摘要:
目的：用高嗜肝性的重组8型腺相关病毒载体携带C基因型(adr亚型) 1.3拷贝乙型肝炎病毒，建立HBV持续复制的小鼠病毒性肝损伤模型。方法：将rAAV8-1.3HBV经尾静脉注射到78只C57BL/6小鼠体内，通过定量检测血清中HBV DNA、HBeAg、HBsAg含量，同时检测血清学AST、ALT活力值以及病毒注射后8周、12周、16周、20周、24周时取实验组动物肝脏做HE染色分析，最终建立HBV持续复制的小鼠病毒性肝损伤模型。结果：C57BL/6小鼠注射rAAV8-1.3HBV后，8周至24周小鼠血清中可检测出稳定表达的HBV，且20周和24周HE染色病理结果显示肝组织内可见肝小叶内点状、灶状以淋巴、单核细胞为主的炎细胞浸润，肝小叶内的炎性浸润灶数量较多，分布范围较广，与对照组相比，病变程度及累计范围明显加重。结论：利用rAAV8体内转导C57BL/6小鼠，成功地建立了HBV病毒性肝损伤小鼠模型，此模型在病毒注射20周后逐渐出现病毒性肝损伤特征，可用于病毒性肝损伤的研究。
Abstract:
Purpose: To infect mice with liver-tropic recombinant adeno-associated virus type 8 (rAAV8) vector carrying C genotype (adr subtype) 1.3 copies of Hepatitis B virus (HBV) to create a mouse model for HBV-induced liver injury. Methods: First, rAAV8-1.3HBV was injected into the tail vein of 78 C57BL/6 mice. Quantitative detections of HBV DNA, HBeAg and HBsAg in serum showed that a mouse model of HBV continuous replication was established. Serological examinations for AST, ALT activity values and liver tissue staining of the satellite animals were performed at 8 weeks, 12 weeks, 16 weeks, 20 weeks, and 24 weeks following virus administration. Finally, a mouse model of viral liver injury with sustained replication of HBV was established. Results: After injection of rAAV8-1.3HBV in C57BL/6 mice, stable expression of HBV was detected in the serum of mice during the period from 8 weeks to 24 weeks, and the pathological results revealed by HE staining at 20 and 24 weeks showed visible lesions, foci, and lymphoid cells in hepatic lobules in the liver tissue accompanied by inflammation and monocyte invasion. There was a relatively high count with a wide distribution range of invasive cells in the hepatic lobules. Compared with the control group, the degree and total range of lesions were significantly elevated. Conclusion: The mouse model of HBV viral liver injury was successfully established by in vivo administration of rAAV8 into C57BL/6 mice. The created model showed the characteristics of the gradual development of liver injury suggestive of hepatic infection during the 20 weeks following virus administration. Therefore, this model may be used to study virus infection induced liver injury.
1. 引言
乙型病毒性肝炎(viral hepatitis type B)，简称乙型肝炎，是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的以肝脏炎性病变为主的一种传染病，并且该病与肝硬化和肝细胞癌的发生密切相关，严重威胁着人们的生活与健康 [1]。近年来，乙型肝炎发病率呈明显增长趋势，据世界卫生报道，全球约20亿人曾感染过HBV，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌等。其发病机制与病毒感染、免疫调节紊乱有关，以肝细胞损伤为主要特征。
目前大部分学者认为，乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的一种免疫相关性疾病，机体感染HBV后的肝细胞损伤并非其在肝细胞内复制繁殖直接作用的结果，而是一系列宿主免疫反应引起肝细胞的病理性免疫反应，最终造成肝细胞的损害 [2] [3]。所以，在现代研究中，大部分学者选用免疫性肝损伤动物模型作为病毒性肝炎的常用模型。本研究是将rAAV8-1.3HBV病毒经尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内 [4] [5]，结合血液学及病理检测方法动态观察小鼠肝脏组织的病理变化，以期建立一个HBV感染引起的病毒性肝损伤模型，为进一步研究乙肝病毒的致病机制和药物筛选奠定模型基础。
2. 材料
4~6周龄雄性C57BL/6小鼠，114只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证：SCXK(京)2016-0006；实验动物寄养于北京维通达生物技术有限公司，实验动物使用许可证：SYXK(京)2014-0015，动物伦理审查编号：VTD-SY-201805。
rAAV8-1.3HBV (adr亚型)购自北京五加和分子医学研究所有限公司(规格：1E+12vg)，货号：AMV-001。
乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)定量测定试剂盒(PCR-荧光探针法)，湖南圣湘，货号2016029；
乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)测定试剂盒(电化学发光法)，罗氏，货号04687787190；
乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)测定试剂盒(电化学发光法)，罗氏，货号11820583122；
谷草转氨酶(AST)检测试剂盒(比色法)，罗氏，货号05850819190；
谷丙转氨酶(ALT)检测试剂盒(IFCC法)，罗氏，货号05850797190。
3. 实验方法
3.1. 分组及模型建立
将114只C57BL/6小鼠随机分成模型组78只和正常组36只，将rAAV8-1.3HBV (adr型，1 × 1012 vg/mL)病毒经尾静脉注射至模型组78只C57BL/6小鼠体内，同时经尾静脉注射生理盐水(1 × 1012 vg/mL)至正常组36只C57BL/6小鼠体内，建立HBV持续感染病毒性肝损伤模型。
3.2. 血生化指标检测
注射病毒1 d、3 d、1 w、2 w、4 w、6 w、8 w、10 w、12 w、16 w、20 w、24 w后，每笼随机选取1只小鼠，经眼眶取血约0.1~0.2 ml，分离血清后，吸取25 μL用PBS溶液稀释20倍，选用PCR-荧光探针法定量检测血清中HBV DNA含量，电化学发光法定量检测血清中、HBeAg、HBsAg含量；病毒注射3 w、5 w、9 w、11 w、15 w、20 w、24 w后，每笼随机选取1只小鼠，眼眶取血约0.1~0.2 ml，分离血清后，吸取25 μL用PBS溶液稀释4倍，选用电化学发光法检测血清中AST、ALT活力值。
3.3. 肝组织病理分析
病毒注射8 w、12 w、16 w、20 w、24 w后随机挑选模型组与正常组各3只动物取肝组织进行HE病理检测。取小鼠肝脏组织固定于4%多聚甲醛中，石蜡包埋，经脱水后切片进行HE染色，观察肝脏组织病变情况。
3.4. 数据分析
所有实验结果以“平均值 ± 标准误差”表示。对肝功指标原始数据进行统计分析；正常组与模型组之间方差齐性检验采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)方法进行分析；方差齐性检验采用非参数检验分析。当P值小于0.05认为差异具有显著性。所有的数据使用SPSS 22.0软件进行分析。
4. 实验结果
4.1. 血生化指标结果
4.1.1. 病毒血清学结果
病毒注射后第1天开始在血清中检测到HBV DNA的表达，并持续到第24周均为阳性。HBV-DNA表达水平呈现出一个先下降再上升然后趋于平稳表达的过程，第1天时最高，然后逐渐开始下降，6 w后维持较稳定表达水平(图1(A))。
病毒注射后第1天开始在血清中检测到HBsAg的表达，并持续到第24周均为阳性。HBsAg呈现出先上升再下降然后上升最终趋于平稳表达的过程，注射2周时降至最低，6周后维持较高表达水平(图1(B))。
病毒注射后第1天开始在血清中检测到HBeAg的表达，并持续到第24周均为阳性。HBeAg出现先上升再趋于平稳再下降表达的过程，注射2周后维持较高表达水平，但注射12 w后逐渐下降(图1(C))。
Figure 1. Virus serology as a function of the modeling cycle
图1. 病毒血清学随建模周期的变化
4.1.2. 肝功血清学结果
病毒注射后第3周开始，检测血清中肝功ALT、AST活力值，结果显示：模型组ALT、AST活力值持续高于正常组(图2(A)、图2(B))。模型组与正常组比较△P < 0.05，△△P < 0.01。
Figure 2. Changes in serum liver function with modeling cycle
图2. 血清肝功随建模周期的变化
4.2. 小鼠肝脏病理分析结果
病毒注射20周、24周后，模型组小鼠肝组织内均可见肝小叶内点状、灶状以淋巴、单核细胞为主的炎细胞浸润，与对照组相比，病变程度及累计范围明显加重，考虑为与病毒注射有关的肝脏病变(图3)。
5. 讨论
本研究通过注射rAAV-1.3HBV (adr型)病毒，持续检测病毒及肝功指标发现，病毒注射后24周内能持续表达病毒学相关指标，且肝功指标在模型组也表现为异常，病理检测显示病毒注射20周后，小鼠肝组织中出现与病毒有关的炎细胞浸润等病理变化。综上所述，通过24周的实验观察，成功建立了持续感染且肝功异常的小鼠病毒性肝损伤模型。
rAAV-1.3HBV (adr型)病毒(GenBank accession number: KX449554)，产品巧妙结合了含重复区的HBV基因组可在小鼠肝脏中复制的特点以及AAV8嗜肝细胞的特性，能够很好地在小鼠中模拟HBV持续性感染状态。多数学者只是应用此病毒研究抗病毒药物，本次实验更深一步的研究病毒感染后肝脏损伤的病理情况，能够更好的模仿临床乙肝患者肝脏损伤状况。
肝损伤的动物模型主要包括化学性肝损伤、药物性肝损伤以及免疫性肝损伤 [6] [7]，其中免疫性肝损伤模型在现代研究中认为与人感染HBV造成的肝损伤最为接近，多数研究者采用小鼠尾静脉注射刀豆蛋白A (Concanavalin A, ConA)建立免疫性肝损伤小鼠模型，其特点是通过刺激Kupffer细胞分泌IL-1、IL-6、TNF-α等多种炎性细胞因子，激活CD4 + T细胞，最终引发炎症反应，诱导肝细胞损伤 [8]，但该模型并没有HBV持续复制因素的参与，造成缺乏持续的肝损伤过程，无法完全模拟病毒感染引起的肝损伤的整个过程，建立一个更加接近临床病理过程的模型，对HBV的感染以及免疫调节类护肝药物的研发有着重要的意义。
6. 结论
在乙肝病毒感染引起的肝损伤研究过程中，理想的动物模型应该具备病毒持续感染诱发的肝脏病理变化，满足乙肝病毒感染并伴有肝损伤的模型非常难于建立，导致治疗乙肝病毒性肝损伤药物研究陷入困境，若能成功建立病毒性肝损伤模型可以帮助我们更近一步了解病毒感染与肝脏损伤的关系，也可以很大程度上帮助免疫调节类护肝药物的开发。
附录
HBV-DNA(IU/mL)：
Continued
HBeAg(COI)：
Continued
HBsAg(COI)：
Continued
ALT(U/L)：
Continued
AST(U/L)：
Continued
Continued
NOTES
*通讯作者。