，加入5 mL磷酸缓冲液(pH = 6)，再加入1滴溴麝香草酚蓝指示液，搅匀，静置，分取乙酸乙酯，在420 nm波长处测定吸光度，带入标准曲线计算含量值，将其作图得到图2：
Figure 2. Influence of sample particle size on extraction efficiency
图2. 样品粒径对提取效果的影响
由图2可以看出，在粒径为80~100时，提取效果最佳。
5.2. 氨水浓度对提取效果的影响
精密称取四份粒径为90目的半夏粉末1.0 g，分别加入2 mL的10%、15%、20%、25%氨水搅拌使湿润，加入样品量18倍乙酸乙酯浸泡3 h，超声波提取1 h。过滤，滤渣以10 mL乙酸乙酯分三次洗涤，合并滤液，蒸干，加入少量乙酸乙酯溶解，转移到50 ml容量瓶中，加入乙酸乙酯至刻度线，取5ml提取液至分液漏斗中，加入蒸馏水5 mL，加入5 mL磷酸缓冲液(pH = 6)，再加入1滴溴麝香草酚蓝指示液，搅匀，静置，分取乙酸乙酯层作为供试液，在420 nm波长处测定吸光度，带入标准曲线计算含量值将其作图得到图3：
Figure 3. Influence of ammonia concentration on extraction effect
图3. 氨水浓度对提取效果的影响
由图3可以看出，当氨水浓度为25%时，提取效果最佳。
5.3. 溶剂剂量对提取效果的影响
精密称取四份粒径为90目的半夏粉末1.0 g，加入2 mL的25%氨水搅拌使湿润，分别加入样品量的6、12、18、24倍乙酸乙酯浸泡3 h，超声波提取1 h。过滤，滤渣以10 mL乙酸乙酯分三次洗涤，合并滤液，蒸干，加入少量乙酸乙酯溶解，转移到50 mL容量瓶中，加入乙酸乙酯至刻度线，取5 mL提取液至分液漏斗中，加入蒸馏水5 mL，加入5 mL磷酸缓冲液(pH = 6)，再加入1滴溴麝香草酚蓝指示液，搅匀，静置，分取乙酸乙酯层作为供试液，在420nm波长处测定吸光度，带入标准曲线计算含量并作图见图4：
Figure 4. Influence of solvent dose on extraction effect
图4. 溶剂剂量对提取效果的影响
由图4可以看出，当溶剂量为18倍时，提取效果最佳。
5.4. 浸泡时间对提取效果的影响
精密称取四份粒径为90目的半夏粉末1.0 g，加入2 mL的25%氨水搅拌使湿润，加入样品量18倍乙酸乙酯分别浸泡1、2、3、4 h，超声波提取1 h。过滤，滤渣以10 mL乙酸乙酯分三次洗涤，合并滤液，蒸干，加入少量乙酸乙酯溶解，转移到50 mL容量瓶中，加入乙酸乙酯至刻度线，取5 mL提取液至分液漏斗中，加入蒸馏水5 mL，加入5 mL磷酸缓冲液(pH = 6)，再加入1滴溴麝香草酚蓝指示液，搅匀，静置，分取乙酸乙酯层测定吸光度计算含量并作图见图5。
由图5可以看出，当浸泡时间为3 h时，提取效果最佳。
Figure 5. Influence of soaking time on extraction effect
图5. 浸泡时间对提取效果的影响
6. 结论
通过超声波辅助提取单因素试验，得到赫章半夏总生物碱最佳提取条件为粒径80目、氨水浓度为25%、浸提溶剂量18倍、浸提时间3 h，半夏总生物碱提取率为10.65 mg/g。这与文献报道张楠 [9] 等用热提方法提取最佳时间为1 h、温度为35℃~40℃有所差别，相比曾建红 [10] 等对半夏中的生物碱提取的条件优化：材料粉碎至60目，以2.575 mol/L的氨水搅拌均匀材料，加18倍的氯仿于室温下浸提25 h，浸提时间明显改善。
基金项目
贵州工程应用技术学院2022年大学生创新创业训练计划项目《毕赫章半夏生物碱的提取和含量测定》(S202210668161)；毕节市民族药用植物研究重点实验室(毕科平台合[2017] 05号)。
NOTES
*通讯作者。