1. 引言
肺癌是全球发病率和死亡率较高的癌症之一，非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)约占所有肺癌病例的80% [1]，并且在诊断时大部分NSCLC病例已经处于晚期。尽管，PD-L1抑制剂在NSCLC治疗方面取得了重要突破，但仍有一半以上的PD-L1阳性表达的患者出现免疫无应答 [2]。NSCLC发生及进展的分子机制尚不完全明确，限制了NSCLC治疗效果的进一步提高。因此，深入探究NSCLC的致病机制具有重要的临床价值和理论意义。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)是RNA水平的一种甲基化修饰作用，是哺乳动物mRNA中最丰富的转录组修饰，占所有RNA碱基甲基化的80%以上。YTH结构域连接蛋白2 (YTH binding protein 2, YTHDF2)可以通过介导恶性肿瘤组织中m6A甲基化识别和mRNA翻译，来调控恶性肿瘤细胞进展、浸润及转移 [3]，如肝癌 [4]、非小细胞肺癌 [5]、膀胱癌 [6] 等。
十十一易位酶2 (ten-eleven translocation 2, TET2)是一种表观遗传双加氧酶，负责将基因组5-甲基胞嘧啶(5mC)酶促氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，具有DNA去甲基化修饰的作用 [7] [8]。TET2是癌症患者复发和生存期预后的重要生物标志物。研究表明，在手术和化疗后较早复发的前列腺癌中TET2 mRNA表达的降低与患者生存率降低密切相关。生殖系TET2变体与前列腺癌和子宫内膜以及黑色素瘤的风险增加相关 [9]。骨髓增生异常综合症(MDS)和急性髓细胞性白血病中发现了各种功能丧失的TET2突变，以及包括乳腺肿瘤在内的实体瘤中发现，TET2能够抑制乳腺癌的侵袭性和转移 [10]。
在肥胖人群中的表观组测序数据显示，KARS，TERF2IP和DEXI等多个基因的甲基化水平的显著变化与RNA m6A去甲基化酶FTO的突变相关 [11]。而近年来文献报道，RNA去甲基化酶SlALKBH2发生功能突变后促进DNA去甲基化酶SlDML2 mRNA的降解，进而促进基因组DNA高甲基化 [12]。这些结果提示，RNA m6A甲基化很可能具有影响DNA甲基化水平的作用。YTHDF2与TET2分别作为RNA m6A甲基化与DNA甲基化过程中重要的蛋白，两者之间的关系可以进一步揭示出在肺癌中RNA m6A甲基化影响DNA甲基化水平的具体机制。
2. 资料与方法
2.1. 生信分析
通过m6A-Atlas在线数据库(http://180.208.58.66/m6A-Atlas/)获取TET2的m6A位点分布情况。通过Kaplan-Meier Plotter在线数据库(http://kmplot.com/analysis/)获取TET2与YTHDF2对OS的影响。通过GEPIA在线数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html/)获取TET2与YTHDF2的表达相关性。
2.2. 临床资料
选取青岛大学附属医院病理科自2015年1月~2015年10月存档石蜡包埋的非小细胞肺癌标本52例和正常肺组织(距肿瘤边缘 > 5 cm) 52例。在非小细胞肺癌标本组织52例中，男35例，女17例；年龄 ≥ 60岁33例，<60岁19例；TNM分期为I~II期32例，III期20例；组织分化程度为中低分化35 例，高分化17例；组织学分型为鳞状细胞癌(鳞癌) 22例，腺癌30例；发生淋巴结转移23例；肿瘤直径 < 3 cm 24例，≥3 cm 28例。纳入标准：均符合2008版非小细胞肺癌指南诊断标准，均经术后病理检查确诊；均首次诊断为非小细胞肺癌，既往未接受过抗肿瘤治疗；临床病理资料完整并接受随访，且患者及家属签署知情同意书。排除标准：患有其他呼吸系统疾病，如肺炎、支气管炎等；患有其他系统疾病或恶性肿瘤，如胃癌、乳腺癌、结肠癌等；伴免疫系统功能缺陷疾病等。随访截止日期为2020年10月，生存期是指从手术日期到随访截止日期，或因复发转移、其他疾病而死亡的日期为止。
2.3. 免疫组化方法
取得标本组织后均制成4 μm厚切片，操作步骤严格按试剂盒说明书进行，加入兔抗人YTHDF2 (武汉爱博泰生物科技有限公司)和兔抗人TET2抗体(武汉爱博泰生物科技有限公司)，稀释比例均为1:100。用已知阳性片作对照，以PBS液代替一抗作空白对照。结果判定采用双盲法，两位资深病理科医师观察每张切片 [13]，以染色强度和阳性细胞比例综合评定，首先将染色强度计分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；再将阳性细胞百分比计分，<5%为0分，5%~25%为1分，25%~50%为2分，50%~75%为3分，>75%为4分。用染色强度得分和细胞数乘积作为判断标准，<2为阴性，≥2为阳性。
2.4. 统计学处理
采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析。率的比较采用χ2检验；相关性采用Spearman等级相关性分析，生存分析采用Kaplan-Meier和Log-rank方法分别绘制和比较生存曲线以及多因素Cox风险比例模型。P < 0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. TET2的mRNA上m6A位点情况
m6A-Atlas在线数据库显示TET2mRNA上分布着大量m6A位点。见图1。因此，YTHDF2可能具有识别TET2mRNA上的m6A来调控TET2表达的作用。
Figure 1. RNA modification sites of TET2
图1. TET2的RNA修饰位点情况
3.2. 非小细胞肺癌和正常宫颈组织中YTHDF2与TET2表达
YTHDF2在非小细胞肺癌和正常肺组织表达率分别为28.8%和80.8%，两组差异有统计学意义(χ2 = 16.25，P < 0.001)；TET2在非小细胞肺癌和正常肺组织表达率分别为25.0%和100.0%，两组差异有统计学意义(χ2 = 50.514，P < 0.001)。见表1。
Table 1. Expression of YTHDF2 and TET2 in NSCLC and normal lung tissue
表1. 非小细胞肺癌和正常肺组织中YTHDF2和TET2表达的比较
3.3. 非小细胞肺癌组织中YTHDF2与TET2表达的相关性
通过GEPIA在线数据库获取YTHDF2与TET2的表达相关性提示，YTHDF2与TET2在LUAD与LUSC中的表达分别呈正相关性(P < 0.01)。见图2。对临床样本进行Spearman相关分析结果显示，YTHDF2 与TET2表达在非小细胞肺癌组织中呈正相关(r = 0.515，P < 0.01)。见表2。
Table 2. Correlation between YTHDF2 and TET2 expression and clinicopathologic features in non-small cell lung cancer
表2. 非小细胞肺癌组织中YTHDF2和TET2表达和临床病理特征的相关性
(a) (b)
Figure 2. Analysis of the correlation between YTHDF2 and TET2 expression in NSCLC tissue from GEPIA online database. (a) Correlation between YTHDF2 and TET2 expression in LUAD. (b) Correlation between YTHDF2 and TET2 expression in LUSC
图2. GEPIA在线数据库分析非小细胞肺癌组织中YTHDF2和TET2表达的相关性。(a) LUAD中YTHDF2和TET2表达的相关性。(b) LUSC中YTHDF2和TET2表达的相关性
3.4. YTHDF2、TET2表达与非小细胞肺癌临床病理特征间的关系
非小细胞肺癌组织中YTHDF2与肿瘤组织分化程度有关(P = 0.02)，与患者性别、年龄及肿瘤直径、病理类型、TNM分期、淋巴结转移无关(P > 0.05)。非小细胞肺癌组织中TET2与肿瘤大小、病理类型、组织分化程度有关(P < 0.01)，与患者性别、年龄及TNM分期、淋巴结转移无关(P > 0.05)。见表3。
Table 3. Correlation between YTHDF2 and TET2 expression in non-small cell lung cancer tissue
表3. 非小细胞肺癌组织中YTHDF2和TET2表达的相关性
3.5. YTHDF2与TET2表达与生存期关系
通过Kaplan-Meier Plotter在线数据库 [14] 获取TET2与YTHDF2对OS的影响显示，YTHDF2与TET2高表达组患者的生存时间均显著长于低表达组患者(P < 0.001)。见图3(a)，图3(b)。同时，对52例患者进行随访。YTHDF2阳性表达组患者的生存时间显著长于阴性表达组(χ2 = 4.303，P < 0.001)；TET2阳性表达组患者的生存时间明显长于阴性表达组(P < 0.001)。见图3(c)，图3(d)。
Figure 3. Survival curve of YTHDF2 and TET2 expression in NSCLC. (a) Survival curves of YTHDF2 high and low expression groups (KM Plotter online database). (b) Survival curves of groups with high and low TET2 expression (KM Plotter online database). (c) Survival curves of YTHDF2 positive and negative expression groups (clinical cohort). (d) Survival curves of TET2 positive and negative expression groups (clinical cohort)
图3. YTHDF2和TET2在NSCLC中表达的生存曲线。(a) YTHDF2高表达组和低表达组的生存曲线(KM Plotter在线数据库)。(b) TET2高表达组和低表达组的生存曲线(KM Plotter在线数据库)。(c) YTHDF2阳性表达组和阴性表达组的生存曲线(临床队列)。(d) TET2阳性表达组和阴性表达组的生存曲线(临床队列)
3.6. Cox模型分析影响非小细胞肺癌患者预后的因素
Cox模型分析结果显示独立的预后因素分别为TNM分期，组织分化程度，YTHDF2阳性表达为影响患者预后的独立因素(P < 0.05)。见表4。
Table 4. Results of multi-factor Cox hazard Analysis
表4. 多因素Cox比例危险模型分析结果
4. 讨论
m6A mRNA甲基化由METTL3启动，然后被包含YTH结构域(YTHDFs)的蛋白质识别。YTHDFs为五个包含YTH结构域的蛋白质，YTHDFs能特异性结合m6A修饰的mRNA，具有调节mRNA的剪接、输出、稳定性和翻译的作用 [3]。我们研究发现，YTHDF2在非小细胞肺癌组织的表达显著低于正常肺组织(P < 0.01)，且YTHDF2的高表达与较好的预后相关。这与Zhang等人发现在肺腺癌中METTL3、YTHDF1和YTHDF2上调的患者具有较好的OS和RFS的结论相一致 [15]。尽管目前的研究多指向YTHDF2的致癌机制，如METTL3/YTHDF2/m6A信号轴通过降解肿瘤抑制因子SETD7和KLF4的mRNA，促进了膀胱癌的进程 [6]。YTHDF2处理降解包含m6A的白介素11和丝氨酸蛋白酶抑制剂E家族成员的mRNA，促进肝癌进展等 [4]。但也有报道指出YTHDF2在调节癌细胞增殖和迁移中具有双向作用 [16]。而YTHDF2在肺癌细胞代谢中的作用仍有待探索。同时，我们还发现YTHDF2表达与肿瘤的分化程度相关。多因素Cox分析结果显示YTHDF2可作为非小细胞肺癌预后的独立危险因素。
TET2是一种重要的表观遗传调控者，具有DNA去甲基化修饰的作用 [8]。目前的报道证明TET2在多种癌症中具有抑癌作用 [7] [9] [10]。我们的研究也发现TET2在非小细胞肺癌组织的表达显著低于正常肺组织(P < 0.05)，且TET2的高表达与较好的预后相关。同时，我们还发现TET2表达与肿瘤的分化程度，病理类型和肿瘤大小相关。
利用m6A-Atlas在线数据库查询TET2mRNA的序列，我们发现mRNA上存在着大量m6A位点。因此YTHDF2可能可以通过m6A调控TET2的表达。通过两者的相关性分析，我们发现两者的表达呈正相关。文献报道，YTHDF2可以通过募集mRNA降解系统来降低mRNA的稳定性 [17]。YTHDF2与mRNA 3'-UTR的m6A修饰位点结合后 [18]，通过与CNOT1的超家族同源性(SH)结构域直接相互作用来募集CCR4-NOT腺苷酸酶复合物，从而引发腺苷酸化和降解包含m6A的mRNA [19]。然而，Zhou等人的研究表明，YTHDF2在肝癌中抑制了FTO介导的m6A在5'-UTR的去甲基化，提示YTHDF2在m6A保护中的积极作用 [20]。Zhang等人研究表明YTHDF2可以通过不同的机制影响m6A甲基化。YTHDF2在肝癌中的过表达可以增加OCT4 mRNA 5'-UTR的m6A甲基化，导致oct 4蛋白水平的增加。荧光素酶分析和多聚体分析所证明YTHDF2通过影响m6A甲基化的5'-UTR的基因促进蛋白质翻译 [21]。因此，YTHDF2很可能作用于TET2mRNA的5'-UTR m6A来促进翻译。但具体作用机制仍需进一步探索。
综上所述，YTHDF2与TET2能够抑制非小细胞肺癌浸润、转移，两者之间的调控关系揭示出在肺癌中可能存在RNA m6A甲基化与DNA甲基化相互作用的潜在机制。这种潜在的甲基化调控方式可以为非小细胞肺癌临床治疗提供新的思路和靶点。本研究纳入的样本较少，但通过结合部分的生信分析提高了结论的可信度。后期仍需进行大样本的研究对以上问题进行探讨。此外，YTHDF2与TET2的具体作用机制仍缺乏更深入的研究。后续因从YTHDF2能否作用与TET2mRNA的5'-UTR m6A入手更近一步的探究在肺癌中RNA m6A甲基化与DNA甲基化相互作用的潜在机制。