DKK1与尿蛋白在子痫前期中的研究进展

Progress in Research of DKK1 and Urinary Protein in Preeclampsia

摘要: 子痫前期(Preeclampsia, PE)作为妊娠期特有并发症，大量潜在的生物标记物已被发现，协助于诊断并治疗PE病情。WNT信号通路是调控生物体内细胞生长、发育及分化的关键信号传导通路之一，在PE发病中起到关键作用。DKK1作为WNT信号通路的拮抗剂，其蛋白表达水平与子痫前期的发病率密切相关，并且现已证实DKK1参与肾脏的病变，成为子痫前期蛋白尿症状的影响因素之一。通过探究DKK1在母体血清中的表达情况，联合尿蛋白水平，探讨二者在PE发病中起到的作用。

Abstract: As a unique complication of pregnancy, a number of potential biomarkers have been identified to assist in the diagnosis and treatment of PE. The WNT signalling pathway is one of the key signalling pathways that regulate cell growth, development and differentiation in organisms and plays a key role in the development of PE. DKK1, an antagonist of the WNT signalling pathway, is closely associ-ated with the incidence of PE. It has also been shown that DKK1 is involved in renal pathology and is one of the factors influencing the symptoms of proteinuria in PE. In this study, we investigated the role of DKK1 in the development of PE by examining its expression in maternal serum in combina-tion with urinary protein levels.

1. 子痫的定义及发病机制

子痫前期(Preeclampsia, PE)一般是在妊娠20周后发生的妊娠期特有的疾病，诊断标准一般是血压高于正常值，伴有尿蛋白 ≥ 0.3 g/24h，或随机蛋白尿阳性；其发病率在2%~5%，是导致母婴妊娠不良结局的主要病因之一，包括子痫、胎盘早剥、HELLP综合征、死产等 [1] 。如果有可能预测PE的发生发展，进行适当的监测，并且在获得一些临床或实验室证据支持高危血栓形成的前提条件下，早期引入阿司匹林、钙或肝素，对于预防妊娠不良结局起到更大作用 [2] 。

目前研究表明，PE的病理特点主要是螺旋动脉血管内浅层细胞滋养细胞浸润和内皮细胞功能障碍 [3] 。目前病因虽未完全明确，但有4种假说受到认可：胎盘缺血、极低密度脂蛋白与毒性预防活性、免疫失调和遗传印迹。需要说明的是，虽然这四种假说是分开描述的，但它们相互作用。PE作为胎盘起源类疾病，分为两阶段。第一阶段是螺旋动脉形成受影响，导致胎盘血液供应不足。第二阶段是胎盘供血不足造成的对母婴的影响。内皮细胞功能障碍似乎成为PE发病的共同途径，各种因素加上母体易感性的差异，造成PE的病情严重程度变化 [4] 。随着研究进展，Redman [5] 完善其提出的子痫前期“二阶段模式”学说，发表了“六阶段模式”学说。其中，第一阶段是从受精开始至胚胎在子宫内膜着床，第一阶段用时短，母体会出现对于胚胎来自父亲基因的免疫不耐受。第二阶段则开始时间早、持续时间久，通常发生在妊娠的第8~18周，即胎盘产生发育的重要时期。PE发病的重要原因被认为是子宫螺旋动脉受滋养细胞侵袭，导致胎盘形成异常。故第二阶段被认为是研究胎盘滋养细胞病理改变和寻找PE早期预测和诊断生物标志物的黄金阶段。第三阶段是指母体机体出现应激反应。第四阶段是指妊娠到达中晚期后，胎盘会释放出各类损伤因子进入母体的血液循环，造成母体的血管内皮细胞损伤及各靶器官的炎症免疫反应。PE的第五阶段是指母体出现临床表现，如高血压等。较少患者到达第六阶段，此时患者病情急剧变化，螺旋动脉迅速粥样硬化，胎盘血液灌注减少，血管内血栓形成，最终胎盘梗死引起后续病变 [6] 。

2. 子痫和WNT信号通路

PE被认为是胎盘起源的妊娠并发症，滋养细胞作为胎盘的主要细胞类型之一，与癌细胞具有相似的侵袭性，对人类具有免疫耐受性。其生物学行为模式具有正常分化、增殖、凋亡、迁移和浸润的能力，是胚胎着床与胎盘形成的关键之一。滋养细胞的生长增殖与PE的发病率密切相关。相关研究提示，子痫前期是滋养层形成胎盘的浅着床和子宫螺旋动脉重塑失败的结果。而体内细胞功能的改变，主要依靠信号传导通路传递分子信息来实现 [7] [8] 。

WNT基因是一类癌基因，包括至少19种WNT蛋白。它在进化上高度保守，作为哺乳动物发育的主要调节因子，是大多数类型组织干细胞的关键驱动因素。突变的WNT信号通路会引起机体发育异常，与多种肿瘤的发生密切相关 [9] 。WNT信号传导通路被经典的分为两种细胞内通路，典型的不依赖β-catenin的WNT通路和其他的不依赖β-catenin的WNT通路，这些通路统称为非典型的WNT通路。但这两种通路之间存在交叉信号 [10] 。目前研究表明，WNT信号通路在胚胎发生和成体组织稳态期间对于干细胞更新、细胞增殖和分化上都起到重要作用 [11] 。作为胚胎发生、器官形成发育和体内维持平衡的强大调节因子。WNT信号通路涉及直接参与基因转录和细胞粘附的蛋白质，对于细胞增殖、组织再生、胚胎发育等正常生理过程发挥关键作用，其信号通路的特点是有大量的配体、受体和共受体，并且在不同水平下进行调控 [10] 。

目前研究已经证实WNT信号通路障碍与一些疾病密切相关，包括癌症、风湿病、骨病、糖尿病和阿尔茨海默病。WNT信号通路目前研究最受关注的WNT信号通路是WNT/β-catenin信号通路，其是调控生物体内细胞生长、发育及分化的关键信号传导通路之一，经典的WNT信号通路是WNT蛋白与膜受体结合后传递信号，引起细胞质的β-连环蛋白(β-catenin)改变，引起目的基因的转录，进而起到调控靶细胞的分化、增殖、凋亡等目的。随着在典型WNT通路激活中发现关键的“细胞内”信号介质，多种WNT配体、WNT拮抗剂和WNT激动剂被逐渐确认，这些配体具有复杂的调节机制。到目前为止，已经发现了5个可溶性和细胞外WNT拮抗剂家族。分别是分泌卷曲相关蛋白(sFRP)、WNT抑制因子(WIF-1)、Cerberus、Wise/SOST和Dickkopf家族蛋白。sFRPs和WIF1在细胞外空间隔离WNT配体，DKK家族蛋白和Wise/SOST则是竞争性的结合WNT配体受体LRP5/6。DKK基因在脊椎动物中由多个家族成员构成(包括DKK1、DKK2、DKK3及DKK4等)。DKK蛋白共享两个高度保守的富含半胱氨酸的结构域，即CRD1和CRD2。DKK1、2和4结合到WNT受体LRP5和LRP6，并作为WNT拮抗剂存在。同时，DKK3在WNT信号通路中发挥的作用仍未完全明确。DKK1目前已被证实是一种分泌型糖蛋白，广泛表达于多种组织中，包括皮肤、骨细胞、内皮组织和胎盘，其可通过与LRP5/6结合来抑制WNT诱导的Fzd-LRP5/6复合物形成，在拮抗WNT信号转导通路中起到关键作用，它可以与脂蛋白受体相关蛋白结合，阻断脂蛋白受体相关蛋白和WNT蛋白复合物的形成，从而抑制典型的WNT信号通路。因此，DKK1被认为是WNT信号通路的全面调节因子，参与机体的炎症、动脉粥样硬化发生和糖代谢调节等 [12] [13] [14] [15] 。WNT信号通路传递信号突变时，DKK1水平升高与WNT靶基因DKK1在典型WNT通路中已发现的调节作用(负反馈)一致。同时，DKK1也是β-catenin的靶基因，当β-catenin水平升高时，DKK1水平随之升高。在正常细胞中，DKK1对WNT/β-catenin通路起到负反馈作用，通过与细胞膜上与受体结合的WNT配体竞争降低活性 [16] 。WNT信号通路的功能障碍可能抑制胎盘滋养细胞的增殖和侵袭，导致浅层滋养细胞侵袭和子宫螺旋动脉重构失败。作为WNT信号通路的拮抗剂，DKK1可以通过与LRP5/6结合，抑制WNT通路诱导的Fz-LRP5/6复合物的形成，达到抑制胎盘着床到子宫内膜的目的，即抑制人绒毛外植体中细胞滋养层细胞的增殖 [8] 。

3. 子痫的尿蛋白产生机制

PE发病机制复杂，是多因素共同作用的结果，发病过程涉及全身多个器官、多个系统。肾脏是PE病理改变的主要靶器官之一。PE患者由于内皮细胞功能紊乱，往往处于抗血管生成状态，全身小动脉痉挛收缩，引起各脏器血流灌注减少，肾小动脉血流灌注量下降，引起肾脏缺血，肾小球滤过屏障受损，滤过率下降；受肾小球滤过率下降影响，肾小球基底膜损伤。肾小球基底膜通透性上升后，无法正常过滤蛋白质，最终引起尿液中蛋白质含量增加，出现蛋白尿 [17] [18] 。由于PE患者血液处于高凝状态，血液流速减小，黏滞度增加，内皮细胞功能紊乱，微血管血栓形成也会加剧肾脏的受损程度，导致体液和蛋白质渗漏，影响PE预后。子痫疾病是一个动态过程 [19] ，原则向来是早发现早治疗，尽可能降低并发症对于母婴安全健康的影响。作为对于缺血缺氧最敏感的脏器之一，肾脏常作为反应病情严重程度并评价预后的指标之一。但由于肾脏的代偿能力十分强大，其发病常常隐匿，发病早期常无明显症状，所以虽然肾脏最早受累，但寻找早期能够准确反映肾功改变的指标也十分重要。起病初期，血肌酐、尿素氮实验室检查结果多处于正常范围，尿常规检查、尿蛋白也提示阴性。病变轻微的患者易被遗漏。尿液检测出现异常时，肾脏通常已出现明显损害。目前临床上测定尿蛋白平较常采用24小时尿蛋白定量，但其结果易受尿液浓度、尿量和留尿时间差异的影响导致误差。并且，用试纸检测蛋白尿已被证明是不准确的。假阳性和假阴性率都高，尿液中蛋白质的浓度也不是恒定的，它的浓度直接受到尿液被肾脏浓缩的程度影响，以致一直变化。并且，尿液检测中通常选择白蛋白而非总蛋白过滤率，是因为总蛋白含有T amm-Horsfall糖蛋白，该糖蛋白在肾小管中产生，不反应肾小球损伤。因此选择白蛋白比总蛋白排泄率更能反应内皮功能障碍和肾小球损伤。然而，这种误差来源可以通过检测尿白蛋白/肌酐比值而不是尿液蛋白质浓度本身来消除。带有负电荷的尿微量白蛋白由肝脏分泌，因电荷排斥作用无法从滤过膜通过。因此被选作为判断肾小球滤过率和电荷滤过屏障损伤程度的重要标志蛋白。但其易受尿液浓缩、尿量变化的影响，不稳定。而人体内的肌酐的排泄率不受尿液量影响，数值相对恒定。为排除干扰因素，故现多选用尿微量白蛋白/肌酐比值评估患者的肾脏功能。其可用于快速排除或确诊蛋白尿，以及在临床症状包括蛋白尿的疾病，如肾病、子痫前期、糖尿病肾病、高血压肾病及儿童蛋白尿中，定量估计尿蛋白 [20] [21] [22] [23] [24] 。

近年来，WNT信号通路因其在肾脏疾病、癌症、骨病、糖尿病、类风湿性关节炎和阿尔茨海默病中的作用而受到了相当多的关注。WNT信号通路在肾脏系统发育的数个阶段都起到了重要作用，WNT-2b，WNT-4，WNT6，WNT7b，WNT9b等均在肾脏发育中表达，另外，WNT-4在肾小管形成中也起到关键作用。它强调了下游信号系统对于信号级联反应的依赖性。文献表明，考虑到WNT信号系统敲除所导致的严重表型，WNT信号传导失败可能与人类先天性肾和尿路异常有关 [25] [26] 。WNT信号通路的失调已被证实可导致肾功能异常，通过导致足细胞损伤、系膜细胞功能障碍和细胞外基质沉积，最终造成肾纤维化、缺血性损伤和急性肾功能衰竭 [27] 。

WNT信号通路在细胞增殖、细胞迁移、干细胞维持、组织修复和胚胎发育中都起到了至关重要的作用。WNT信号通路在细胞外的拮抗剂可分为两类，均可在细胞表面阻止WNT-Fz相互作用。第一类拮抗剂可以直接与WNT配体结合，包括WIF-1、sFRP和Cerberus。第二类是包括Dickkopf家族的成员，它们不同于前者，不通过WNT与Fz受体结合起到抑制作用 [27] 。DKK1作为WNT信号通路的特异性拮抗剂，通过调节WNT信号通路的活性影响细胞增殖、分化等行为。作为WNT信号通路的下游靶基因之一，DKK1随着WNT通路激活而活化。DKK1异常的表达通过影响WNT通路活性参与癌症等疾病的发生发展。目前，DKK1已被证实参与肾纤维化、葡萄糖代谢和炎症 [27] 。在狼疮鼠模型中，不仅肾脏组织中的DKK1 mRNA水平升高，DKK1蛋白在血清中的表达水平也明显升高。并且，狼疮鼠模型中，高浓度的DKK1不仅抑制WNT/β-catenin信号通路，同时还有明显的促凋亡作用 [28] 。

肾脏功能受损可检测的早期标志物是微量白蛋白尿的出现，随后是蛋白尿、滤过性升高，直至肾小球滤过屏障破坏。在糖尿病肾病中，蛋白尿被认为是疾病严重程度进展的指标。WNT通路目前已被证实参与肾纤维化，并在糖尿病肾病的发病机制中发挥双重作用。改善WNT信号通路可改善蛋白尿症状，系膜细胞功能障碍和细胞外基质沉积，下调WNT通路则引起肾损伤和肾纤维化，WNT信号通路的过度激活会促进足细胞损伤而加重蛋白尿。DKK1作为WNT信号通路的内源性抑制剂，也被报道有助于改善微血管并发症。不过在Hou [27] 等人的实验中，DKK1水平随着24小时尿蛋白的增加而逐渐降低，而DKK1的水平降低导致WNT信号通路异常激活，导致肾细胞损伤加重，蛋白尿增加。然而，冯 [29] 通过实验证明，在糖尿病患者中，随着蛋白尿水平的增加，血清DKK1的水平逐渐上升。两人研究的差别可能与样本采集、样本量和保存时间的差异引起，需进一步实验证明。

4. 总结

综上所述，作为WNT信号通路的拮抗剂，DKK1蛋白的表达水平与子痫前期的发病率密切相关，它参与肾脏的病变，成为子痫前期蛋白尿症状的影响因素之一。通过研究这三者之间的关联，有助于研究PE的疾病诊断及治疗，为研究子痫前期的发病机制寻找新的途径。

NOTES

^*通讯作者。