基于网络药理学探究海巴戟天与PCOS的潜在作用研究

Exploring the Potential Effect Study of Morinda citrifolia and PCOS Based on Network Pharmacology

摘要: 目的：本文通过网络药理学等现代生物信息技术，初步探究海巴戟天在PCOS的潜在作用。方法：从中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库筛选出海巴戟天的有效活性成分及其对应的基因靶点；利用OMIM数据库检索出与PCOS发生发展相关的靶点；构建药物–疾病靶点韦恩图；利用STRING软件进行PCOS潜在的药物靶点的蛋白互作网络(PPI)，并通过DAVID数据库平台进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。结果：筛选出海巴戟天的有效活性成分共有159种，对应的基因靶点有1022个；PCOS疾病相关基因靶点641个，药物–疾病的核心靶点有PIK3CD、MTOR、CDC42、SLC9A1、ODC1、EIF2AK3、CXCR4；GO功能分析及KEGG主要富集在钙介导的信号、细胞增殖的正向调控、蛋白丝氨酸/氨酸激酶活性等生物过程，以及白细胞经内皮迁移、甲状腺激素信号通路、非酒精性脂肪肝等信号通路。结论：基于生物信息学技术方法，海巴戟天可能作用于7个核心基因，并通过参与白细胞经内皮迁移、甲状腺激素信号通路等多种通路调控PCOS发生发展。

Abstract: Objective: This paper through modern bioinformation technology such as network pharmacology to explore the potential role of Morinda citrifolia in PCOS. Methods: The active ingredient and corre-sponding gene targets of Morinda citrifolia were screened from the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP). The OMIM database was used to retrieve the targets related to the occurrence and development of PCOS, and the drug-disease tar-gets Venn diagram was constructed. Using STRING software to carry out Protein-Protein Interaction (PPI) of potential drug targets for PCOS, and gene ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analysis through the DAVID database platform. Results: A total of 159 active ingredients were screened, and 1022 corresponding gene targets were screened. There are 641 PCOS disease-related gene targets, and the core targets of drug-disease are PIK3CD, MTOR, CDC42, SLC9A1, ODC1, EIF2AK3, CXCR4; GO function analysis and KEGG are mainly enriched in calcium-mediated signaling, positive regulation of cell proliferation, protein serine/aminokinase activity and other biological processes, as well as leukocyte endothelial migration, thyroid hormone signaling pathway, nonalcoholic fatty liver disease and other signaling pathways. Conclusion: Based on bioinformatics detection, Morinda citrifolia may act on 7 core genes and regulate the occurrence and development of PCOS by participating in various pathways such as leukocyte transendothelial migration and thyroid hormone signaling pathway.

1. 引言

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome, PCOS)是影响育龄期女性不孕的妇科内分泌疾病之一，在我国育龄期女性当中就有6%~10%的发病率 [1] 。PCOS目前病因不清，发病机制多样，有慢性低度炎症、氧化应激等多种发病机制。PCOS目前治疗现状主要针对于改善临床症状，仍是研究学者关注的热点话题。

海巴戟天(Morinda citrifolia)，又名诺丽果，是茜草科巴戟天属植物，具有抗炎、抗氧化、抑菌等药理作用 [2] 。研究发现 [3] ，海巴戟天提取物有抗氧化功效，能保护细胞氧化应激和凋亡，对肝脏损伤有防治作用。海巴戟天的抗氧化性还能够调节受损心肌细胞能量代谢，缓解心力衰竭的发展 [4] 。海巴戟天的有效成分能够缓解由金黄色葡萄球菌、沙门氏菌引起的炎症症状 [5] 。此外，海巴戟天提取物通过抑制血管表面的钙通道和细胞内钙的释放，对血管起舒张及解痉作用，具有降血压功效 [6] 。然而，海巴戟天作用于PCOS的研究不多。我们通过网络药理学方法，初步探讨海巴戟天与PCOS的潜在作用，为PCOS的发病机制及治疗提供新思路。

2. 资料与方法

2.1. 资料

中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP, http://tcmspw.com)，Swiss Target Prediction数据库 (http://www.swisstargetprediction.ch/)，Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)，在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM, https://omim.org/)，STRING数据库(https://string-db.org/)，DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)。

2.2. 方法

2.2.1. 海巴戟天有效活性成分筛选及靶点预测

应用TCMSP数据库平台，根据口服利用度(OB) ≥ 30%和类药性(DL) ≥ 0.18为筛选标准，筛选出海巴戟天有效的活性成分。Swiss Target Prediction数据库预测其靶点。通过Uniprot数据库对靶点进行基因名转化。

2.2.2. PCOS疾病靶点筛选及交集基因靶点

以“Polycystic ovary syndrome”为检索词，从OMIM数据库检索与PCOS发生发展的相关靶点。构建韦恩图，即药物–疾病交集基因靶点。

2.2.3. 蛋白质互作网络图的构建

将PCOS的潜在药物靶点导入STRING数据库，蛋白种属限定为“Homo sapiens”，构建蛋白质–蛋白质互作网络图(Protein-Protein Interaction, PPI)。

2.2.4. 基因功能和通路富集分析

通过DAVID数据库，设置“Homo sapiens”分析条件，对交集基因进行基因本体(gene ontology, GO)功能和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes of Genes and Genomes, KEGG)通路分析，以P < 0.05为设定标准，对P value值相对最小的结果进行分析，并以气泡图形式展现。

3. 结果

3.1. 海巴戟天有效活性成分筛选及靶点预测

运用TCMSP数据库筛选海巴戟天成分信息，以OB ≥ 30%和DL ≥ 0.18为筛选标准，共获得159种有效活性成分，筛选分值靠前的20种有效成分，包括芫花素、黄岑素、原儿茶醛、异棕榈酸等，见表1。Uniprot数据库对筛选出的有效活性成分进行检索，共得到1022个靶点。

Table 1. Potential active ingredients of Morinda citrifolia

表1. 海巴戟天潜在有效活性成分

3.2. PCOS疾病靶点筛选及交集基因靶点

在OMIM数据库中进行检索，去除重复项，共得到641个PCOS相关靶点。通过构建韦恩图，将药物有效活性成分对应的靶点与PCOS发生发展相关的靶点交互起来，直观看到二者交集的部分，认为是海巴戟天作用于PCOS潜在的药物靶点，共有10个，见图1。

注：蓝色为海巴戟天基因靶点，黄色为PCOS基因靶点，中间为药物疾病交集基因靶点。

Figure 1. Drug-disease target Venn diagram

图1. 药物–疾病靶点韦恩图

3.3. 蛋白互作网络图及核心基因

在STRING网站中输入所得的药物–疾病交集基因靶点，包括扩增出的靶点，得到PPI网络关系图，见图2(a)。PPI结果包含15个节点，网络中的节点表示蛋白质，连线表示蛋白质之间的相互作用，连线越多表示关系越紧密。从复杂的PPI网络图中拓扑出7个核心基因，分别为MTOR、CXCR4、ODC1、PIK3CD、CDC42、EIF2AK3、SLC9A1，见图2(b)。这些核心基因可能是海巴戟天作用在PCOS的潜在关键基因。

3.4. GO功能富集分析

得到核心基因富集至的生物过程(Biological Process, BP)有748条，富集至细胞组分(Cellular Component, CC)有28条，富集至分子功能(Molecular Function, MF)有54条。选取P值靠前的10条结果分析，见图3。结果显示，生物过程主要涉及钙介导的信号(calcium-mediated signaling)、细胞增殖的正向调控(positive regulation of cell growth)、第二信使介导的信号(second-messenger-mediated signaling)等；细胞组分主要涉及细胞前缘(cell leading edge)、胞质核糖体(cytosolic ribosome)、吞噬泡(phagocytic vesicle)等；分子功能主要涉及翻译调节器活性(translation regulator activity)、药物结合(drug binding)、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)等。表明海巴戟天可能通过多种生物功能来发挥作用。

(a) (b)

Figure 2. (a) PCOS potential drug target PPI network diagram; (b) Diagram of the core gene PPI network

图2. (a) PCOS潜在的药物靶点PPI网络关系图；(b) 核心基因PPI网络关系图

注：生物过程：Biological Process, BP；细胞组分：Cellular Component, CC；分子功能：Molecular Function, MF。

Figure 3. Bubble plot of GO function enrichment analysis

图3. GO功能富集分析的气泡图

3.5. KEGG信号通路富集分析

采用DAVID数据库对核心基因进行KEGG通路富集分析，共得到74条通路。取P值较小的前10条通路，见图4，纵坐标表示富集的通路名称，P值表示富集的程度，颜色越深表示富集到此条通路的关联性越高。主要涉及白细胞经内皮迁移(Leukocyte transendothelial migration)、肌动蛋白细胞骨架的调节(Regulation of actin cytoskeleton)、甲状腺激素信号通路(Thyroid hormone signaling pathway)、非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease)等信号通路。表明海巴戟天可能作用于多种通路来发挥作用。

Figure 4. Bubble plot of KEGG pathway enrichment analysis

图4. KEGG通路富集分析的气泡图

4. 讨论

本文运用网络药理学及生物信息技术，初步探究海巴戟天与PCOS的潜在作用，共获得海巴戟天159种有效活性成分，1022个预测靶点，641个PCOS疾病相关靶点，并取得两者交集基因，有7个核心基因。海巴戟天作用于PCOS的潜在关键基因有MTOR、CXCR4、ODC1、PIK3CD、CDC42、EIF2AK3、SLC9A1。

MTOR对细胞的增殖、分化、凋亡等具有调节能力，实验表明 [7] ，MTOR蛋白在PCOS患者的颗粒细胞中高表达，PCOS患者卵巢颗粒细胞局部存在MTOR通路异常活化，并影响内分泌的代谢，导致生物学功能异常，进而影响卵泡生长发育。磷酸化的MTOR可进一步激活下游的S6核糖体蛋白(RPS6K)发挥作用，刘进 [8] 的研究中检测到PCOS大鼠和体外培养的卵巢颗粒细胞中具有MTOR和RPS6及其磷酸化的表达，表明了MTOR通路异常活化状态可影响PCOS发生。另有研究发现AKT/MTOR/RPS6这一信号通路可影响并加重胰岛素抵抗的形成 [9] ，最终结果均导致PCOS的发生发展。CXCR4位于细胞膜上，是七通道跨膜G蛋白偶联受体家族，是CXCL12的同源性受体，研究表明 [10] ，CXCL12/CXCR4生物轴能够影响细胞的迁移、增殖、分化、侵袭等，在肿瘤的研究较多。Jin等 [11] 实验发现，CXCL12、CXCR4在PCOS大鼠的卵巢中表达降低，而细胞凋亡增加，并伴有BCL2降低及BAX、Caspase3增加。BCL2、BAX、CASP3被认为是凋亡相关蛋白，BCL2是BCL2家族蛋白中突出的抗凋亡因子，BAX是促凋亡因子，而Caspase家族通常是凋亡过程的关键 [12] [13] 。推测CXCL12/CXCR4信号传导可调节BCL2、BAX及CASP3的表达，影响颗粒细胞凋亡，进一步促进PCOS的发展。ODC参与胞内多胺代谢过程，具有ODC1、ODC2两个基因拷贝，ODC1位于染色体2p25，研究发现，ODC在妇科恶性肿瘤中异常表达，其活性升高与肿瘤的发生进展密切相关，但是尚未发现作用于PCOS的相关研究。PCOS具有家族遗传倾向，遗传因素在PCOS的发病机制中具有重要地位 [14] ，林琳等 [15] 通过芯片检测对比PCOS患者和健康人群的基因多态性，筛选出PIK3CD、FGF13、GNAO1为易感基因，PIK3CD在不同基因型分布差异具有统计学意义，PIK3CD基因多态性位点rs6541017在显性模型GA-GG基因型与发生PCOS的危险性有关。PIK3CD是磷酸肌醇3激酶(PI3Ks)家族成员，有研究发现PI3K/Akt信号通路影响PCOS患者子宫内膜发生病变，尤其是合并胰岛素抵抗者 [16] ，推测PI3K/Akt通路是否与PCOS远期并发症如子宫内膜癌有关。另有研究表明，肥胖、高雄激素血症、胰岛素抵抗的发生与PI3K/Akt通路有关 [17] ，提示PIK3CD及其相关信号通路与PCOS的发生及进展有一定相关性。细胞分裂周期蛋白42 (cell division cycle 42, CDC42)是Rho家族蛋白中研究较多的小分子蛋白，具有鸟嘌呤三核苷酸酶活性，研究发现其在细胞凋亡、肿瘤浸润及转移有重要作用 [18] 。Lin [19] 的研究中，PCOS患者血清中miR-23a显著低水平，并影响了FGD4表达水平，FGD4进一步激活CDC42，通过调节CDC42/PAK-1信号通路影响细胞周期、增殖及凋亡。氧化三甲胺(TMAO)为肠道微生物衍生的代谢产物，影响人类代谢综合征，在胰岛素抵抗的大鼠和人类中水平升高，同时高水平的TMAO可能参与PCOS的慢性低度炎症机制 [20] 。EIF2AK3明确为TMAO的受体，二者以一定浓度结合诱导代谢疾病的关键驱动因子FOXO1 [21] ，而胰岛素抵抗作为PCOS发病的病理基础，EIF2AK3、TMAO、胰岛素抵抗三者在PCOS人群中是否有内在联系性目前尚没有相关研究。此外，研究发现EIF2AK3还与阿尔兹海默病有相关性 [22] 。经查阅文献，通过网络药理学筛选出的关键靶基因参与细胞增殖、凋亡等生物过程，推测海巴戟天可能调节上述靶点发挥治疗PCOS的作用。

KEGG通路富集分析显示，海巴戟天可能从多个通路参与治疗PCOS。PCOS患者常伴随内分泌代谢紊乱，其甲状腺病变的发病率也较正常人升高，甲状腺功能异常与PCOS相关，二者互为因果，关系复杂 [23] 。本研究挖掘的交集靶基因富集于甲状腺激素信号通路，提示海巴戟天可能在该通路上发挥治疗作用。越来越多的证据证明PCOS患者有更高的概率发生非酒精性脂肪肝，肥胖、胰岛素抵抗、高雄激素血症等被认为是促进非酒精性脂肪肝发生的相关因素 [24] [25] ，本研究结果表明海巴戟天可作用于PCOS和非酒精性脂肪肝的共同致病基因，需更深入的挖掘。普遍认为PCOS患者处于亚临床炎症状态，体内抗炎因子与促炎因子失衡促进疾病发生 [26] ，白细胞黏附、经内皮迁移向炎症部位游走是炎症反应的基本特征 [27] 。Wang [28] 的研究发现miR-4651在PCOS中表达，并通过白细胞经内皮迁移参与炎症发生。

综上所述，提示PCOS进展可能与炎症、凋亡、激素改变等有关，推测海巴戟天可能通过缓解炎症、减少凋亡、调节激素等途径来发挥治疗作用。海巴戟天与PCOS的潜在作用关系存在多靶点、多通路的特点，为深入研究PCOS的机制及治疗提供了实验方向。

基金项目

海南省自然科学基金高层次人才项目(821RC691)；海南省重点研发计划项目(ZDYF2022SHFZ071)。

NOTES

^*通讯作者。