基于CRISPR-Cas生物传感系统的食源性病原微生物检测研究进展

Research Advancements in Identifying Pathogens in Food Based on the CRISPR-Cas Biosensor Technology

摘要: 食源性病原微生物是涉及食品安全的重要因素，传统检测方法中存在诸多局限性问题，如预处理复杂、周转时间长、灵敏度低、依赖大型仪器设备等。新发现的CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技术在现阶段微生物检测领域出现许多新的研究进展。利用现代生物学方法基于CRISPR-Cas生物传感系统的开发，可以解决传统检测方式中的诸多问题。文章综述了依托三类Cas蛋白(Cas9、Cas12、Cas13)构建的生物传感器，并将这些生物传感器应用于食源性病原微生物的检测。这些基于CRISPR-Cas系统的传感技术有效克服了传统检测方法存在的限制，具有特异性强、灵敏度高、检测成本低的特点。文章还概述了该技术在目前研究和应用阶段遇到的问题，并对CRISPR-Cas生物传感器未来的发展方向进行了前瞻，同时提出了新的观点和可能的应用，以进一步探寻其在微生物检测领域的未来潜力。随着CRISPR-Cas系统的发展与完善，其必将在食源性微生物检测方面得到越发广泛的应用。

Abstract: Foodborne pathogenic microorganisms are important factors related to food safety, and traditional detection methods have many limitations. The newly discovered clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technology has made many new advances in microbial detection. The use of modern biological methods based on the development of CRISPR-Cas biosensor system can provide new ideas for traditional detection methods, and solve the problems of traditional detection methods, such as complex pretreatment and long turnaround time. This article mainly reviews studies on the detection of foodborne pathogenic microorganisms based on the biosensing system with three Cas proteins (Cas9, Cas12, Cas13), which has many advantages, such as high sensitivity, high specificity, low cost and so on, breaking the limitations faced by traditional foodborne pathogenic microorganisms detection. The challenges in the current development and application of this method are summarized, and the future development prospect of the new biosensor CRISPR-Cas system is prospected and new thinking is provided for future applications to explore its potential application in microbial detection. As the CRISPR-Cas system continues to evolve and enhance, its application in identifying foodborne microbes is expected to expand significantly.

1. 引言

食物在加工与储存过程中，往往会受到各类微生物污染，可能会引起相应的疾病。致病微生物主要分类为细菌、病毒、真菌及寄生虫。与食物相关的疾病通常分为传染性和中毒性两大类，传染性疾病如腹泻和某些由动物传播的疾病，中毒性疾病则涉及典型的食物中毒案例以及化学污染物所触发的健康隐患。根据世界卫生组织的统计，每年约有6亿人因受食品污染而患病，近乎高达10%的发病率，鉴于此类疾病的高发病率，其已经成为世界范围内的公共卫生领域引起广泛关注的问题。近期，食源性疾病的发生和扩散趋势呈上升态势，已经成为了一个影响公众健康的重要公共卫生挑战[1] [2]。随着社会经济的持续发展和科技水平的不断提高，公众对食品安全和营养健康的意识也在逐渐增强。食源性病原体检测是监测食品安全风险和保护人民群众身体健康的关键措施，对于预防和控制食品污染、维护公共卫生安全具有重要的意义。

目前，食源性致病微生物的检测方法主要包括两大类：

其一，传统检测方法涵盖培养、分离和鉴定过程，即利用培养基培养病原菌，然后通过形态学、生化特性等进行提取分离和鉴定；血清学检测，如酶联免疫吸附试验[3] (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)，该方法通过检测抗体和抗原的相互作用来诊断病原体。其二，基于分子生物学的检测方法：包括核酸扩增[4]、基因测序[5]、基因芯片[6]等。这些方法各有优势和局限性，常根据检测需求、样本类型和实验条件来选择合适的诊断方法。

在此基础上发展起来的PCR (polymerase chain reaction)、qPCR (quantitative polymerase chain reaction)等定量准确检测方法已被广泛应用于临床病原微生物样本检测。然而，目前这些主流策略在常规使用中仍存在一些障碍或不足。例如，传统的检测方法因其复杂的操作步骤和漫长的检测周期，快速获取检测结果的目标难以实现。血清学检测虽灵敏度较高，但也存在成本高、需要训练有素人员等方面的问题。与此同时，进行qPCR操作需要的仪器较为昂贵，并且存在携带污染的问题，对食源性病原体的最佳诊断工具的要求很高。

基于CRISPR-Cas系统对核酸序列的准确辨识能力，该技术作为新型生物传感器被用以检测病原体的核酸，故而针对这一研究的探讨显得尤为关键且具现实价值。本文综述了CRISPR-Cas生物传感系统在食源性病原微生物检测方面的研究进展，介绍了CRISPR-Cas系统的不同类型，并重点讨论了其在检测食源性致病菌中的应用，并对该技术在食品安全领域的研究发展提出启发见解与未来展望。

2. CRISPR-Cas系统

2.1. 结构与种类

CRISPR-Cas系统是一种存在于古细菌内的由RNA介导的获得性免疫系统，其主要作用是抵御如噬菌体等外源核酸的入侵攻击。CRISPR基因座由前导序列、间隔序列和重复序列构成，其具体结构如图1中所展现。前导序列充当CRISPR基因座的启动子，负责促进转录重复序列及间隔序列，但这部分序列并不会被翻译为蛋白质。间隔序列往往长度相近，起到识别作用，多从噬菌体、质体、转座基因或其他类似的致害内源性DNA片断中获得，是发挥免疫作用的主要序列片段。而重复序列片段的功能在于分隔各间隔序列，进而转录形成的RNA分子通过碱基配对向内折叠，构筑出类似发夹的结构。与重复序列长度相近的间隔序列靠近CRISPR基因的Cas基因，依据其在体系内承担的职能得以分类和命名，其编码能力涉及众多结构与功能特征不一的Cas蛋白。

CRISPR-Cas系统的多样性体现在其结构和机制上的差异，目前研究发现的CRISPR-Cas系统根据其位点和特征蛋白分为一类[7]与二类[8]共6个亚型。与1类(I、III、IV型)的多蛋白效应复合物相比，2类(II、V、VI型)具有单一效应蛋白，故更容易组织，因此二类CRISPR-Cas系统常用于生物工程和CRISPR诊断。目前对Cas9系统、Cas12系统和Cas13系统的研究较为广泛。下表总结了目前常用二类的Cas效应蛋白的特点和差异。下表1总结了目前常用二类的Cas效应蛋白的特点和差异。

Figure 1. Schematic diagram of the structure of the CRISPR-Cas system

图1. CRISPR-Cas系统结构示意图

Table 1. CRISPR class II effector nucleases

表1. CRISPR二类效应核酸酶[9]-[11]

效应蛋白	Cas9	Cas12a	Cas13a
靶标	dsDNA	dsDNA/ssDNA	ssRNA
向导RNA	tracrRNA、crRNA	crRNA	crRNA

续表

间隔子长度	20nt	20nt	28nt
PAM|PFS	5-NGG-3’	5-TTTN-3’	non-G
切割活性	顺式切割	顺式切割、反式切割	顺式切割、反式切割
切割末端	平末端	5nt交错末端	/
切割位点	PAM上游三个核苷酸外侧	PAM下游靶链23位与非靶链18位	富U位点
反式切割	/	非特异性ssDNA	非特异性ssRNA

2.2. 作用机制

当外源DNA如噬菌体或质粒等入侵宿主时，宿主细菌利用CRISPR序列和Cas蛋白的协同作用来抵御噬菌体的侵袭。其作用机制涵盖了“捕获–表达–干扰”三个阶段的免疫反应。

起始步骤——识别与捕获阶段：Cas蛋白特异性识别外源核酸片段，借助效应因子的作用将此段核酸整合到CRISPR基因座中[12]，并形成间隔序列区域。第二步骤——受前导序列调控，CRISPR基因座转录生成前体crRNA，随后由对应的Cas蛋白加工为成熟的crRNA并与效应Cas蛋白结合，组成作用于下一阶段的crRNA-Cas蛋白复合物。最终步骤——干扰阶段：效应蛋白复合物或单一效应蛋白通过识别与crRNA互补的核酸序列来实现其功能，这一识别匹配过程依赖于靶标序列附近2至7个碱基长的PAM (protospacer adjacent motif)序列。这种识别机制使得Cas蛋白能够在目标位点特异性地切割降解外源入侵的核酸序列，从而达到防御目的。

3. 基于CRISPR-Cas系统的生物传感器

生物传感器是一种拥有便携、小巧设计特点的分析设备，能够感测生物反应，并通过内置的信号传递和信号放大模块，将生物反应信号转化为可处理和定量的理化指标。该设备的关键结构部分包括生物敏感的识别组件(如酶、抗原、微生物、核酸等)、以及传递与扩大信号的理化转换器和信号放大器[13]。

现阶段基于CRISPR-Cas系统的生物传感器主要通过利用核酸或特定探针对病原体核酸序列的特异性识别，通过将生物反应信号增强而转换为易于检测的理化信号，进而实现病原体的定性鉴别或定量检测分析。根据传感器检测原理，可将其分为荧光传感器、比色传感器和电化学传感器等类型，这些传感器具备分析速度快、可实现在线检测和操作简便等优势。下文将介绍几种常见的基于不同Cas蛋白的检测传感器。

3.1. 基于Cas9检测食源性病原微生物

Cas9是CRISPR-Cas系统中的一种效应蛋白，由双链RNA引导的，并具有核酸内切酶的活性，gRNA与Cas9结合后对目标序列的识别切割有重要作用。

在我国内陆地区，作为一种常见的食源性病原微生物的沙门氏菌常引起细菌性食物中毒，其引发的食物中毒事件经常居于高位。有研究[14]通过CRISPR-Cas9集成横向流动条带(Cas9-integrated lateral flow strip, Cas9-LFS)用来检测沙门氏菌，对沙门氏菌基因组DNA进行扩增标记后的扩增子可被Cas9与sgRNA复合物精确识别。将鼠伤寒沙门氏菌作为参比菌株，该方法Cas9-LFS的检出限达到了10² CFU/mL，对受沙门氏菌污染的食品具有较好的鉴别准确性。

Wang等[15]整合CRISPR-Cas系统与横向流动检测，并命名为CRISPR-Cas9介导的横向流动核酸检测(CRISPR-Cas9-mediated lateral flow nucleic acid assay, CASLFA)，该技术可直接应用于目视下识别鉴定单核细胞增殖李斯特菌等。该研究中的核心技术是将CRISPR-Cas系统的识别过程整合进横向流动检测平台中。同应用传统PCR方法进行检测的结果相比，该方法具有较高特异性且准确率优良，通过设计的Cas9-sgRNA系统进行二次识别(图2(a)所示)，可以大幅消除扩增过程中因引物二聚而带来影响检测结果准确度的问题。

Sun等[16]将CRISPR-Cas9系统与金属–有机框架UiO66平台结合触发两步等温扩增进而对大肠杆菌O157:H7进行荧光检测。将目的基因序列通过CRISPR-Cas9系统识别并切割产生缺口，缺口处向外延伸的新链随即取代原始DNA链，触发链置换扩增(strand displacement amplification, SDA)和滚圈扩增(rolling circle amplification, RCA)反应，链置换扩增反应的单链DNA产物可作为RCA反应的引物进而对双信号产生扩增。扩增反应后，大量长ssDNA产物与探针结合，导致在金属–有机框架平台上探针的荧光被淬灭，进而使荧光在典型激发/发射波长处恢复，通过荧光恢复的强度对目标DNA含量产生定量表征(如图2(b)所示)。该方法检出限为4 × 10¹ CFU/mL，低于另一常用的检测方法RT-PCR Kit法的检测限三个数量级，具有高灵敏度检测结果且特异性与准确度均较为显著。

CRISPR-Cas9系统目前在基因编辑和快速检测相关领域应用较为广泛，具有可用位点多、可同时对多个基因操作等诸多优点，但在使用时频繁产生的脱靶效应成为限制其应用的一大因素。表2列举了基于Cas9的病原微生物检测方法。

Table 2. Detection of foodborne pathogenic microorganisms based on CRISPR-Cas9 system

表2. 基于CRISPR-Cas9系统对食源性病原微生物检测

病原微生物	核酸	信号放大方式	检测限	检测方式	参考文献
SARS-CoV-2	RNA	RT-RPA	40 copies	横向流动检测	[17]
单增李斯特菌	DNA	EXPAR	0.82 amol	荧光检测	[18]
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌	DNA	——	10 cfu/ml	荧光信号	[19]
金黄色葡萄球菌	DNA	RPA	63 cfu/ml	横向流动检测	[20]
大肠杆菌O157:H7	DNA	SDA、RCA	40 cfu/ml	荧光检测	[16]
鼠伤寒沙门氏菌/大肠杆菌	DNA	ITA	100 cfu/ml	横向流动检测	[21]

3.2. 基于Cas12检测食源性病原微生物

在CRISPR-Cas系统内，前体crRNA首先通过CRISPR序列转录生成，继而被进一步加工处理为成熟的crRNA，最终形成功能性的sgRNA。在sgRNA引导下，Cas蛋白识别靶标核酸中的PAM序列并对靶标核酸进行切割。现阶段Cas12系统中针对Cas12a和Cas12b的研究较多[22]。

3.2.1. Cas12a系统

CRISPR-Cas12a系统包括crRNA和Cas12蛋白两项核心部分组成。CRISPR-Cas12a蛋白作为一种由RNA引导的酶，是细菌适应性免疫系统的组成之一，具有结合并切割靶标DNA的作用。类似于CRISPR-Cas9系统，Cas12a由于其定向双链DNA的切断能力，被广泛应用于基因组编辑技术[23]。

在多种CRISPR-Cas系统中，CRISPR-Cas12a系统以其精准的核酸定向切割能力著称。这一系统可以方便地结合各类基于核酸扩增的信号放大技术，显著增强其检测的灵敏度与特异性[24]，因此在食源性病原微生物检测领域被广泛采用。

单核细胞增生李斯特氏菌是一种兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，主要经由摄入食物而传播，属于最具危险性的食源性病原微生物之列，可诱发包括败血症、脑膜炎、单核细胞增多症等在内的多种疾患。田亚晨等[25]开发一种将CRISPR-Cas12a系统与重组聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification, RPA)相结合用以对单增李斯特氏菌进行检测的方法，该方法经改进后在37℃环境条件下达到了10 CFU/mL的检测限。与qPCR相比，对单增李斯特氏菌污染的诊断检测达到了100%准确率。

副溶血性弧菌又称肠炎弧菌，于海产品中广泛存在，食用被该微生物污染的食物可导致腹痛、呕吐、急性腹泻等食物中毒症状，是常见引起食物中毒的革兰氏阴性病原微生物[26]。借助CRISPR-Cas12a系统与跨越式滚环等温扩增技术(saltatory rolling circle amplification, SRCA)相结合，董换哲等[27]开发出一项命名为SRCA-Cas12a的新方法用于对海产品中副溶血性弧菌进行高精度检测。初始阶段通过SRCA反应对靶标核酸进行扩增放大，产出众多串联重复的靶标序列，随后经过设计的crRNA对扩增产物进行特异性识别，进而触发Cas12a对ssDNA的切割活性。在该过程中Cas12a切割体系内ssDNA报告探针，在完备体系中形成Cas12a-crRNA-靶标核酸三组分复合物，导致探针两端的荧光基团与猝灭基团分离，荧光基团因远离淬灭基团而产生荧光信号，通过检测荧光信号强度的改变可以判定检测结果。由此建立的SRCA-Cas12a系统检测方法可应用于海产品中副溶血性弧菌的精准检测，在最优检测体系条件下检出限为3.6 CFU/mL，可区分副溶血性弧菌和其他食源性病原微生物，具有良好特异性。

王鑫杰等[28]开发了一种可视荧光检测方法CRISPR-Cas12a-NER (CRISPR-Cas12a-based detection with naked eyes readout)用于检测样本中的新型冠状病毒。向体系中引入标记有淬灭绿色荧光分子的ssDNA报告基因，当存在检测目标核酸时将在485 nm光下产生可由裸眼目视读取结果的绿色荧光，从而对体系中的新型冠状病毒进行判断。CRISPR-Cas12a-NER使用不同于qPCR的RT-RAA方法对靶标进行扩增，这一策略在简化实验步骤和减少检测所需时间方面表现突出，尽管其灵敏度与qPCR相比并非全然相等，但已满足检测标准，并且与qPCR的检测结果具有良好的一致性。CRISPR-Cas12a-NER作为一种新提出的检测方法，具有便携、简单、敏感和特异性的检测特点，能够在不需要精密仪器设备的情况下实现对新型冠状病毒的识别与检测，可大幅简化人力物力的投入。

Xing等[29]借助CRISPR-Cas12a系统与重组酶辅助扩增(recombinase aided amplification, RAA)技术相结合，开发了一种微流体生物传感器(fabrication microfluidic biosensor, FA-MB)，旨在实现对蜡样芽孢杆菌一类食源性致病菌的检测。为避免干扰，将CRISPR-Cas12a系统与RAA的反应孔采取隔离操作，同时采用单向控制阀(如图2(c)所示)，进而使扩增产物单向流向CRISPR-Cas12a反应孔，最后将荧光信号进行采集和处理。在选定的实验条件下，致病菌可在1 h内检出，检出限低于500 CFU/mL。

3.2.2. Cas12b系统

CRISPR-Cas12b系统中的Cas12b蛋白是双RNA导向的蛋白核酸酶，由crRNA和tracrRNA共同介导或由融合后的sgRNA单独介导，特异性识别5’-TTN的PAM序列且切割后产生粘性末端[30]。同属二类Cas蛋白的Cas12b比Cas9和Cas12a更小更加耐热且具有附带切割活性。

空肠弯曲菌主要寄生于禽类，若误食受污染的食物可造成中毒而引起急性肠炎产生腹泻发热等症状。Huang等人[31]通过CRISPR-Cas12b系统对具有特异性和保守性基因组特征的空肠弯曲菌进行快速准确检测，构建了可以现场检测空肠弯曲菌的体系。该团队将污染的鸡肉样本进行梯度稀释后用PBS缓冲液洗涤被污染的样品，随即从洗涤缓冲液中煮沸5 min提取DNA。通过进一步的空肠弯曲菌分离和鉴定结果表明，基于CRISPR-Cas12b的检测系统比传统的细菌分离方法灵敏度高10倍左右。板计数结果显示，其检出限为10 CFU/g鸡肉样品。由此显示基于该系统的空肠弯曲菌检测灵敏度良好，且该结果是定性的，如想进一步定量确定污染样品中的病原菌，可利用更深层次的检测方法，如通过传统的空肠弯曲菌分离方法对CRISPR-Cas12b阳性样本进行操作，以确定其中空肠弯曲菌的确切含量。黄钰等[32]亦借助空肠弯曲菌特异性保守性的靶标序列，开发了基于CRISPR-Cas12b的空肠弯曲菌检测系统，并发现该方法检测限为10CFU/g，显著优于检测限为1000 CFU/g的传统分离培养鉴定方法。

结核病是一种由结核分枝杆菌引起严重时可致死亡的慢性缓发性传染病，是全球公共卫生问题之一。通过应用环介导等温扩增反应(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)结合CRISPR-Cas12b系统的检测策略，Sam, Ikuan等人[33]构建一种可在2小时内检测出低至1.3 copy/μL结核分枝杆菌DNA的检测平台，并将其命名为TB-QUICK，相较于市面上所售的试剂盒检测结果波动性较大的特点，该方法可较为灵敏快速的检测出目标病原微生物的DNA，展现了其在临床场合中的应用前景。表3详细列举了基于Cas12对病原微生物的检测方法。

Table 3. Detection of foodborne pathogenic microorganisms based on CRISPR-Cas12 system

表3. 基于CRISPR-Cas12系统对食源性病原微生物检测

病原微生物	核酸	信号放大方式	检测限	检测方式	参考文献
诺如病毒	RNA	RT-RPA	9.65 × 10^2/ml	荧光/横向流动检测	[34]
诺如病毒	RNA	RT-RAA	0.1 copies/μl	荧光/横向流动检测	[35]
金黄色葡萄球菌	DNA	RPA	20 cfu/ml	横向流动检测	[36]
金黄色葡萄球菌	DNA	RPA	1−10 copies/μl	裸眼/横向流动检测	[37]
金黄色葡萄球菌	DNA	SRCA	3 cfu/ml	电化学生物传感	[38]
弗氏志贺菌	DNA	LAMP	40 copies/μl	裸眼	[39]
副溶血性弧菌	DNA	RAA	6.7 × 10^1 cfu/ml	荧光信号	[40]
副溶血性弧菌	DNA	LAMP	30 copies/反应	裸眼	[41]
副溶血性弧菌	DNA	PCR	1.02 × 10^2copies/μl	荧光信号	[42]
副溶血性弧菌	DNA	LAMP	100 cpoies/μl	裸眼荧光信号	[43]
副溶血性弧菌	DNA	LAMP	1.36 × 10^2 copies	免标记荧光视觉检测	[44]
副溶血性弧菌	DNA	LAMP	9.8 cfu/反应	裸眼	[45]
沙门氏菌	DNA	——	1 cfu/ml	裸眼	[46]
沙门氏菌	DNA	LAMP	1.22 × 10^0cfu/ml	横向流动检测	[47]
沙门氏菌	DNA	RPA	1 × 10^−^4 ng/μl	荧光信号	[48]
沙门氏菌	DNA	hHCR	8 cfu/ml	荧光检测	[49]
沙门氏菌	DNA	——	1 cfu/ml	裸眼/手机程序	[50]
沙门氏菌	DNA	LAMP	118 pg/μl	裸眼/荧光检测	[51]
沙门氏菌	DNA	SRCA	2.08 fg/μl	电化学生物传感	[52]
鼠伤寒沙门氏菌	DNA	——	5 cfu/ml	荧光信号	[53]
大肠杆菌O157:H7	DNA	RPA	——	比色检测	[54]
蜡样芽孢杆菌	DNA	RAA	<500 cfu/ml	荧光信号	[29]

3.3. 基于Cas13检测食源性病原微生物

相较于稳定性更好的DNA，RNA在细菌中代谢快的特点引导其作为指示细菌生存状态的指标。Cas13蛋白以RNA作为靶标并且在食源性病原微生物检测领域具有广阔的发展前景。

Cas13a是目前发现的系统中唯一靶向ssRNA的核酸酶[55]，并且其附属切割活性也只针对ssRNA，Cas13a能够运用在检测多种病毒的情况。张锋团队[56]开发了一种基于LwCas13a的检测工具——特异性高灵敏度酶促解锁(Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unlocking, SHERLOCK)。此外，该检测技术最早被应用于寨卡病毒和登革热病毒的检测，并展示了其潜在的广泛应用性。在SHERLOCLK体系中，首先利用重组酶聚合酶扩增反应(recombinase polymerase amplification, RPA)或逆转录重组酶聚合酶扩增反应(reverse transcription recombinase polymerase amplification, RT-RPA)在特定温度下对病毒核酸进行扩增，以此提高检测系统灵敏度。将扩增后的产物加至CRISPR-Cas13a体系，系统中的crRNA特异性识别到靶标核酸时，系统内部附带的核酸酶激活并释放出用于信号显示的报告标志，完成整个检测流程。互补的靶RNA结合后CRISPR-Cas13-RNA复合物被激活，进而触发非特异性RNA报告子的附带切割活性[57] [58]，对周边非特异的RNA也进行切割。基于该原理可在反应体系中加入非特异RNA报告探针，实现对靶标分子的特异性检测：被荧光标记的报告部分在完整时受到抑制不发光，被激活的CRISPR-Cas13复合物切割后，抑制解除发出荧光，从而达到检测目的。

苏璇等[59]通过CRISPR-Cas13a系统辅助重组酶介导的等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification, RAA)对金黄色葡萄球菌进行检测识别。在研究中Cas13a蛋白被表达与纯化，将质粒pC019-LwCas13a中的CRISPR-Cas13a目的基因亚克隆至psmarti载体，将经正确克隆操作的质粒转化至感受态大肠杆菌细胞中，对诱导温度和诱导剂浓度等表达条件进行优化并诱导表达。经由设计后针对金黄色葡萄球菌耐热性核酸酶基因保守区序列，合成特定的RAA引物与探针，将优化后的RAA反应体系和反应条件应用于金黄色葡萄球菌DNA经梯度稀释至10⁵~10⁶ CFU/mL的CRISPR-Cas13a辅助RAA检测。CRISPR-Cas13a系统反应最短时间出现最明显信号的基础上，对RAA反应体系、反应条件以及CRISPR-Cas13a检测温度、检测时间进行精确调校。

Zhou等[60]基于CRISPR-Cas13a系统构建细菌检测平台对食品样品中的病原微生物金黄色葡萄球菌进行检测。利用CRISPR-Cas13a系统中crRNA可编程性和Cas13a混杂RNase活性对目标RNA识别的“附带效应”，开发了一种细菌传感策略，命名为CCB-Detection (CRISPR-Cas13a based bacteria Detection)。金黄色葡萄球菌被作为模型菌，验证该方法检测的性能(如图2(d))。通过提取目的基因的DNA用PCR法进行扩增并进行体外转录，借助RNA的“附带效应”报告信号。经由实验发现其目标基因组DNA检测限为1 CFU/mL，金黄色葡萄球菌动态检测范围为10⁰~10⁷ CFU/mL。该方法检测时间短，灵敏度高且具有良好的特异性和简便性。

安柏霖等[61]采用RAA反应联合CRISPR-Cas13a系统对包括沙门氏菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7在内的四种腹泻致病微生物进行检测。通过对荧光检测信号进行指数放大以达到检测结果快速检出的目的，检测结果在35 min内均可准确检出，其中沙门氏菌最低检测限为1 copy/μL，其余三种病原微生物志贺氏菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157：H7的检测限为10 copies/μL。

2017年Smargon等人[62]研究发现不同于Cas13a的另一种蛋白Cas13b，该蛋白发挥作用时所需PFS结构存在于目标RNA两端的特点增加了系统对ssRNA的切割限制。如表4列举了基于Cas13对病原微生物的检测方法。

Table 4. Detection of foodborne pathogenic microorganisms based on CRISPR-Cas13 system

表4. 基于CRISPR-Cas13系统对食源性病原微生物检测

病原微生物	核酸	信号放大方式	检测限	检测方式	参考文献
SARS-CoV-2	RNA	RT-LAMP	100 copies/μl	荧光信号	[63]
诺如病毒	RNA	RPA	5 copies	荧光检测	[64]
沙门氏菌	DNA	PCR	10 cfu/ml	荧光信号	[65]
沙门氏菌	DNA	RPA	10 copies	探针检测	[66]
沙门氏菌	DNA	RT-qPCR	1−10^5 cfu	荧光信号	[67]
金黄色葡萄球菌	DNA	PCR	1 cfu/ml	“附带效应”报告信号	[60]
金黄色葡萄球菌	DNA	PCR	2.4 copies/µl	——	[68]
蜡样芽孢杆菌	RNA	——	10 cfu	直接检测	[69]

(a)

(b)

(c)

(d)

Figure 2. (a) Principle of CRISPR-Cas9-mediated lateral flow nucleic acid assay; (b) Two-step isothermal amplification for the detection of E. coli by the CRISPR-Cas9 system; (c) Principle of the one-way valve; (d) Detection process for S. aureus

图2. (a) CRISPR-Cas9介导的横向流动核酸检测原理；(b) 基于CRISPR-Cas9系统两步等温扩增方法检测大肠杆菌；(c) 单向阀的工作原理；(d) 金黄色葡萄球菌检测过程示意图

4. 总结与展望

在约90%的古细菌以及40%的细菌基因组中发现有CRISPR-Cas系统的存在，自发现以来，除了广泛作为基因编辑工具应用于各个领域并展现出强大的基因编辑能力外，其在微生物的耐药性[70]与毒性研究方面得到发展，在微生物检测方面也有新的进展。较传统检测方法相比，CRISPR-Cas系统作为生物传感器在食源性病原微生物的检测方面所显示出的特异性强、灵敏度高、检测速度快、适用条件温和等诸多优点是以往检测方法所不具备的。现已有研究基于CRISPR-Cas系统如荧光信号、比色信号、电化学信号等多种传感系统已应用于食源性病原微生物检测方面，基于CRISPR-Cas系统开发出的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测试剂盒SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)和DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRPSPR trans reporter)也已在美国获批[71]。即使现阶段的应用研究处于起步时期，存在一定的局限性如可能发生气溶胶污染、检测试剂成本较高、稳定性不够良好等，随着研究的进一步深入，各种新技术新方法将与CRISPR-Cas系统进行结合，更为简单高效的CRISPR-Cas生物传感系统可预见地将被广泛应用于食源性病原微生物检测的各个方面，为食源性病原微生物检测的发展提供理论与技术支持并展示出广阔的应用前景，对食品安全等诸多方面提供强有力的保障。

基金项目

国家自然科学基金(项目号：32302218)，题目：基于磁性CRISPR/Cas13a-SERS生物传感的诺如病毒高敏即时检测及机理研究；中国博士后科学基金会(项目号：2021M702460)，题目：基于CRISPR-Cas12a的新型冠状病毒及其突变体快速可视化检测新方法研究；天津市自然科学基金(项目号：21JCQNJC01410)，题目：基于CRISPR-Cas12a可视化检测高危型人乳头瘤病毒生物传感器的构建及其在宫颈癌临床筛查中的初步应用；食品营养与安全教育部重点实验室暨天津市食品营养与安全重点实验室开放基金资助项目(项目号：SKLFNS-KF-202210)，题目：基于CRISPR-Cas12a耦合纳米金比色生物传感器的食源性诺如病毒快速可视化检测新方法研究；工业发酵微生物教育部重点实验室暨天津市工业微生物重点实验室资助课题(项目号：2022KF0203)，题目：基于CRISPR-Cas12a可视化生物传感器的构建及其在白酒发酵过程中乳酸菌快速检测研究；酿酒生物技术及应用四川省重点实验室资助项目(项目号：NJ2023-03)，题目：基于CRISPR/Cas12a可视化生物传感器的构建及其在白酒发酵过程中酵母菌快速定量检测研究。

NOTES

^*通讯作者。