1. 引言
菊花(Dendranthema morifolium (Ramat.) Tzvel.)是菊科宿根多年生的草本植物，具有较高的观赏价值和药用价值而被广泛栽培利用 [1]，但是菊花是多年生宿根花卉，在栽培管理中容易受到病毒浸染和病虫害的危害而导致叶片黄化、皱叶花叶、叶片畸形、叶背紫红色、植株矮小、花色不正常、花朵畸形、花小、花枝变短。病毒危害严重时，既影响其产量及观赏价值 [2]，还会导致全株死亡等。
为筛选出菊花组培苗的脱毒培养方法及病毒检测的最佳方法，采用已带有病毒病的菊花植株为外植体，进行植物组织培养得到带有病毒的菊花试管苗，并将已培养带病毒病的试管苗分别用：含病毒唑的培养基、昼夜变温处理、高温培养、低温培养、茎尖脱毒培养五种方法进行脱毒处理研究，再采用千日红、曼陀罗、苋色黎3种指示植物进行涂抹栽培，对其外部生长形态特征和脱毒效果观察检测，以筛选出菊花组培苗的脱毒培养方法及病毒检测的最佳方法，为菊花脱毒试管苗生产提供参考。
2. 材料与方法
2.1. 材料
自楚雄师范学院菊花栽培基地取回植株矮小、叶片黄化、皱叶花叶、叶片畸形、花色不正常的菊花(Dendranthema morifolium (Ramat.) Tzvel.)植株作外植体，经消毒后接种于愈伤诱导、茎叶分化和生根培养的培养基中，经60 d培养成菊花试管苗后，再进行以下实验。
2.2. 方法
2.2.1. 微茎尖脱毒培养技术
在解剖镜剥下剥取不同长度的菊花试管苗的顶芽、侧芽，剥取的茎尖携带1-3个叶原基的茎尖进行接种，每瓶接种3个茎尖，共接种10瓶进行培养，每7 d观察一次。
2.2.2. 试管苗抑制病毒药品处理脱毒
用已培养两个的幼嫩试管苗作为外植体，切取长约1.0 cm长菊花试管苗的顶芽、侧芽接种于含有病毒唑针剂(设5个浓度：0 mg/L、5 mg/L、7 mg/L、10 mg/L、15 mg/L)和盐酸吗啉胍(设5个浓度：0 mg/L、15 mg/L、30 mg/L、50 mg/L、70 mg/L)的MS + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 2.0 mg/L上诱导培养。以上10种培养基每种培养基接种3个茎尖，每种培养基接种3瓶，共90瓶。放于温度为25℃、光照2000 lx、每天照光12 h的组培室内培养。每3 d观察记录一次生长情况。
2.2.3. 热处理结合茎尖培养脱毒
经60 d培养成菊花试管苗采用热处理方法进行脱毒。采用两种方式进行，第一种方式为缓慢处理，把恒温水浴锅的温度设置成三个梯度：45℃、50℃、60℃，当水温达到预定温度后，把菊花试管苗分别放在不同温度下处理，每天处理8个小时，晚上9点放回组培室的培养室内进行常规培养，连续处理三天；第二种方式为快速处理，直接把恒温水浴锅的温度设为90℃，然后把经60 d培养成菊花试管苗(瓶装)放入90℃的絷水中处理5 min；晚上9点放回组培室的培养室内进行常规培养，连续处理三天；培养三周后进行脱毒效果检测。
2.2.4. 昼夜变温处理脱毒
在参照超低温保存和植物昼夜交替生物钟改变的基础上建立昼夜温差培养，选取菊花脱毒效果最佳的昼夜温差组合，设立试验如下：第一组：白天温度为5℃，晚上温度为28℃，连续处理三周；第二组：白天温度为28℃，晚上温度为5℃，连续处理三周。
2.3. 脱毒效果检测方法
2.3.1. 性状观察鉴定法
将完成脱毒处理、培养三周后的菊花脱毒苗炼苗5 d后，移栽到室外隔离栽培，进行植株生长状态、外部形态观察及脱毒效果检测。选取红壤土为栽培基质，将取回来的红壤土用细筛子筛取较细的部分备用，首先用0.5%的高锰酸钾消毒红壤土和育苗袋，从培养瓶取出脱毒苗后用多菌灵处理5 min，然后把脱毒菊花苗栽培到红壤土中进行观察生长情况。
2.3.2. 指示植物鉴定法
分别将经过脱除病毒试验处理的试管苗制成溶液，涂抹在长势良好、健康的曼陀罗、千日红、苋色藜幼嫩叶片7 d后观察生长情况。
2.3.3. 外部形态鉴定法
将经过脱毒处理的试管苗移栽至红壤土3周后观察统计其生长情况。
3. 结果与分析
3.1. 菊花脱毒效果
3.1.1. 微茎尖培养处理后茎尖长度与茎尖生长情况
经过微茎尖培养处理一段时间后观察微茎尖生长情况，剥取的茎尖长度不同生长情况也不同，具体表现为表1：
Table 1. The growth of stem tips of different lengths
表1. 不同长度茎尖的生长情况统计表
由表1可知，经微茎尖培养处理后发现：茎尖越小成活率越低，因为茎尖在剥离过程中失去过多的水分从而导致死亡；当茎尖长度为0.4~0.8 mm时茎尖易分化成愈伤组织，然后逐渐分化为丛芽；当茎尖长度超过0.8 mm时，由于剥离的茎尖所携带的叶原基多，从而导致茎尖直接分化生长为小苗。具体表现如下图1、图2。
Figure 1. Death after albinism of stem tip
图1. 茎尖白化后死亡
Figure 2. Stem tip differentiation into chrysanthemum seedlings
图2. 茎尖分化为菊花小苗
3.1.2. 药剂与茎尖培养脱毒处理效果
1) 病毒唑茎尖培养脱毒处理结果
经病毒唑结合茎尖培养茎尖后，茎尖的生长不良。将菊花顶芽、侧芽和根尖接入滴有不同质量浓度病毒唑的培养基中，5天后发现3 mg/L和10 mg/L的病毒唑先出现褐化后逐渐死亡，继续观察一星期发现 5 mg/L和15 mg/L的愈伤组织也同样表现为褐化死亡，综上分析原因为：病毒唑质量浓度太高，导致愈伤组织褐化、死亡。
2) 盐酸吗啉胍与茎尖培养处理结果
经过不同质量浓度的盐酸吗啉胍培养茎尖一段时间后观察茎尖的成活率，发现不同的处理组成活率不尽相同，具体为表2：
Table 2. The survival rate of the stem tip in the treatment of hydrochloric acid
表2. 盐酸吗啉胍处理茎尖的成活率统计表
由表2可知：经盐酸吗啉胍结合茎尖培养后，盐酸吗啉胍质量浓度的不断增加，菊花顶芽、侧芽和根尖的生长情况也随之提高；由此可知，盐酸吗啉胍质量浓度的增加对菊花茎尖的成活率没有影响，但对其生长势具有提高作用，使菊花小苗的叶片更浓绿，植株更健壮。
3.1.3. 热处理与茎尖脱毒处理结果
在第一组缓慢中温处理过程中，60℃处理的菊花无菌苗在处理到第三天时叶片出现发黄、失绿的现象，剥取茎尖接入培养基4天后白化、死亡；45℃和50℃处理接入培养基培养1周后死亡；对于第二组快速高温处理，在处理过程中植株变黄，叶片失绿，剥取茎尖培养5d后白化死亡。分析原因：缓慢中温处理时间过长导致植株无法适应死亡，快速高温处理则可能温度过高而导致植株直接死亡，剥取的茎尖也无任何生理活性。对于缓慢中温处理可适当缩短处理时间，而快速高温处理则可以适当降低温度或者缩短处理时间。
3.1.4. 昼夜变温处理脱毒后茎尖的生长结果
经过昼夜变温处理的茎尖培养一段时间的生长情况如图3~5：
Figure 3. Culture diagram of stem tip inoculation
图3. 茎尖接种培养图
Figure 4. Growth diagram of stem tip differentiation
图4. 茎尖分化生长图
Figure 5. Growth and differentiation diagram of stem tip stem and leaf
图5. 茎尖茎、叶生长分化图
由图3~5可见：经过昼夜变温处理的茎尖培养后，茎尖生长缓慢，茎尖在生长过程中未出现愈伤组织分化；接种后的茎尖直接生长出菊花的叶片和茎杆，随着培养时间的延长30 d，将带有茎、叶的茎段后再转接到生根培养基中培养，最终长成根、茎、叶等器官的菊花组培苗。
3.2. 菊花检测技术效果
3.2.1. 性状观察鉴定法结果
用四种脱毒技术对菊花组培脱毒苗进行鉴定，基于药剂处理结合茎尖培养脱毒苗生长势较好，直接将其移栽到室外通过外部性状观察对比初步鉴定脱毒效果，对于表现花叶症状的脱毒试管苗无需再进行其他检测，而对于未表现症状的脱毒试管苗则需要进一步采用ELISA对其检测。检测对照如下图6和图7。
由图6和图7对比可知，将未经过任何处理的试管苗与经100 mg/L盐酸吗啉胍处理后的脱毒试管苗通过同等条件下的移栽观察其生长势发现，未经过任何处理的试管苗2周后叶缘和部分茎尖出现枯斑和黑斑，可初步判定通过组培生产的组培苗本身可能携带一定的病毒，需通过一定的脱毒技术对其进行脱毒方可进行大量生产；经100 mg/L盐酸吗啉胍处理后的脱毒试管苗移栽2周后并未出现任何生长方面的问题，且生长速度较快，叶片持续翠绿，植株健壮，可初步判断经过高质量浓度的盐酸吗啉胍处理茎尖的试管苗生长势较好，可保持植株的稳定生长，若要确定其植株是否还携带病毒，需要进一步的进行ELISA精确鉴定。
Figure 6. Growth of tube seedlings without any treatment
图6. 未经任何处理的试管苗生长情况图
Figure 7. Growth of virus-free tube seedlings treated with 30 mg/L moroxydine hydrochloride
图7. 经30 mg/L盐酸吗啉胍处理后的脱毒试管苗生长情况图
3.2.2. 指示植物鉴定法结果
对经过微茎尖培养形成的愈伤组织和丛生芽采用苋色藜和曼陀罗指示植物鉴定，但是该方法具有一定的偶然性和误差，对于检测结果需要进一步的采用更为精确的ELISA方法。具体检测对照情况如下图8~11。
Figure 8. Amaranth color chenopodium treated with callus of microstem tip
图8. 微茎尖愈伤组织涂抹苋色藜处理图
Figure 9. Amaranth color chenopodium treated with shoot solution from microstem tips
图9. 微茎尖丛芽液涂抹苋色藜处理图
Figure 10. Application of mandala on callus of microstem tip
图10. 微茎尖愈伤组织涂抹曼陀罗图
Figure 11. Mandala diagram with bud solution from microstem tip cluster
图11. 用微茎尖丛芽液涂抹曼陀罗图
由图8~11可见：分别用菊花微茎尖培养分化的愈伤组织和菊花的丛生芽液涂抹指示植物苋色藜与曼陀罗2周后观察到：不论是在苋色藜植株和叶片，还是曼陀罗的植株和叶片上并未出现任何枯斑或黑斑状，也就是说，经过茎尖脱毒后的菊花试管苗不带病毒。因此可以判定：本次培养的菊花微茎尖分化的愈伤组织和丛生芽不含有感染苋色藜的马铃薯S病毒和感染曼陀罗的马铃薯X病毒，达到了菊花脱毒的目的。
4. 结论与讨论
4.1. 结论
4.1.1. 微茎尖脱毒处理是脱除菊花病毒简单有效的方法之一
经研究发现，病毒在植株体内分布不均匀，茎尖组织不含微管系统，几乎不含病毒或者病毒含量较少 [3] [4] [5]。微茎尖脱毒培养剥取0.6~0.8 mm的茎尖易分化成愈伤组织，从而分化为无毒幼苗，这样既能保证脱毒苗的脱毒率又能保证成活率。
4.1.2. 100 mg/盐酸吗啉胍培养基能效脱除菊花组培苗的病毒
近年来的研究表明，在培养基内加入抗病毒药剂，药剂会阻止病毒RNA帽子结构的合成，从而使病毒复制受阻 [6] [7]。把微茎尖形成的愈伤组织接入含有病毒唑或盐酸吗啉胍的培养基中，出现了不同的情况：在病毒唑培养基中，无论病毒唑质量浓度为多少，都出现了褐化的现象，而在盐酸吗啉胍培养基中，在100mg/盐酸吗啉胍培养基中成活率高达90%；对于脱毒效果，经过盐酸吗啉胍处理过的茎尖长势均匀，植株健壮。研究结果表明，适当浓度的盐酸吗啉胍能抑制病毒的复制、扩增，从而保证植株的正常生长，达到脱毒目的。但是在药剂处理过程中应充分考虑药剂质量浓度对茎尖的伤害。
4.1.3. 热处理有利于菊花组培苗脱毒
在热处理过程中，温度高、时间长、容易脱除病毒，然而，植物的成活率却得不到保证，因此，热处理时，温度的控制十分重要 [8]。将经过壮苗后的植株在60℃的水浴中连续处理3天后，植株开始萎蔫，颜色由绿色逐渐变为黄绿色，剥取茎尖接入培养基1周后茎尖白化，死亡。研究结果表明，热处理过程中温度超过植物的耐性高可直接导致植株死亡；热处理时间过长会使植株本身失去生理活性，剥取的茎尖成活率也会大幅度的降低。
4.1.4. 指示植物检测菊花脱毒方法简单，效果明显
脱毒苗的检测技术单一，而对于脱毒苗的健康评测则是一个重点内容 [9] [10]。指示植物鉴定法和性状观察鉴定法是生物学鉴定的一种方法，结果一目了然，但是很难排除由于外部条件的影响导致的机械损伤或者内部的生理性死亡，结果存在误差和偶然性。通过性状观察鉴定法和指示植物鉴定法只能初步判定脱毒苗是否处于健康状况，对于是否还携带某种病毒，可以采用多时段、多方法的结合进行综合检测，同时还可以尝试一些新的、更加灵敏的检测方法，最终确定是否为无毒苗。
4.2. 讨论
首先对于盐酸吗啉胍处理菊花茎尖能否脱去病毒目前还没有报道，需要进一步的实验来进行探究，其中着重考虑两个问题。一是盐酸吗啉胍在120℃的高压灭菌锅内生物活性是否减半甚至丧失，二是盐酸吗啉胍如果能脱去植物体的病毒，其作用机理如何？
其次对于菊花耐热性问题需要深入研究，找到不同品种菊花的耐热性，从而根据其耐热性设置不同的处理温度，同时也应该考虑要脱去病毒的生理活性，兼顾菊花耐热性和病毒生理活性找寻合适的脱去病毒方法。目前报道的菊花脱除病毒方法单一 [11]，应该继续深入研究脱除植物体内病毒的有效方法，从而找寻最适合菊花脱毒的有效方法。
最后对于指示植物鉴定法和性状观察鉴定法能够对病毒进行初步判定，但是每一种植物病毒都有一定的寄主范围，因此需要耗费长时间选取不同的指示植物进行检测 [12]。对于病毒检测技术目前应用最多的就是酶联免疫吸附检测技术 [13]，但是该方法只能检测一种病毒，对于存在菊花体内的多种病毒需要进行多次检测。分子生物学反转录PCR在植物病毒检测中应用广泛。无论是血清学检测技术还是分子生物学鉴定都具备灵敏度高，特异性强，检测速度快，操作也比较简单，可以应用大批量样品的检测。但同时也存在一定的缺陷，如抗体制备的时间长，耗费时间，若采取购买的方式则太昂贵。电镜观察法是在电子显微镜下直观的观察病毒粒子的大小，病毒外壳蛋白的性状以及病毒浸染寄主后引起的细胞超微结构的变化，从而鉴定出病毒种类的一种方法 [14]。无论采取哪种检测病毒的方式，都应该综合考虑病毒的生理生化特性。
基金项目
云南省省级重点学科建设“生物学”建设(编号IRTSTYN)、云南省高校特色植物资源研究与开发科技创新团队、云南省高校滇中民族植物学重点实验室培育基地项目和王振吉“彝乡英才”项目的资助。
NOTES
*第一作者。