摘要: 目的：基于网络药理学方法探究半夏厚朴汤治疗慢性咽炎的作用机制。方法：通过TCMSP (中药系统药理学技术平台)数据库获取“半夏”、“厚朴”、“紫苏”、“茯苓”和“生姜”的主要化学成分，根据ADME筛选出其活性成分及作用靶点，并上传Cytoscape 3.7.2软件构建“药物–成分–靶点网络”。同时通过Gencards、OMIM和DRUGBANK数据库获取慢性咽炎的主要靶点，用在线数据分析作图网站制作Venn图，并将所得交集靶点导入Cytoscape 3.8.2构建“药物–有效成分–靶点–疾病”网络。然后运用STRING数据库绘制蛋白互作(PPI)网络，结果导入Cytoscape软件3.8.2进行网络拓扑分析。最后利用Matescape数据库对交集靶点进行GO功能、KEGG通路富集分析，采用Cytoscape3.8.2构建“靶点–通路”网络。结果：筛选出半夏厚朴汤有效化学成分44个，对应靶点157个，慢性咽炎靶点1288个，半夏厚朴汤慢性咽炎交集靶点85个。分析得半夏厚朴汤治疗慢性咽炎的重要活性成分主要是木犀草素、
β-谷甾醇、豆甾醇、黄芩、宽松、卡维定、桉油醇、黄芩苷、塞雷维甾醇，TP53、AKT1、JUN、CASP3、TNF、EGFR、IL6等。GO功能富集分析得到2479项结果，其中BP 2249项，MF 129项、CC 101项。KEGG通路分析得到177条信号通路。结论：半夏厚朴汤治疗慢性咽炎的多成分、多靶点、多通路的作用机制，为治疗慢性咽炎提供了网络药理学依据。
Abstract: Objective: Based on the method of network pharmacology to explore the mechanism of Banxia Houpu decoction in the treatment of chronic pharyngitis. Methods: The main chemical components of Pinellia pinellia, Magnolia officinalis, Perilla, Poria cocos and ginger were obtained from TCMSP database, and the active components and target sites were selected based on ADME, and the drug-composition-target network was constructed by uploaded Cytoscape 3.7.2 software. Meanwhile, major targets of chronic pharyngitis were obtained from Gencards, OMIM and DRUGBANK databases, and Venn diagram was prepared using online data analysis and mapping website. The obtained intersection targets were imported into Cytoscape 3.8.2 to build a “drug-activity-target-disease” network. Then the STRING database is used to draw the PPI network. The results were imported into Cytoscape software 3.8.2 for network topology analysis. Finally, GO function and KEGG pathway enrichment analysis were conducted on the intersection target using Matescape database, and Cytoscape3.8.2 was used to construct the “target-pathway” network. Results: 44 effective chemical components of Pinxia Houpu decoction were screened, 157 corresponding targets, 1288 chronic pharyngitis targets, 85 chronic pharyngitis intersection targets of Pinxia Houpu decoction. Analysis showed that the main active ingredients of Pinellia Houpu decoction for chronic pharyngitis were luteolin, β-sitosterol, stigmasterol, baicalin, carvetin, cineolitol, baicalin, serevisterol, TP53, AKT1, JUN, CASP3, TNF, EGFR, IL6, etc. GO functional enrichment analysis obtained 2479 results, including BP 2249, MF 129 and CC 101. KEGG pathway analysis showed 177 signaling pathways. Conclusion: The multi-component, multi-target and multi-pathway mechanism of Pinellia Magnolia decoction in the treatment of chronic pharyngitis provides the network pharmacological basis for Pinellia Magnolia decoction in the treatment of chronic pharyngitis.
1. 引言
慢性咽炎为耳鼻喉科临床中较为常见，是发生于咽部黏膜、黏膜下及淋巴组织的慢性炎症性疾病，以咽部异物感、咽痒、干燥感为主要临床症状。当黏稠分泌物附着于咽后壁时，可伴有刺激性咳嗽、恶心。本病的发病率较高[1]、病程长、危害大。疾病易反复发作，不易治愈，在临床上无特殊治疗手段，多采用抗生素类药物治疗，但效果不佳。给患者生活和工作带来许多不便[2] [3]。
半夏厚朴汤中半夏和厚朴为君药，半夏降逆和胃、化痰散结，厚朴有下气除满作用，茯苓渗湿健脾。紫苏叶疏肝行气，其与半夏、厚朴两者配伍治疗慢性咽炎，可极大地提升“开结、行气、化痰、散癖”的功效。诸药合用，可共奏化痰祛瘀、行气散结、下气除满之功效[4] [5]。有研究表明，半夏具有消炎止痛、祛痰止咳的药理作用，能够减轻刺激性咳嗽的临床症状。厚朴[6]可以缓解肌肉痉挛，茯苓[7]在抗病毒、抗炎和免疫调节功能方面发挥作用，紫苏[8]能够抗病毒和镇静止痛，所以半夏厚朴汤用于慢性咽喉炎治疗，有助于缓解患者临床症状，加快病情恢复。但是具体作用机制尚不明确。因此，该研究基于网络药理学的方法，探究半夏厚朴汤的主要活性成分以及治疗慢性咽炎的作用机制，为半夏厚朴汤临床治疗慢性咽炎提供有力的科学依据[9]。
网络药理学是以生物学、信息学和药理学为基础，利用生物网络构建药物–成分–靶点–疾病网络，探究他们之间的中药作用机理的一门新型学科。能够帮助我们认清中药对疾病的作用成分和靶点，为新药的研发提供思路，还可以探究药物成分和靶点之间的关系和变化规律，能够提升药物研究的成功率，为科研工作节约成本[10] [11]。
2. 资料与方法
2.1. 半夏厚朴汤活性成分和靶点筛选
以“半夏”、“厚朴”、“紫苏”、“茯苓”、“生姜”作为关键词，借助中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)，设置类药性(drug-likeness) DL ≥ 0.18、生物利用度(oral bioavailability) OB ≥ 30%作为筛选标准，筛选出半夏厚朴汤中半夏、茯苓、紫苏、厚朴和生姜所含的化学成分，通过TCMSP平台检索出活性成分的靶点蛋白。并使用UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)把靶点蛋白转化为相应的基因名。
2.2. 药物–成分–靶点网络构建
将半夏、厚朴、紫苏、茯苓和生姜的活性成分及作用靶点上传至Cytoscape 3.7.2软件构建“药物–成分–靶点网络”。
2.3. 慢性咽炎疾病靶点的筛选
以“chronic pharyngitis”为关键词检索人类基因组注释(Genecards)数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(http://www.omim.org)，获得与慢性咽炎的相关靶标基因，并通过DRUGBANK数据库(https://www.drugbank.ca)查找治疗慢性咽炎的临床西药的靶标基因进行补充。
2.4. 药物–有效成分–靶点–疾病网络构建
将半夏厚朴汤的活性成分所对应的靶点基因和慢性咽炎的靶点基因进行匹配，通过在线数据分析作图网站绘制Venn图。将得到的交集靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“药物–有效成分–靶点–疾病网络”。
2.5. 半夏厚朴汤成分–慢性咽炎靶点(PPI)网络构建
将获得交集靶点上传至STRING构建PPI网络，并将蛋白互作信息导入Cytoscape 3.7.2软件利用Network Analyz进行拓扑分析。
2.6. GO功能富集分析和KEGG通路富集分析
使用Matescape对交集靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。
3. 结果
3.1. 半夏厚朴汤活性成分筛选和靶点获取
通过TCMSP检索出半夏、厚朴、紫苏、茯苓、生姜的化学成分，根据OB ≥ 30%，DL ≥ 0.18进行检索，得到半夏有效成分13种，厚朴有效成分2种，茯苓有效成分15种，紫苏有效成分14种，生姜有效成分5种。去重后半夏厚朴汤有效成分33种，部分有效成分见表1。对33个活性成分进行靶点预测，删除重复值后得到153个靶点。
Table 1. Some active ingredients of Banxia Houpu decoction
表1. 半夏厚朴汤部分有效成分
| 中药 |
MOLID |
Molecule Name |
OB |
DL |
| 半夏 |
MOL001755 |
24-Ethylcholest-4-en-3-one |
36.08 |
0.76 |
| 半夏 |
MOL002670 |
Cavidine |
35.64 |
0.81 |
| 半夏 |
MOL002776 |
Baicalin |
40.12 |
0.75 |
| 半夏 |
MOL000449 |
Stigmasterol |
43.83 |
0.76 |
| 半夏 |
MOL003578 |
Cycloartenol |
38.69 |
0.78 |
| 茯苓 |
MOL000275 |
trametenolic acid |
38.71 |
0.8 |
| 茯苓 |
MOL000279 |
Cerevisterol |
37.96 |
0.77 |
| 茯苓 |
MOL000282 |
ergosta-7,22E-dien-3beta-ol |
43.51 |
0.72 |
| 茯苓 |
MOL000283 |
Ergosterol peroxide |
40.36 |
0.81 |
| 茯苓 |
MOL000300 |
dehydroeburicoic acid |
44.17 |
0.83 |
| 紫苏 |
MOL006209 |
cyanin |
47.42 |
0.76 |
| 紫苏 |
MOL000358 |
beta-sitosterol |
36.91 |
0.75 |
| 紫苏 |
MOL000953 |
CLR |
37.87 |
0.68 |
| 紫苏 |
MOL001771 |
poriferast-5-en-3beta-ol |
36.91 |
0.75 |
| 生姜 |
MOL000358 |
beta-sitosterol |
36.91 |
0.75 |
| 生姜 |
MOL000449 |
Stigmasterol |
43.83 |
0.76 |
| 生姜 |
MOL001771 |
poriferast-5-en-3beta-ol |
36.91 |
0.75 |
| 厚朴 |
MOL005970 |
Eucalyptol |
60.62 |
0.32 |
| 厚朴 |
MOL005970 |
Neohesperidin |
57.44 |
0.27 |
3.2. 药物–成分–靶点网络构建
将半夏、厚朴、紫苏、茯苓、生姜的活性成分及靶点录入Cytoscape 3.7.2软件，进行网络构建。网络中的节点分别代表药物、活性成分、基因靶点，连线代表节点之间的相互作用，共有191个节点，496条边。
3.3. 慢性咽炎相关靶点的获取
通过Gene Cards、OMIM和DRUGBANK数据库并去除重复值后得到1288个半夏厚朴汤相关靶点基因。
3.4. 药物、疾病共同靶点的筛选
将半夏厚朴汤的活性成分所对应的458个靶点基因和慢性咽炎对应的1288个相关基因通过在线数据分析作图网站制作Venn图，见图1。共得到交集靶点85个。
Figure 1. Drug disease common target
图1. 药物疾病共同靶点
3.5. 药物–有效成分–靶点–疾病网络
将半夏厚朴汤的44个有效成分与药物-疾病共同靶点导入Cytoscape中，生成“药物–成分–靶点–疾病”网络模型，见图2，图中共有118个节点，273条边。利用内置的Network Analyzer进行半夏厚朴汤治疗慢性咽炎拓扑分析，得到核心成分，见表2。其中木犀草素连接度45，介度为0.4736，紧密度为0.4854，为半夏厚朴汤治疗慢性咽炎的主要活性成分。其次为β-谷甾醇、豆甾醇、黄芩、宽松、卡维定、桉油醇、黄芩苷、塞雷维甾醇。
Figure 2. Banxia Houpu decoction-active ingredient-target-chronic pharyngitis network
图2. 半夏厚朴汤–有效成分–靶点–慢性咽炎网络
Table 2. Characteristic parameters of the network nodes of the main active components of Banxia Houpu decoction
表2. 半夏厚朴汤主要活性成分网络节点特征参数
| MOL ID |
名称 |
连接度 |
介度 |
紧密度 |
| MOL000006 |
木犀草素 |
45 |
0.47365593 |
0.485477 |
| MOL000358 |
β-谷甾醇 |
41 |
0.102971 |
0.41637 |
| MOL000449 |
豆甾醇 |
32 |
0.13450761 |
0.402062 |
| MOL002714 |
黄芩 |
20 |
0.07790688 |
0.410526 |
| MOL006202 |
宽松 |
19 |
0.14312015 |
0.39661 |
| MOL002670 |
卡维定 |
13 |
0.0502598 |
0.378641 |
| MOL005970 |
桉油醇 |
13 |
0.06248293 |
0.381107 |
| MOL002776 |
黄芩苷 |
9 |
0.03544878 |
0.371429 |
| MOL000279 |
塞雷维甾醇 |
8 |
0.04905002 |
0.376206 |
3.6. 半夏厚朴汤成分–慢性咽炎靶点(PPI)网络构建
将交集靶点上传至STRING构建PPI网络，设置最低相互作用阈值为“highest confidence = 0.7”，并筛除散在靶点，可以得到PPI网络图及蛋白相互作用信息。其中PPI网络图不能直观的表现各靶点蛋白之间的关系，因此，将得到的蛋白相互作用信息导入Cytoscape 3.7.2利用Network Analyz进行拓扑分析，并将所得结果进行可视化。图中圆形代表蛋白，线为蛋白间的相互作用关系，共包含82个节点，530条边，其中节点越大，颜色越深，透明度越低则degree值越高，代表该蛋白在网络中越重要。依据Degree值进行筛选，得到半夏厚朴汤调控网络关键靶点，包括TP53、AKT1、JUN、CASP3、TNF、EGFR、IL6等，见表3。
Table 3. Characteristic parameters of core target network nodes of Banxia Houpu decoction in treating chronic pharyngitis
表3. 半夏厚朴汤治疗慢性咽炎的核心靶点网络节点特征参数
| name |
Degree |
Betweenness |
Closeness |
| TP53 |
41 |
450.86166 |
0.5683453 |
| AKT1 |
40 |
534.66425 |
0.57246375 |
| JUN |
36 |
607.8018 |
0.5808824 |
| CASP3 |
34 |
311.0729 |
0.55244756 |
| TNF |
34 |
288.8089 |
0.5642857 |
| EGFR |
32 |
496.99777 |
0.56028366 |
| IL6 |
31 |
233.64827 |
0.56028366 |
Figure 3. Top 10 approaches to GO enrichment analysis
图3. GO富集分析各项结果前10条途径
3.7. GO富集分析
运用Metascape对半夏厚朴汤与慢性咽炎的交集靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，GO功能富集分析中分别包括生物过程(BP)，分子功能(MF)，细胞组分(CC)，BP2249项，MF129项、CC101项。依据-Log10(P)值由大到小排序，分别选取MF、BP、CC富集分析的前10项进行气泡图绘制。如图3。
3.8. KEGG富集分析
KEGG富集分析中，共找到177条信号通路，依据-Log10(P)值由大到小排序，选取前10条通路，包括癌症的通路、脂质和动脉粥样硬化、化学致癌–受体活化、PI3K-Akt信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、雌激素信号通路、癌症的转录失调等，绘制高级气泡图，如图4。将所得KEGG数据导入Cytoscape 3.7.2进行可视化图形绘制。
Figure 4. Bubble plot of top 10 pathways of KEGG analysis results
图4. KEGG分析结果前10条途径气泡图
4. 讨论
慢性咽炎是常见的咽部疾病，属于中医“喉痹”范畴。症状时轻时重，病程较长。常因劳累、酗酒、多语、感冒以及其他精神刺激等反复发作或咽部不适症状加重。慢性咽炎如治疗不及时可诱发扁桃体炎、鼻窦炎、支气管炎，严重者可能引发肺炎及中耳炎[12] [13]。
本研究通过网络药理学的方法探究半夏厚朴汤治疗慢性咽炎的潜在靶点和机制。首先，运用获得的44个药物有效成分和85个交集靶点构建“药物–成分–靶点–疾病”网络模型分析得知，大多数的有效成分影响了多个靶点，例如木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇分别影响了45、41、32个靶点，以此得出其可能是半夏厚朴汤中最重要的有效成分。
木犀草素广泛分布于花卉、草本植物、蔬菜和水果中，是一种丰富的类黄酮，有实验表明，木犀草素能够改善病理学损伤和细胞凋亡程度，降低MDA含量及促炎细胞因子(TNF-α, IL-6)水平。具有抗氧化应激、抗炎和抗凋亡等方面具有神经保护作用[14]。刘涛用木犀草素、黄芩素、槲皮素单体复方的配伍观察对慢性咽炎的疗效。证明三素单体复方对实验动物急、慢性炎症具有良好的抑制作用，能明显改善氨水和松节油所致慢性咽炎，减轻咽喉部黏膜损伤[15]。木犀草素抑制巨噬细胞中促炎细胞因子间留酶-6 (IL-6)，间卢锦素-12 (IL-12)和肿瘤坏死因子α (TNF-α)的产生。通过增强精氨酸酶(Arg1)和甘露糖受体C型1 (Mrc1)的表达来促进巨噬细胞M2极化。木犀草素抑制核因子κ-轻链增强子的活化B细胞(NF-κB)活化和干扰素调节因子1 (IRF1)，干扰素调节因子5 (IRF5)的表达。木犀草素通过抑制NF-κB途径和M1巨噬细胞的极化来抗炎，从而缓解慢性咽炎[16]。β-谷甾醇是植物中的植物甾醇，它能够抑制由PNG、TNF-α或LPS诱导的角质形成细胞和巨噬细胞(TNF-α、IL-β、IL-6、IL-8和ROS)的炎症因子分泌。还能够降低NLRP3炎症小体关键成分NLRP3的表达，并且抑制半胱天冬酶-1的活化。对巨噬细胞中NF-κB具有抑制作用。并且在刺激后以能够诱导HaCaT细胞中HO-1 (一种抗炎蛋白)的产生。有理由相信，β-谷甾醇能够增强天生免疫力[17]。有实验结果表明，与标准提取物相比，β-谷甾醇具有显著的剂量依赖性活性，具有镇痛和抗炎作用，这可能是通过抑制前列腺素和缓激肽的形成[18]。豆甾醇系植物甾醇之一，存在于各种植物油、植物种子、花粉中，是植物的一种活性成分，最新研究发现，豆甾醇具有抗肿瘤、降低血液胆固醇、抗骨关节炎等多种药理作用[19]。Ahmad Khan M [20]等人在研究豆甾醇于炎症之间的关系时，发现豆甾醇能够改善了关节炎大鼠的临床症状。豆甾醇的治疗还显示着抑制促炎介质(TNF-α，IL-6，IL-1β，iNOS和COX-2)的表达，并通过下调NF-kBp65 (抑制p-IKB-α激活)和p38MAPK在关节中的表达来增加抗炎细胞因子(IL-10)的表达。Jie F [21]等人在实验中发现，豆甾醇改善了APP/PS1小鼠的神经炎症，并抑制了小胶质细胞对Aβ的炎症反应。并通过AMPK [22]激活通过NF-κB和NLRP3信号通路介导促炎细胞因子的分泌。豆甾醇还可以保护BV2细胞免受Aβ的侵害低聚物诱导炎症。此外，豆甾醇还减轻了BV2细胞的M1极化。从而减轻炎症反应。
通过PPI网络分析研究可知，TP53、AKT1、JUN、CASP3、TNF等靶蛋白节点度高，是半夏厚朴汤所含化学成分与慢性咽炎基因网络的核心靶点，也是其他节点之间的连接纽带。有研究显示，TP53与患者基因表达数据集中的炎症相关基因特征呈正相关。通过功能获得(GOF)突变调节恶性表型。TP53GOF突变特征与炎症之间存在显着相关性。TP53的过表达诱导转录组改变，导致炎症相关基因特征的富集。Ham SW等人在RNA测序结果和标志签名进行了基因富集分析，炎症相关特征，包括通过NFκB信号传导的TNFA，以及干扰素和炎症反应，在19NS过表达TP53中富集。此外，趋化性相关基因特征被富集。突出了TP53GOF突变与炎症之间的关系[23]。AKT1是AKT激酶家族成员之一，它所控制髓源性抑制细胞的功能活性是HIF1α介导的糖酵解活性所必需的环节，可防止炎症的损伤。阻止慢性咽炎的进一步发展[24]。Raivich在实验中发现，在体外JNK信号传导炎症相关刺激的反应中起重要作用，Jun的神经缺失也会干扰神经胶质和炎症反应，在JUN的外周面运动神经被切断后，小胶质细胞激活和T细胞募集要弱得多[25]。Yang B在实验中发现，促红细胞生成素在常温灌注中增加了半胱天冬酶-3活性，促进炎性细胞凋亡，驱动炎症和凋亡细胞进入肾小管腔，减少巨噬细胞和IL-1β活化，所有这些都促进了炎症清除[26]。TNF在炎症反应和各种细胞事件(如细胞凋亡和坏死性凋亡)中起关键作用。TNF与其受体TNFR1的相互作用驱动复杂分子途径的启动，导致炎症和细胞死亡[27]。
GO和KEGG分析与上述分析一致。KEGG通路富集分析结果显示，半夏厚朴汤治疗慢性咽炎的潜在基因富集在IL-17信号通路、脂质和动脉粥样硬化、PI3K-Akt信号通路等，PI3K-Akt信号通路抑制剂能通过下调IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α表达，进一步增强抗炎效果[28]。促炎细胞因子IL-17最近被描述，并正在成为越来越多慢性炎症疾病的重要治疗靶点。IL-17在宿主防御细胞外细菌和真菌感染中发挥关键作用。IL-17的过量表达与多种炎症性疾病相关，IL-17A与IL17RA/RC复合物的结合通过SEF/IL-17R (SEFIR)结构域招募泛素连接酶Act1。Act1招募肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子6 (Traf6)，导致核因子κB (NF-kB)和丝裂原活化蛋白(MAP)激酶通路的激活。这种激活上调许多炎症基因[29]。对于相关通路的进一步分析表明，半夏厚朴汤治疗慢性咽炎主要可能是通过相关通路的介导，针对炎症、氧化、免疫等反应进行调控以达到治疗目的。
5. 结论
综上所述，本研究通过网络药理学的方法对于半夏厚朴汤治疗慢性咽炎进行分析，结果显示，半夏厚朴汤所含的化学成分木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、桉油醇、黄芩苷等可能是该方治疗慢性咽炎的关键，各成分通过IL-17信号通路、脂质和动脉粥样硬化、PI3K-Akt信号通路作用于TP53、AKT1、JUN、CASP3、TNF等靶点发挥作用，通过抗炎、抗氧化和免疫等相关信号来实现治疗作用。为半夏厚朴汤的药物机制探索提供了方向和启示。
网络药理学的发生发展给传统中药的研究带来了新的思路，但这种研究具有一定的局限，它过分依赖于生物学、信息学及数据库的发展。并且这只停留在生物学分析上，之后需要实验加以佐证。
NOTES
*通讯作者。