基于数据挖掘及网络药理学探讨刘艳巧治疗不孕症的组方规律

Exploring the Compositional Principles of Liu Yanqiao’s Treatment for Infertility Based on Data Mining and Network Pharmacology

摘要: 目的：本研究旨在通过中医传承辅助平台(V3.0)和网络药理学方法，深入探究刘艳巧教授在治疗女性不孕症方面的用药规律。方法：本研究回顾性分析了刘艳巧教授治疗女性不孕症的100首门诊处方，并依托中医传承辅助平台(V3.0)建立了中药处方数据库。通过对用药频次、药物的四气、五味、归经分布等数据的统计分析，系统总结了刘教授的用药特点。同时，构建了“药物–活性成分–靶点”网络，利用STRING数据库对PPI网络进行了深入分析，进行了GO和KEGG通路富集分析。结果：在纳入的100首处方中，共涉及112种中药，其中使用频次超过45次的中药有10种。这些中药的药味以甘、苦为主，药性以温性居多，多归入肝肾脾经，主要具有补血行气、活血化瘀的功效。关联规则分析显示，“茯苓–柴胡–当归”为具有显著关联性的核心药物组合，通过药物–疾病靶点分析，共发现59个交集靶点。GO功能富集分析揭示了364个生物过程、35个细胞组分和60个分子功能条目。KEGG通路富集分析则指出了99条相关通路，主要涉及癌症中的蛋白聚糖信号通路和神经活性配体–受体相互作用信号通路等。结论：刘艳巧教授在治疗女性不孕症时，常将“气滞血瘀”视为临床常见症候，并擅长应用活血化瘀类药物进行治疗。核心药物组合“茯苓–柴胡–当归”通过调和气血、疏通经络等多种途径，改善女性生殖系统的功能，从而辅助治疗不孕不育症。此外，中药治疗不孕症的作用通路主要富集在癌症中的蛋白聚糖信号通路和神经活性配体–受体相互作用通路上，这两个通路的异常可能与不孕症的发生有关，而中药可能通过调节这两个通路中的关键分子，来恢复生殖系统的正常功能。

Abstract: Objective: This study aims to deeply explore the medication patterns of Professor Liu Yanqiao in treating female infertility through the Traditional Chinese Medicine Inheritance Support System (V3.0) and network pharmacology methods. Methods: A retrospective analysis was conducted on 100 outpatient prescriptions of Professor Liu Yanqiao for female infertility, and a traditional Chinese medicine prescription database was established using the Traditional Chinese Medicine Inheritance Support System (V3.0). Through statistical analysis of medication frequency, the four properties, five flavors, and meridian tropism distribution of the herbs, the medication characteristics of Professor Liu were systematically summarized. Additionally, a “drug-active component-target” network was constructed, and the PPI network was analyzed in depth using the STRING database for further GO and KEGG pathway enrichment analysis. Results: Among the 100 prescriptions included, 112 traditional Chinese medicines were involved, with 10 herbs used more than 45 times. These herbs primarily had sweet and bitter flavors, warm properties, and were mainly attributed to the liver, kidney, and spleen meridians, exhibiting significant blood-enriching, qi-moving, and blood-activating effects. Association rule analysis indicated that “Poria cocos-Bupleurum-Angelica sinensis” was a strongly associated core drug combination. Through drug-disease target analysis, a total of 59 intersection targets were identified. GO functional enrichment analysis revealed 364 biological processes, 35 cellular components, and 60 molecular function entries. KEGG pathway enrichment analysis pointed out 99 relevant pathways, mainly involving proteoglycan signaling pathways in cancer and neuroactive ligand-receptor interaction signaling pathways. Conclusion: Professor Liu Yanqiao often considers “qi stagnation and blood stasis” as a common clinical syndrome in treating female infertility and is adept at using blood-activating and qi-moving herbs for treatment. The core drug combination of “Poria cocos-Bupleurum-Angelica sinensis” improves the function of the female reproductive system through various pathways such as regulating qi and blood and unblocking meridians, thus assisting in the treatment of infertility. Furthermore, the therapeutic pathways of traditional Chinese medicine in treating infertility are primarily enriched in proteoglycan signaling pathways in cancer and neuroactive ligand-receptor interaction signaling pathways. Abnormalities in these two pathways may be related to the occurrence of infertility, and traditional Chinese medicine may restore the normal function of the reproductive system by regulating key molecules in these pathways.

1. 引言

不孕症是一种低生育力状态，定义为男女双方在未采取任何避孕措施、有规律地性生活至少一年后仍没有成功妊娠者[1]。不孕症对育龄期女性的生殖健康构成了严重威胁，其临床病情复杂多样。随着“三胎”政策的提出，不孕夫妇面临的压力逐渐增大，心理因素在一定程度上会影响生殖功能[2]。若未能及时对不孕症患者进行有效的临床治疗，将对患者的生活造成严重的负面影响[3]。

刘艳巧教授，教授，主任医师，硕士生导师。2022年全国名老中医药专家传承工作室建设项目专家。第四批全国名老中医学术经验继承人，第六批全国老中医学术经验继承工作指导老师，中国中医科学院临床医学(中医师承)博士学位，现任中华中医药学会中医妇科分会委员、中医诊断学分会委员，陕西省中医药学会、中西医结合学会妇科委员会副主任委员，陕西省优秀青年科技工作者。从事临床中西医结合诊治妇科疾病研究工作30余年，在中医诊治不孕症患者上有着独特的见解。

近年来，中医在女性不孕症的治疗中逐渐受到患者的青睐[4]，能够更全面地调节患者身体状况，减少不良反应和并发症的发生[5]。中医认为，女性不孕症与脏腑功能失常、内分泌紊乱等因素密切相关[6]。因此，中医治疗不孕症时注重调节脏腑功能、平衡气血、祛除病因等方面，以达到标本兼治的效果[7] [8]。本研究借助中医传承计算平台(V3.0)，对刘艳巧教授治疗女性不孕症的经典案例有效处方进行数据挖掘，深入分析患者的证型和用药性能，总结其用药规律。同时，通过网络药理学方法，明确核心药对治疗不孕症的活性成分、作用靶点及作用机制，以期为临床应用提供一定的科学依据。

2. 资料与方法

2.1. 资料来源

收集2020年6月至2022年6月西安交通大学第二附属医院刘艳巧全国名老中医药传承工作室诊治的女性不孕症有效病例，共纳入经典案例有效处方100首。

2.2. 纳入标准

(1) 诊断标准：婚后夫妇同居1年以上，配偶生殖功能正常，未避孕而未受孕者，称为原发性不孕症；曾有孕育，未避孕1年以上未再受孕者，称为继发性不孕症。(2) 年龄：为20~40岁的已婚妇女。(3) 治疗方案为中药汤剂口服，200 ml/次，2次/d，门诊复诊次数超过3次，且病案资料完整。

2.3. 排除标准

(1) 排除非慢性输卵管炎因素所致的不孕症，如输卵管间质部阻塞、合并卵巢性不孕等。(2) 排除患有心脑血管、肝、肾、内分泌和造血系统紊乱等合并症的患者，以及不孕症之外的正在应用其他对试验药物有影响治疗的患者。(3) 排除对中药过敏的敏感体质的患者。

2.4. 数据录入及分析

首先，将符合研究标准的患者信息整理至Excel表格中，并依据《中药学》和《中华人民共和国药典》的规范，统一处方中的药物名称。使用中医传承辅助平台V3.0建立中药治疗不孕症数据库，统计用药频次统计、药物四气、五味、归经，组方规律分析。

2.5. 中药化合物筛选及靶点预测

将“茯苓–柴胡–当归”三种中药的化学成分输入中药系统药理学分析平台(TCMSP)、得出最佳药物组合的有效成分及靶点。基于口服生物利用度(OB)和类药性(DL)的阈值(OB ≥ 30%和DL ≥ 0.18) [9]，筛选出治疗不孕症的候选成分。随后，借助Uniprot蛋白数据库，专注于“homo sapiens”相关蛋白的筛选，并结合Swiss target Prediction数据库，预测这些成分可能作用的靶点蛋白[10]。最后，利用Pubchem数据库验证和预测药物靶点，确保其可靠性和准确性[11]。

2.6. 不孕症靶基因的检索

通过设置关键词“infertility”和“female infertility”在TTD、Drugbank和DisGeNET数据库中检索与不孕症相关的靶基因，并限定物种为“homo sapiens”。检索到的不同ID类型被统一转换为Uniprot格式[12]。

2.7. 蛋白质相互作用网络的构建

利用Venny网站找出不孕症靶基因与药物潜在靶点的交集，绘制Venn图，并通过STRING网站构建蛋白质相互作用网络(PPI)，以揭示靶蛋白之间的网络关系。采用Cytoscape 3.9.0软件对PPI结果进行分析，其中节点大小代表度值，边的粗细代表结合分数，两者共同反映了蛋白间的相互作用强度[13]。

2.8. GO与KEGG富集分析

将潜在靶点导入DAVID数据库，以P < 0.05为条件，获取前10个生物过程、细胞组分、分子功能和前20条KEGG信号通路，在微生信网站中进行可视化处理[14]。

3. 结果

3.1. 数据挖掘结果

3.1.1. 用药频次分析

针对录入的100首处方，进行了详尽的“药物使用频次”分析。分析结果显示，这些处方共涉及了112种不同的中药材，总计使用频次达到了2013次。在这些中药材中，有10味药材的使用频次尤为突出，均超过了45次。其中当归成为了使用频次最高的单味药物，其出现次数高达89次，显著领先于其他药材。紧随其后的依次为白术、柴胡、茯苓、白芍、熟地黄、黄芪、山药、延胡索和红花。这些高频次使用的中药材及其具体频次已详细列于表1中。

Table 1. High-frequency drug statistical frequency table

表1. 高频药物统计频次表

序号	药物名称	出现频次
1	当归	89
2	白术	75
3	柴胡	65
4	茯苓	63
5	白芍	61
6	熟地黄	60
7	黄芪	50
8	山药	46
9	延胡索	46
10	红花	45

3.1.2. 中药饮片四气、五味、归经

对中药饮片的四气、五味及归经特性进行了统计分析，涉及112味中药。在四气分类中，温性药物出现频次最高，达845次，其次是寒性537次和平性463次。五味分类中，甘味药物频次最高，为1067次，苦味和辛味药物分别以960次和590次位列其后。在归经分析中，归肝经药物频次最高，为1343次，随后是归肾经778次和脾经779次。药物四气、五味及归经的雷达图分布如下。见图1。

Figure 1. Statistical radar diagram of drug four gases, five flavors and meridian statistics

图1. 药物四气、五味、归经统计雷达图

3.1.3. 中药饮片的功效分析

在中医传承计算平台对124味中药饮片进行功效统计，结果显示其功效可分为10大类。其中，补虚类功效频次最高，达到806次；这类中药可能通过增强患者的体质，改善气血状况，从而在不孕症的治疗中发挥作用。活血化瘀类和清热类功效紧随其后，频次分别为442次和189次。功效统计图见图2。通过补虚类中药增强患者体质，改善气血状况，为受孕创造更好的条件。利用活血化瘀类中药改善血液循环，增加子宫和卵巢的血液供应，提高受孕率，并预防和治疗因输卵管阻塞引起的不孕症。借助清热类中药清除体内的热量和毒素，改善因热邪引起的不孕症状。

Figure 2. Frequency chart of efficacy statistics

图2. 功效统计频次图

3.1.4. 药物关联规则分析

基于药物关联规则分析处方规律，关联规则置信度从大到小的顺序进行排序，置信度在0.9以上的关联规则有22条。关联分析见表2。

Table 2. Association analysis

表2. 关联分析

序号	关联规则	置信度
1	茯苓，柴胡→当归	1
2	白术，茯苓→当归	1
3	白术，柴胡→当归	1
4	白术，茯苓，柴胡→当归	1
5	柴胡→当归	1
6	白术→当归	1
7	柴胡→茯苓	0.98
8	当归，柴胡→茯苓	0.98
9	当归，茯苓→柴胡	0.98
10	当归，茯苓→白术	0.98
11	茯苓→当归	0.98
12	当归，柴胡→白术	0.98
13	柴胡→白术	0.98
14	当归，茯苓，柴胡→白术	0.98
15	当归，白术，柴胡→茯苓	0.98
16	当归，白术，茯苓→柴胡	0.98
17	茯苓，柴胡→白术	0.98
18	白术，柴胡→茯苓	0.98
19	白术，茯苓→柴胡	0.98
20	茯苓→柴胡	0.96
21	茯苓→白术	0.96
22	当归→白术	0.94

3.2. 网络药理学分析

3.2.1. 代表药物的活性化学成分

运用TCMSP数据库，筛选出34种化合物，其中茯苓15种，柴胡17种，当归2种，主要潜在化合物见表3。

Table 3. Active ingredients of Poria cocos-Bupleurum-Angelica sinensis (OB ≥ 30%, DL ≥ 0.18)

表3. 茯苓–柴胡–当归活性成分(OB ≥ 30%, DL ≥ 0.18)

来源中药	分子ID	活性成分	OB/%	DL
茯苓	MOL000273	(2R)-2-[(3S,5R,10S,13R,14R,16R,17R)- 3,16-dihydroxy-4,4,10,13,14-pentamethyl-2,3,5,6,12,15,16,17-octahydro-1H- cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-6- methylhept-5-enoic acid	30.93	0.81
茯苓	MOL000275	trametenolic acid	38.71	0.8
茯苓	MOL000276	7,9(11)-dehydropachymic acid	35.11	0.81
茯苓	MOL000279	Cerevisterol	37.96	0.77
茯苓	MOL000280	(2R)-2-[(3S,5R,10S,13R,14R,16R,17R)- 3,16-dihydroxy-4,4,10,13,14-pentamethyl- 2,3,5,6,12,15,16,17-octahydro-1H- cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-5- isopropyl-hex-5-enoic acid	31.07	0.82
茯苓	MOL000282	ergosta-7,22E-dien-3beta-ol	43.51	0.72
茯苓	MOL000283	Ergosterol peroxide	40.36	0.81
茯苓	MOL000285	(2R)-2-[(5R,10S,13R,14R,16R,17R)-16- hydroxy-3-keto-4,4,10,13,14-pentamethyl-1,2,5,6,12,15,16,17-octahydrocyclopenta[a] phenanthren-17-yl]-5-isopropyl-hex-5- enoic acid	38.26	0.82
茯苓	MOL000287	3beta-Hydroxy-24-methylene-8- lanostene-21-oic acid	38.7	0.81
茯苓	MOL000289	pachymic acid	33.63	0.81
茯苓	MOL000290	Poricoic acid A	30.61	0.76
茯苓	MOL000291	Poricoic acid B	30.52	0.75
茯苓	MOL000292	poricoic acid C	38.15	0.75
茯苓	MOL000296	hederagenin	36.91	0.75
茯苓	MOL000300	dehydroeburicoic acid	44.17	0.83
柴胡	MOL001645	Linoleyl acetate	42.1	0.2
柴胡	MOL002776	Baicalin	40.12	0.75
柴胡	MOL000449	Stigmasterol	43.83	0.76
柴胡	MOL000354	isorhamnetin	49.6	0.31
柴胡	MOL000422	kaempferol	41.88	0.24
柴胡	MOL004598	3,5,6,7-tetramethoxy-2-(3,4,5- trimethoxyphenyl)chromone	31.97	0.59
柴胡	MOL004609	Areapillin	48.96	0.41
柴胡	MOL013187	Cubebin	57.13	0.64
柴胡	MOL004624	Longikaurin A	47.72	0.53
柴胡	MOL004628	Octalupine	47.82	0.28
柴胡	MOL004644	Sainfuran	79.91	0.23
柴胡	MOL004648	Troxerutin	31.6	0.28
柴胡	MOL004653	(+)-Anomalin	46.06	0.66
柴胡	MOL004702	saikosaponin c_qt	30.5	0.63
柴胡	MOL004718	α-spinasterol	42.98	0.76
柴胡	MOL000490	petunidin	30.05	0.31
柴胡	MOL000098	quercetin	46.43	0.28
当归	MOL000358	beta-sitosterol	36.91	0.75
当归	MOL000449	Stigmasterol	43.83	0.76

3.2.2. 交集靶点构建

研究检索TTD、Drugbank和DisGeNET数据库，共获取1427个疾病靶点；将3种药物化合物潜在靶点和不孕症靶基因取交集，得到59个交集靶点(图3)。

Figure 3. Intersection targets

图3. 交集靶点

3.2.3. 交集靶基因蛋白相互作用网络图的构建与分析

将26个交集靶点导入STRING数据库后建立靶向PPI网络图，图中有59个节点和396条边，平均节点度为13.4，平均局部聚类系数为0.684 (图4)，可知TNF，MAPK3，AKT1，和ESR1是整个网络中的核心蛋白，说明BHD可通过这些蛋白发挥治疗作用。

Figure 4. The PPI network diagram

图4. PPI网络图

3.2.4. 交集基因GO功能富集分析

GO功能富集分析共取得459个功能，其中生物过程(BP) 364条，细胞成分(CC) 35条，分子功能(MF) 60条，依据P值(P < 0.05)排序，每个模块前10位的条目图如图5所示。生物过程主要集中在炎症反应、基因表达的正负调节过程；细胞成分主要集中在大分子复合物、血浆膜；分子功能主要集中在DNA聚合酶II转录因子活性、配体激活序列特异性DNA结合、类固醇结合酶等。

3.2.5. 交集基因KEGG通路富集分析

利用DAVID数据库对59个靶点进行KEGG分析和通路富集分析，取前20条信号通路(P < 0.05)，构建气泡图(图6)。中药治疗不孕症的作用通路主要富集在癌症中蛋白聚糖信号通路和神经活性配体–受体相互作用通路上。神经活性配体–受体相互作用在生物体内参与多种生理和病理过程，包括神经系统活动、内分泌调节等，这些过程与生育功能密切相关。此外，某些与不孕症相关的基因或信号通路可能与癌症中的蛋白聚糖信号通路有重叠或交叉。

Figure 5. GO pathway enrichment analysis

图5. GO通路富集分析

Figure 6. KEGG pathway enrichment analysis

图6. KEGG通路富集分析

4. 讨论

女性不孕症的核心病位在胞宫，并以冲、任脉为主，涉及肾、肝、脾等脏腑[15] [16]。通过数据挖掘与分析，本研究深入分析了100首处方，发现其中涉及112种中药材，总使用频次达2013次。当归因其补血调经之效成为使用频次最高的药物。温性药物的高频次使用，即通过温补调和体内阴阳失衡。甘味药物占据主导，体现了“甘能补、能和、能缓”的用药理念，用于调和机体功能[17]。归肝经药物的高频次，反映了中医对肝脏在气血调节中核心地位的重视。气滞血瘀型是刘教授在临床上最为常见的证候类型，针对这一特定的证候类型，刘教授擅长应用一个核心药物组合，其中包含茯苓、柴胡和当归三味药物。茯苓以其健脾利湿、宁心安神的特性，有助于湿邪的运化与排除；柴胡则擅长疏肝解郁，调节情志，缓解肝气郁结的症状；当归的挥发油成分能有效抑制子宫平滑肌的病理性痉挛，临床上常用于调经止痛[18]。这三味药物的联合应用，旨在实现活血化瘀、行气止痛以及健脾利湿的综合治疗效果，从而针对气滞血瘀型不孕症达到标本兼治的目的。

通过对“药物–活性成分–靶点”网络分析显示，“茯苓–柴胡–当归”组合度值较高的有效成分为β-谷甾醇、豆甾醇、星甾醇、啤酒甾醇、曲米烯酸、16α-羟基脱氢苯甲烯等。其中多数有效成分可以调节内分泌环境、改善生殖系统微环境、还可能在整个不孕症治疗过程中起到辅助治疗的作用[19] [20]。采用网络药理学预测“茯苓–柴胡–当归”治疗不孕症的核心靶点为TNF、MAPK3、AKT1、ESR1、HIF1A、IL1B、PPARG。不孕症的病理机制与卵巢功能障碍、子宫内膜因素、激素不平衡、炎症反应等有关[21]，其中TNF在卵巢功能、子宫内膜健康和胚胎植入等方面可能发挥作用，在某些情况下，高水平的TNF可能干扰生殖系统的正常功能。治疗不孕症时，降低TNF水平可能有助于改善卵巢功能和子宫内膜环境，提高生育机会[22]；MAPK3和AKT1参与细胞信号传导通路，对卵子的发育和卵巢功能具有重要影响[23] [24]；ESR1参与了雌激素的信号传导，对子宫内膜容受性、卵子质量、激素水平等都有影响[25]；HIF-1A在低氧条件下被激活，进而促进子宫内膜血管网络的扩展和重塑，增加血液供应，从而改善局部氧气和营养物质的供应情况。这一过程对于胚胎的着床和后续发育至关重要，因为充足的氧气和营养是胚胎正常发育的基石[26]；IL1B参与了炎症反应和免疫应答，IL1B可能通过影响子宫内膜容受性和卵子质量等影响生育能力[27]；PPARG是参与了脂肪细胞分化、糖代谢和炎症等过程，PPARG可能对子宫内膜容受性和激素水平等有影响[28]。

本研究分析表明，“茯苓–柴胡–当归”治疗不孕症具有“多靶点，多通路”的特点，涉及到多个生物学和分子水平的因素，包括细胞信号传导、激素调节、炎症反应和免疫系统等[29]。在探究其治疗机制时，发现其作用通路主要富集在癌症中的蛋白聚糖信号通路和神经活性配体–受体相互作用通路上。这两个通路在生物体内扮演着重要的角色，与不孕症的发生和发展密切相关[30] [31]。中药治疗不孕症的作用机制可能可能通过调节蛋白聚糖信号通路中的关键基因和蛋白质，来影响生殖细胞的发育和成熟，从而改善不孕症的症状。另一方面，中药也可能通过调节神经活性配体–受体相互作用通路中的关键分子，来恢复生殖系统的内分泌调节功能，促进生育[32] [33]。

综上所述，本研究基于中医传承辅助平台与网络药理学，分析刘教授使用中医药治疗不孕症中辨证气滞血瘀证居多，治法以活血化瘀法为重，用药以补气药和活血化瘀药为主，在组方规律上“茯苓–柴胡–当归”是核心药物组合，其核心成分包括β-谷甾醇、豆甾醇、星甾醇等，核心靶点包括TNF、MAPK3、AKT1等，通过癌症中的蛋白聚糖信号通路和神经活性配体–受体相互作用信号通路发挥干预不孕症的作用。尽管本研究取得了显著的成果，但鉴于纳入的病例数量相对较少，分析结果可能存在一定的局限性。因此，期待在未来的研究中，能够进一步扩大样本量，深化对刘教授治疗不孕症学术思想的探索。通过不断的研究和完善，能够更加科学、有效地传承与发扬刘教授在中医药治疗不孕症领域的宝贵经验，为更多患者带来福音。不仅是对刘教授学术思想的传承与升华，更是对中医药学宝贵遗产的珍视与发扬。

基金项目

刘艳巧全国名老中医药专家传承工作室(陕中医药函(2022) 36号)。

NOTES

^*通讯作者。