摘要: 目的：运用网络药理学探讨附子理中汤治疗溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis, UC)的潜在作用机制。方法：利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)获得附子理中汤的化学成分和作用靶点蛋白，通过DisGeNET、OMIM数据库检索获取UC疾病的相关靶点，利用venny2.1.0在线作图工具对药物和疾病的靶点进行映射，使用STRING数据库构建蛋白互作(PPI)网络，利用Metascape在线作图软件对交集靶点进行GO生物过程分析和KEGG通路富集分析，并使用R软件及Cytoscape软件对结果进行绘图可视化。结果：筛选得到附子理中汤中药活性化学成分104个，与UC相关的活性化学成分98个，与UC共同作用靶点107个；PPI网络涉及89节点，452条边，得到STAT3、JUN、TNF等十个核心靶点；GO功能富集分析得到2157条GO目条，其中生物过程(BP) 1978条，分子功能(MF) 124条，细胞组分(CC) 55条，包括对炎症的反应、对脂多糖的反应、对细菌原分子的反应和活性氧代谢等；KEGG富集筛选得到164条信号通路，主要有AGE-RACE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、白细胞介素信号17通路(IL-17 signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)等信号通路，主要与代谢、免疫炎症以及氧化应激相关。结论：附子理中汤治疗UC主要是通过槲皮素、山萘酚、柚皮素、刺芒柄花素、甘草查尔酮a等活性成分作用于STAT3、JUN、TNF等关键靶点基因从而调节多条生物学功能与信号通路，最终达到治疗溃疡性结肠炎的作用。
Abstract:
Objective: To explore the mechanism of Fuzilizhong decoction (FLD) in the treatment for ulcera-tive colitis (UC) by Network pharmacology. Methods: The known components and associated targets of FLD were obtained from TCMSP database. The disease targets for UC were obtained from the DisGeNET, OMIM databases. Effective targets were obtained after mapping the above two parts of targets by using venny 2.1.0 online mapping tool. The protein-protein interaction (PPI) network was constructed from STRING database. Gene ontology (GO), Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) analysis were conducted through Metascape, the results were visualized by Cytoscape and R softwares. Results: Through screening, 104 main active components of FLD were obtained, only 98 active components related to the UC disease, and 107 targets were related to the UC disease. A total of 89 nodes and 452 edges were involved in the PPI network. 10 key targets were obtained, such as STAT3, JUN, TNF and so on. Metascape was used for GO enrichment analysis and the results showed that there were 1978 biological processes, 124 molecular functions and 55 cell components, including inflammatory response, response to lipopolysaccharide, response to molecule of bacterial origin and reactive oxygen species metabolic process and so on. Enrichment analysis of KEGG showed that there were 164 signal pathways such as AGE-RAGE, IL-17, TNF, HIF-1 signal pathways, which were mainly related to metabolism, immune inflammation and oxidative stress. Conclusion: Fuzilizhong Decoction in the treatment of ulcerative colitis mainly through quercetin, kaempferol, naringenin, formononetin, licochalconea acts on STAT3, JUN, TNF, so as to regulate multiple biological functions and signal pathways, and finally achieve the therapeutic effect.
1. 引言
溃疡性结肠炎是一种与遗传、免疫、感染、环境等因素密切相关的常见慢性肠道炎症性疾病，病变多位于乙状结肠和直肠，主要有腹泻腹痛、粘液便秘、脓血、里急后重等临床表现 [1]。该疾病病情复杂迁延、难以痊愈、反复发作，多发病于青壮年群体，且发生癌变的可能性较大，早已经被世界卫生组织定为现代难治疾病之一。临床上西医常规治疗UC短期效果明显，但无法完全治愈。溃疡性结肠炎在中医学中属“痢疾”“便血”“肠风”“泄泻”“肠癖”“滞下”等范畴，病因涉及外感六淫、劳倦过度、饮食不节、情志内伤等，其主要病机为湿热阻滞、热毒蕴结兼脾肾阳，系由脾胃虚弱，运化失司，水湿内停，蕴结于肠道，湿热内盛，热壅血瘀，血络受损而成痢疾并贯穿于始终，是复发之根本，故健脾益气是UC的首要治法，由此可知，脾虚是UC的关键病理因素 [2] [3]。由此，可以采用《三因极——病证方论》卷二中的附子理中汤一方，附子温补先天真阳，白术健脾燥湿、干姜温胃散寒，人参补气益阴，炙甘草调和诸药。临床用于治疗UC疗效佳，然其具体作用机制尚不完全清楚。基于此，本研究借助网络药理学方法系统性分析附子理中汤治疗UC的作用机制，旨在为进一步研究提供参考方向。
1.1. 附子理中汤药物化学成分及相关靶点搜寻
附子理中汤含有附子、人参、白术、甘草、干姜五味中药，运用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)检索附子理中汤的药物活性化学成分，以口服生物利用度(OB) ≥ 30%、类药性(DL) ≥ 0.18为标准对所有活性成分进行筛选，剔除缺少靶点预测数据的化合物，并搜集有效化学成分相关靶点。将搜寻到的附子理中汤靶点导入UniPort，物种选定为human，对检索得到的所有蛋白靶点校正为UniProt ID。
1.2. “溃疡性结肠炎”疾病靶点搜集
以“Ulcerative Colitis”作为搜索关键词，利用DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM，https://www.omim.org/)，对该疾病已知靶点基因进行检索与筛选，合并各数据库的疾病靶点，删除检索结果中重复的靶点，导入UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)进行标准化处理。
1.3. 韦恩图的绘制、药物疾病交集靶点及药物–成分–疾病–靶点网络的构建
将校正后的“溃疡性结肠炎”疾病靶点与“附子理中汤”有效成分靶点导入venny2.1.0在线作图工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)获得药物–疾病交集靶点及其韦恩图，药物名称、交集靶点、有效成分导入Cytoscape3.6.0软件进行映射，构建药物–成分–靶点–疾病网络图。
1.4. 蛋白互作网络构建及核心靶点的筛选
将药物–疾病交集靶点导入STRING11.0数据库(https://string-db.org/)选择multiple proteins模式，将研究物种设置为人类，最低相互作用阈值设为高等信度0.9 (highest confidence)并选择隐藏游离节点，从而构建附子理中汤治疗溃疡性结肠炎PPI网络图。下载TSV数据文件，并将其导入Cytoscape3.6.0软件使用cytoHubba模块Degree算法分析筛选综合评分排名前10位的靶点作为附子理中汤治疗溃疡性结肠炎的核心靶点，并生成核心靶点蛋白互作网络。网络中节点(node)的颜色默认按Degree从高到低，由红色向黄渐变。
1.5. 基因本体(gene ontology, GO)功能富集与京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析
利用Metascape在线数据库，将交集靶点上传至Metascape，参数设置为 Homo species，采用“Custom Analysis”模式，分别对GO功能富集分析中生物过程、分子功能、细胞组成以及KEGG信号通路进行生物富集，并运用R语言对信号通路富集分析结果进行可视化处理。
2. 结果
2.1. 附子理中汤药物化学成分及相关靶点搜寻
以口服生物利用度OB ≥ 30%且类药性DL ≥ 0.18为筛选条件，通过TCMSP查找附子理中汤中药(人参、附子、干姜、白术、甘草)药物活性化学成分，获得活性成分108个(含重复)，分别为附子6个，人参5个，白术4个，甘草88个(见表1)。其中干姜和人参共同活性成分1个：beta-sitosterol，对应靶点37个；甘草和人参共同活性成分1个：kaempferol，对应靶点60个，附子、干姜、甘草共同活性化学成分1个：sitosterol，对应靶点3个。删除重复数据后得到104个活性成分，对应391个作用靶点，其中存在164个重复靶点。
Table 1. Active ingredients of Fuzilizhong Decoction
表1. 附子理中汤活性成分
2.2. “溃疡性结肠炎”疾病靶点搜集
以“Ulcerative Colitis”为关键词在在线人类孟德尔遗传数据库OMIM、DisGeNET数据库中进行检索，得到UC相关基因靶标，两个数据库合并、去重得后导入UniProt数据库对靶标进行标准化处理，得到1402靶标基因，OMIM数据库181个，DisGeNET数据库1331个。
2.3. 韦恩图的绘制、药物疾病交集靶点及药物–成分–疾病–靶点网络的构建
将附子理中汤药物成分相关靶点、溃疡性结肠炎疾病相关靶点导入venny2.1.0在线作图工具，共获得STAT3、IL10、SELE、CXCL10、IL6、IL4等107个交集靶点及韦恩图(见图1)；将药物–疾病交集靶点与药物有效成分相互作用关系及属性文件导入Cytoscape3.6.0软件并进行映射，构建药物–成分–靶点–疾病网络图(见图2)。
Figure 1. Venn’s diagrams of Fuzilizhong Decoction-UC targets
图1. 附子理中汤–溃疡性结肠炎靶点韦恩图
(注：该图211个节点，包括98个活性成分，107个靶点，5味中药和1个疾病，1174条边，其中圆节点代表靶点，三角形节点代表化合物，菱形节点代表中药，正六边形节点代表疾病。)
Figure 2. Drug-component-target-disease interaction network
图2. 药物–成分–靶点–疾病网络
2.4. 蛋白互作网络构建及核心靶点的筛选
将药物–疾病107个交集靶点导入STRING11.0数据库，选择multiple proteins模式，将研究物种设置为人类，最低相互作用阈值设为最高信度0.9 (high confidence)并选择隐藏游离节点，下载TSV数据文件，并将其导入Cytoscape3.6.0软件生成蛋白互作网络PPI，共得到89节点，452条边，蛋白互作网络图节点(node)大小、颜色与Degree成正相关(见图3)。用cytoHubba插件的Degree算法分析筛选综合评分排名前10位的靶点作为附子理中汤治疗溃疡性结肠炎的核心靶点，根据STAT3、JUN、TNF等核心靶点生成核心靶点蛋白互作网络，网络中节点(node)的颜色默认按Degree从高到低，由红色向黄渐变(见图4)。
Figure 3. Protein-protein interaction network
图3. 蛋白互作网络图(PPI)
Figure 4. Interaction network diagram of core genes
图4. 核心靶点蛋白互作网络图
2.5. 基因本体(Gene Ontology, GO)功能富集与京都基因与基因组百科全书 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析
利用Metascape在线数据库(https://metascape.org/)，将附子理中汤治疗溃疡性结肠炎的交集靶点上传至Metascape，参数设置为Homo species，采用“Custom Analysis”模式进行GO功能分析，共获得生物过程(biological process, BP) 1978个，分子功能(molecular function, MF) 124个，细胞组成(cellular component, CC) 55个，根据−log10 (pvalue)大小，运用R语言分别对前20条通路进行可视化分析(见图5、图6、图7)。根据图5、图6、图7可知附子理中汤治疗溃疡型结肠炎可能参与了炎症反应、对脂多糖的反应、对细菌原分子的反应、活性氧代谢过程、细胞迁移的正调节等生物过程；也参与了细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体调节器活动、受体配体活性、信号受体活化器活性、蛋白质同化、DNA结合转录因子绑定、转录因子绑定、RNA特异性聚合酶IIDNA结合转录因子结合、蛋白质激酶结合等分子功能；还参与了膜筏、微膜区、囊泡腔、分泌颗粒腔、细胞质囊泡腔、髓鞘等细胞部位的形成。
Figure 5. GO analysis of biological process (top 20)
图5. GO生物过程分析(top 20)
Figure 6. GO analysis of molecular function (top 20)
图6. GO分子功能分析(top 20)
Figure 7. GO analysis of cellular component (top 20)
图7. GO细胞组分分析(top 20)
通过Metascape进行KEGG信号通路富集分析获得164条信号通路，根据−log10 (pvalue)排序，运用R语言对前20条KEGG通路进行可视化分析(见图8)。靠前的通路有AGE-RACE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、致癌通路(Pathways in cancer)、流体剪应力与动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、白细胞介素信号17通路(IL-17 signaling pathway)、乙型肝炎通路(Hepatitis B)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、丙型肝炎通路(Hepatitis C)、查加斯病(美国锥虫病) (Chagas disease (American trypanosomiasis))、麻疹(Measles)、癌蛋白(Proteoglycans in cancer)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、Th17细胞分化(Th17 cell differentiation)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (PI3K-Akt)等。表2列出了排名前十的富集通路相关信息
Figure 8. Enrichment analysis of KEGG signaling pathway (top 20)
图8. KEGG信号通路富集分析(top 20)
Table 2. Information of KEGG signaling pathway (top 10)
表2. KEGG信号通路信息(top 10)
3. 讨论
本研究通过中药网络药理学技术分析，共筛选出槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、刺芒柄花素(formononetin)、甘草查尔酮a (licochalcone a)、异鼠李素(isorhamnetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、7-甲氧基-2-甲基异黄酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)等98个与治疗UC密切相关的活性化学成分，PTGS2、ESR1、CALM1、HSP90AA1、NOS2、PPARG、ESR2、PTGS1、CHEK1、MAPK14等107个潜在靶点，通过cytoscape3.6.0版本软件，得到了附子理中汤–药物靶标–疾病–潜在靶点网络图，利用STRING在线平台，最低相互作用阈值设为最高信度0.9 (high confidence)并选择隐藏游离节点，将TSV结果导入cytoscape3.6.0版本软件获得89节点，通过该软件中cytoHubba插件中的Degree算法，筛选出STAT3、JUN、TNF、RELA、AKT1、MAPK1、MAPK3、IL6、TP53、HSP90AA1等10个核心靶点，该结果表明附子理中汤治疗UC具有多成分、多靶点综合作用的特点。筛选出的10个核心靶点在PPI网络中扮演着重要的角色，预测它们可能是附子理中汤治疗UC的主要靶标。
筛选出的十个核心靶点主要与炎症、免疫与增殖有关，信号转导与转录激活因子3 (STAT3)是STAT蛋白家族的一员，在炎症和免疫控制方面具有关键作用，被认为是免疫和炎症的关键蛋白，在Jak/STAT3通路中发挥着重要作用 [4]。IL-6炎症因子激活JAK2，使其转变为p-JAK2，刺激STAT3磷酸化，磷酸化后的Stat蛋白发生构象变化，易位至细胞核，结合靶基因抑制细胞因子信号抑制物(SOCS)的表达，导致STAT3磷酸化持续进行，进一步产生IL-6因子，进而加重炎症 [5] [6]。转录因子AP-1 (JUN)与结肠直肠癌(CRC)细胞中的特定肽酶(USP28)促进剂结合，参与激活KRAS介导的结肠直肠癌(CRC)细胞特定肽酶(USP28)的转录激活，KRAS通过以ZNF304依赖的方式诱导结肠直肠癌(CRC)细胞中的肿瘤抑制基因(TSG)的转录沉默，在促进肿瘤事件方面发挥作用 [7]。肿瘤坏死因子(TNF)指一组可以引起细胞死亡(凋亡)的细胞因子，也是一种主要炎症细胞因子。TNF-α是TNF/TNFR细胞因子超级家庭的成员，是UC发病的主要炎性启动因子，它能与炎症细胞相互作用，导致肠组织内各种炎症细胞浸润，加重肠黏膜的炎症反应，还能刺激单核巨噬细胞、中性粒细胞合成IL-1β，IL-6，IL-8等细胞因子进一步加重炎症反应 [8]。NF-κB p65蛋白(RELA)是存在于几乎所有细胞类型的全息转录因子，参与炎症、免疫、分化、细胞生长、肿瘤形成和凋亡等生物过程，UC发生后，通过活化NF-κB使体内迅速产生IL-1β，引起炎症介质释放，同时刺激TNF-α、IL-6、IL-8等其他细胞因子的分泌，进一步诱导产生更多的细胞因子，形成级联性释放，从而加重炎症反应，造成组织损伤 [8]。AKT1 (AKT serine/threonine kinase 1)是3种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1，AKT2，AKT3)之一 [9]，通过参与AGE-RAGE，PI3K-Akt和MAPK等多个与炎症、免疫、代谢和细胞增殖相关的信号通路对相关生物学过程进行调节。热休克蛋白90A家族(HSP90AA1)是一类能促进特定靶蛋白成熟、结构维持和适当调节的分子伴随蛋白，参与细胞周期控制和信号转导；细菌脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌外壁的主要结构成分，是引起炎症反应的有效因子，可作为细菌感染的指标之一。脂多糖(LPS)激活单核巨噬细胞和活化的Ｔ淋巴细胞产生和释放TNF引起炎症反应，HSP90AA1与细菌脂多糖(LPS)结合，调解LPS引起的TNF释放导致的炎症反应 [10]。IL-6主要由巨噬细胞和中性粒细胞分泌，是一种炎症标志物，通过激活STAT3信号通路，诱导黏膜机械屏障通透性增加，促进慢性炎症的持续发生 [11]。MAPK家族是能被不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活的丝氨酸–苏氨酸蛋白激酶，通过三级激酶模式共同调节着细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理病理过程。丝裂原活化蛋白激酶1 (MAPK1)和丝裂原活化蛋白激酶3 (MAPK3)是MAPK家族中的重要组成部分，广泛存在于哺乳动物各种组织，是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，MAPK1/ERK2和MAPK3/ERK1是2个在MAPK/ERK级联中发挥重要作用的MAPK，MAPK/ERK级联通过对转录、翻译、细胞骨质重新排列的调节，调节细胞生长、粘附、生存和分化等多种生物功能 [12] [13]。
附子理中汤治疗UC靶点富集的信号通路主要涉及AGE-RAGE、IL-17、TNF、PI3K-Akt、Th17细胞分化、HIF-1以及部分癌症疾病等通路(详见图8)，呈现出中药多成分协同、多靶点联合、多通路协调的整体性作用的机制。白细胞介素信号17通路(IL-17信号通路)、AGE-RACE、PI3K-Akt信号通路、HIF-1、Th17细胞分化主要与代谢、免疫炎症以及氧化应激有关，肿瘤坏死因子信号通路(TNF信号通路)主要涉及炎症与免疫调节。
根据附子理中汤–药物靶标–疾病–潜在靶点网络图，运用“network analysis”进行拓扑分析，按照Degree值，对中药化合物成分进行排序，槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、刺芒柄花素(formononetin)、甘草查尔酮a (licochalcone a)、异鼠李素(isorhamnetin)等中药化合物排名前列，预测它们可能是附子理中汤治疗UC的关键药物有效活性成分。UC发病与自身免疫炎症反应及炎症细胞因子相关，根据相关文献 [9]，槲皮素具有抗氧化及清除自由基的作用、抗炎、抗病毒、降糖、降脂、免疫调节的作用。槲皮素在治疗UC过程中，一方面，槲皮素可降低细胞内活性氧自由基，对氧化损伤的细胞具有保护作用，另一方面可以通过抑制免疫细胞分泌促炎细胞因子(TNF-a、IL-2)，促进分泌抗炎细胞因子(IL4、IL-10和转化生长因子-β1)，还可以通过抑制与转录因子(NF-κB)、重组人信号转导与转录激活因子(STAT)相关的基因表达来抑制炎症细胞因子的分泌，从而发挥抗炎作用 [14] [15] [16] [17] [18]。山柰酚具有很好的抗炎作用，通过抑制肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素(IL)-6水平及核因子-κB (NF-κB)、STAT信号通路的活化来抑制炎症细胞因子的分泌，进而达到抗炎的功效 [19] [20] [21]。研究表明 [22]，柚皮素具有抗凋亡、抗氧化、抗线粒体、抗纤维化和抗炎的作用。刺芒柄花素通过抑制NF-κB信号通路的激活来抑制炎症细胞因子的分泌，进而发挥抗炎效果 [23]。甘草查尔酮a具有抗炎、抗氧化的作用，主要通过抑制NF-κB通路，导致TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的表达减少来发挥抗炎作用 [24]。异鼠李素通过调节PI3K/Akt、NF-κB、MAPK等信号通路，在抗炎、抗氧化、调节细胞凋亡等方面发挥着重要作用，在治疗UC过程中，异鼠李素可以通过调节MAPK、NF-κB信号通路抑制TNF-α导致的炎症，进而达到治疗效果 [25] [26] [27]。
4. 结论
综上所述，附子理中汤治疗溃疡性结肠炎主要是通过槲皮素、山萘酚、柚皮素、刺芒柄花素、甘草查尔酮a、异鼠李素等活性成分作用于STAT3、JUN、TNF、RELA、AKT1、MAPK1、MAPK3、IL6、TP53、HSP90AA1等关键靶点基因从而调节多条生物学功能与信号通路，最终达到治疗UC的作用。但是，此次研究尚存在不足之处，需要后期进一步实验验证。
基金项目
四川省中医药管理局2021年度中医药科研专项课题(2021MS108)；成都中医药大学杏林学者学科人才科研提升计划(ZRQN2020001)；四川省青年科技创新团队项目(19CXTD0055)。
NOTES
*共同一作。
#通讯作者。