基于LASP1、CXCR1探析全真一气汤对COPD大鼠的炎症反应和免疫功能的影响

The Effects of Quanzhen Yiqi Decoction on Inflammatory Response and Immune Function of COPD Rats Were Analyzed Based on LASP1 and CXCR1

摘要: 目的：观察全真一气汤对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织LASP1和CXCR1表达的影响，探析全真一气汤对COPD的炎症反应和免疫功能的影响。方法：将18只SD大鼠随机分为中药组和模型组，每组各9只。利用烟熏联合内毒素脂多糖(LPS)构建COPD大鼠模型。模型组每日予0.9%生理盐水灌胃；中药组每日予40%全真一气汤浓缩汤剂灌胃。利用PCR技术检测大鼠肺组织LASP1和CXCR1mRNA水平的变化，Western blot检测大鼠肺组织LASP1和CXCR1蛋白水平的变化。结果：中药组LASP1 mRNA表达丰度为模型组的0.145倍；中药组CXCR1 mRNA表达丰度为模型组的0.614倍。与模型组相比，中药组LASP1、CXCR1蛋白表达水平均显著降低。结论：全真一气汤能通过下调LASP1和CXCR1基因及蛋白的表达，改善COPD大鼠炎症微环境，这可能是其降低COPD引起肺癌发生风险的潜在机制之一。

Abstract: Objective: To observe the effects of Quanzhen Yiqi Decoction on the expression of LASP1 and CXCR1 in lung tissue of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) rats, and to explore the effects of Quanzhen Yiqi Decoction on inflammation and immune function of COPD. Methods: Eighteen SD rats were randomly divided into Chinese medicine group and model group, with 9 rats in each group. COPD rat model was established by smoking combined with lipopolysaccharide (LPS). The model group was given 0.9% normal saline daily. The traditional Chinese medicine group was given 40% Quanzhen Yiqi Decoction concentrated decoction every day. The mrna levels of LASP1 and CXCR1 in rat lung tissue were detected by fluorescence quantitative PCR, and the protein levels of LASP1 and CXCr1 in rat lung tissue were detected by Western blot. Results: The mRNA expression abundance of LASP1 in the Chinese medicine group was 0.145 times that in the model group. The mRNA expression abundance of CXCR1 in the TCM group was 0.614 times of that in the model group. Compared with model group, the protein expression levels of LASP1 and CXCR1 in TCM group were significantly decreased. Conclusions: Quanzhen Yiqi Decoction can inhibit airway inflammation in COPD rats by down-regulating the expressions of LASP1 and CXCR1 genes and proteins, which may be one of the potential mechanisms to reduce the risk of lung cancer caused by COPD.

1. 引言

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种以不完全可逆的气流受限和持续呼吸道症状为特点的慢性、进展性的呼吸系统疾病，当前，它已成为全球第三大致死因素 [1] [2] 。肺癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤 [3] 。现在普遍认为，COPD为肺癌的独立危险因素，其对肺癌的发生存在一定的影响 [4] ，但机制尚不清楚。CXC趋化因子受体1 (CXC-Chemokine Receptor 1, CXCR1)是一种炎症因子，已有实验发现抑制CXCR1 mRNA及其蛋白的表达，可以减轻COPD的炎症反应 [5] 。LIM和SH3结构域蛋白1 (LIM and SH3 protein 1, LASP1)是一种肿瘤转移相关蛋白，是一个受缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)直接调控的下游靶基因 [6] 。HIF-1α可以上调LASP1水平，使其参与肿瘤生长、血管形成、侵袭转移，导致肺癌进展 [6] [7] 。根据既往报道，CXCR1、LASP1均已被证实在COPD中高表达，与COPD的进展密切相关 [8] [9] [10] 。COPD易将早期肺癌的临床表现掩盖，让患者疏于对肺癌的筛查，因此当临床确诊肺癌时往往已经发展到了晚期，而COPD患者普遍心肺功能不佳，导致对COPD合并肺癌的治疗变得非常困难。这便体现了早期预防与及时治疗的重要性，与中医药“治未病”的思想不谋而合。COPD属祖国医学“肺胀”范畴，肺癌可归于“肺积”范畴，二者病位均在肺，涉及脾肾。全真一气汤出自清代名医冯兆张的著作《冯氏锦囊秘录》，蕴含“生脉散”与“参附汤”在其中，使“滋阴而不滞，补脾而不燥，清肺而不寒”，具有补肺、健脾、益肾之效。本团队通过前期实验研究发现，全真一气汤对缓解COPD症状有较好的疗效 [11] [12] [13] 。为进一步探索全真一气汤的多靶点多通路，本实验通过构建COPD大鼠模型，并用全真一气汤进行干预，检测大鼠肺组织中LASP1、CXCR1基因及蛋白水平，探析全真一气汤对COPD的炎症反应和免疫功能的影响。

2. 主要材料与试剂

2.1. 实验动物

18只SD大鼠(体质量180~220 g)，清洁级，由广东省医学实验动物中心提供(NO: 70092411)。本研究的动物实验操作均于福建中医药研究院动物实验中心鼠类实验室(清洁级)进行。动物使用符合福建省医学实验动物管理委员会管理条例。

2.2. 药物

全真一气汤，具体药物组成及剂量如下：麦门冬15 g，熟地黄15 g，五味子6 g，炒白术6 g，川牛膝15 g，黑顺片6 g，生晒参15 g (药材均由福建省药材公司提供，浓缩中药汤剂均由福建省第二人民医院制剂中心制作)。中药煎煮法：① 按组方比例称取中药材226 g，加蒸馏水没过药材，浸泡30分钟后用电炉锅煮沸，煮沸后再持续煎30分钟，用纱布过滤，得滤液，留滤渣；② 滤渣再加蒸馏水，并用同一个电炉锅煮沸，煮沸后再煎20分钟，用纱布过滤，得滤液；③ 将2次所得的滤液混匀，加热浓缩成含药量为1.0 g/ml、体积为226 ml的汤剂。

2.3. 试剂与仪器

SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒(TaKaRa公司，Code:DRR820A)；RNAiso Plus (TaKaRa公司，Code:D9108A)；ExScriptTM RT Reagent Kit试剂盒(TaKaRa公司，Code:DRR037A)；Rat_Gapdh_primer (TaKaRa公司，Code:D379212)；兔抗大鼠LASP1抗体(美国Santa Craz公司)；兔抗大鼠CXCR1抗体(美国Santa Craz公司)；戊二醛(上海化学试剂有限公司)；四氧化锇(上海化学试剂有限公司)；7500Fast实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；Westen-blotting (美国BIO-RAD)。

3. 方法

3.1. 分组

18只SD大鼠利用随机数字表法随机分为2组，分别为中药组与模型组，每组各9只。

3.2. 动物模型建立及给药方法

参照本团队前期研究 [9] ，于造模第1天、第11天、第21天用10%水合氯醛(剂量为0.3 mL/100g)腹腔注射麻醉两组大鼠，将0.2 mL (1 mg/mL)的内毒素LPS注入气管内。从实验开始的第2天起，将所有大鼠置于自制玻璃箱内，玻璃箱规格为30 cm × 40 cm × 50 cm，用浓度为5%的烟持续烟熏进行造模，每次约30分钟，持续60天(气管内滴注日不烟熏)。从实验第2天起，模型组每日予0.9%生理盐水灌胃，中药组每日予40%全真一气汤浓缩汤剂灌胃，均持续60天。在第60天后，按随机取样的原则，分别于模型组和中药随机选取3只大鼠，取样本大鼠右肺大小约1 cm × 1 cm的新鲜肺组织，用灭菌的锡箔纸将它们包裹起来，放入液氮中进行速冻，后转至−80℃的冰箱中冷藏保存，用于实时荧光定量PCR和Westen-blotting检测。

3.3. 观察指标及测定方法

3.3.1. 大鼠一般情况

每日观察两组大鼠的整体状态，包括精神情况、毛发色泽、呼吸系统症状及重量变化情况等。

3.3.2. 实时荧光定量PCR检测大鼠肺组织中LASP1、CXCR1 mRNA的表达

取大鼠右肺组织50 mg，在对其进行研磨之后，用TRIzol (invitrogen)法抽提取总RNA，提取出的总RNA利用ExScriptTM RT Reagent Kit试剂盒反转录为cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒以7500 Software v2.0.5进行荧光扩增。Genebank序列，由宝生物工程(大连)有限公司合成，使用 SYBR Green I嵌合荧光法，用该序列检测基因的上下游引物序列，见表1。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性30 s，60℃延伸1 min，循环40次，以GAPDH为内参照，采用2−∆∆Ct法计算LASP1 mRNA、CXCR1 mRNA的相对表达量。将模拟组的mRNA表达量用“1”表示，用校正值求出正常组的mRNA含量，比较两组之间的mRNA表达量。

Table 1. The primer sequence and product length of gene were detected

表1. 检测基因的引物序列和产物长度

3.3.3. Western blot检测大鼠肺组织中LASP1、CXCR1蛋白的表达

取大鼠右肺组织50 mg，与相应裂解液按1:10混合，匀浆，将其离心，取上清液，用BCA法检测蛋白浓度。加入缓冲液，经100℃变性，取20 μg，电泳、转膜后放置在5%脱脂牛奶中，在室温的条件下封闭1 h，再加一抗(LASP1、CXCR1；CST公司)，在4℃下孵育过夜，第二日加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(碧云天)，在室温条件下孵育1 h，TBST充分洗膜后，利用ECL显影以检测标本膜上的信号。

3.3.4. 统计学分析

各组数值用SPSS 21.0软件进行统计分析，P < 0.05为差异具有统计学意义。

4. 结果

4.1. 大鼠一般情况

实验结束时，模型组与中药组均生存。两组大鼠在初期均有出现咳、喘、鼻腔分泌物等呼吸系统症状。模型组精神倦怠，毛色暗黄，伴有咳、喘、鼻腔分泌物流出等呼吸系统症状，体重减轻；中药组精神尚佳，毛色光亮，呼吸系统症状明显缓解，体重增加。

4.2. PCR结果

据PCR结果，中药组LASP1、CXCR1 mRNA表达丰度较模型组降低了0.145和0.614倍，见图1、图2、图3、图4、图5、图6、表2、表3。

Figure 1. LASP1 mRNA amplification curves of each group

图1. 各组LASP1 mRNA扩增曲线

Figure 2. CXCR1 mRNA amplification curves of each group

图2. 各组CXCR1 mRNA扩增曲线

Figure 3. LASP1 mRNA dissolution curves of each group

图3. 各组LASP1 mRNA溶解曲线

Figure 4. CXCR1 mRNA dissolution curves of each group

图4. 各组CXCR1 mRNA溶解曲线

Figure 5. LASP1 mRNA expression abundance in each group

图5. 各组LASP1 mRNA表达丰度

Figure 6. CXCR1 mRNA expression abundance in each group

图6. 各组CXCR1 mRNA表达丰度

Table 2. LASP1 mRNA expression abundance in each group

表2. 各组大鼠LASP1 mRNA表达丰度

Table 3. CXCR1 mRNA expression abundance in each group

表3. 各组大鼠CXCR1 mRNA表达丰度

4.3. Western blot检测

与模型组相比，中药组LASP1、CXCR1蛋白的表达均下调，见图7。

Figure 7. Western blot analysis was performed to detect the expression levels of LASP1 and CXCR1 protein in model group and Chinese medicine group

图7. Western blot检测模型组、中药组大鼠LASP1、CXCR1蛋白表达水平

5. 讨论

近几年，COPD和肺癌的死亡率一直居高不下，是严重危害人类身体健康的公共卫生问题。COPD本质上可以说是一类可预防或治疗的进展性肺部炎症性病症，其与肺癌具有许多共同致病因素，如吸烟和空气污染等，且二者的临床表现具有一定的相似性。许多研究者 [14] [15] [16] 针对肺癌和COPD这两种疾病的关系进行了大范围的研究和探索，已证实COPD是肺癌独立风险因素之一，可以增加肺癌发生的风险，COPD患者罹患肺癌的概率是正常人群的2~4倍。但二者之间的相关机制尚不明确。

CXCR1是趋化因子CXCR家族的重要成员之一。CXCR1可与其配体相结合，直接参与炎症反应，促进COPD的炎症进程 [17] [18] [19] 。白细胞介素8 (interleukin, IL-8)与CXCR1同属趋化因子受体家族，是介导炎症的重要因子 [20] [21] 。当机体被感染时，过表达的IL-8可以同CXCR1相结合，诱导中性粒细胞等大量细胞游走至感染部位，参与炎症反应及肺组织损伤 [22] [23] 。因此当急性肺损伤时，抑制IL-8与中性粒细胞的相互作用可以对中性粒细胞的趋化性、炎症部位的中性粒细胞的弹性蛋白酶释放和 NADPH氧化酶的活化产生影响 [24] ，而IL-8主要通过与CXCR1结合来激活中性粒细胞NADPH氧化酶 [25] 。Park C R等 [26] 发现REEP5和REEP6与CXCR1相互作用可以增强了IL-8刺激的细胞反应。

LASP1为肌动蛋白结合蛋白，于1995年首次被发现在恶性肿瘤组织中高表达 [27] 。目前LASP1已被证实在不同类型的恶性肿瘤中过度表达，并且与增殖和侵袭显著相关 [27] [28] [29] 。TGF-β1被认为可以通过TGF-β1/Smad/Snail信号通路调节肺上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，EMT的核心是E-钙粘蛋白丢失，它在转录水平上受到Snail的调节 [30] 。LASP1是TGF-β1/Smad/Snail通路的靶标，TGF-β1可以上调LASP1表达，LASP1不仅可以影响pSmad2和pSmad3水平抑制EMT从细胞质进入细胞核，还可以直接与局部粘着斑激酶(FAK)结合，磷酸化FAK-AKT信号通路，上调Snail的表达，促进肺癌的发生发展 [30] [31] 。

LASP1是CXC趋化因子介导的一般介质，可直接通过LKIL基序与CXCR1相结合，调节肿瘤的迁移及生存率 [32] 。CXCR1已被证实与三阴乳腺癌的发生、发展密切相关，其可以通过在肿瘤微环境中优化肿瘤细胞向趋化因子(包括CXCR1、CXCR2等)的运动来调节乳腺癌的生长和侵袭 [33] 。且范学亮等 [34] 通过实验研究发现LASP1同CXCR1结合可以进一步参与肿瘤细胞的迁移过程。

COPD的主要病理机制是炎症。炎症反应及异常免疫应答被认可是COPD炎癌转化机制的核心 [1] 。Mantovani, A.发现炎症微环境可以破坏适应性免疫反应，有利于恶性细胞增殖和生长 [35] 。Lievense, L.A.提出气道炎症反应会导致肺结构性改变，并在机体修复时增加恶变的可能，提高肺癌发生的风险 [36] 。因此，炎症反应和免疫功能在肿瘤的发生和发展机制中均起到关键作用。本实验结果显示，与模型组比较，中药组的LASP1、CXCR1 mRNA和蛋白表达均下降，提示全真一气汤可能通过下调CXCR1、LASP1的表达，控制COPD炎症反应，并减少LASP1和CXCR1结合，降低肺癌发生的风险。目前，对肺癌的治疗，仍以外科手术为首选，然而许多患者不仅要面对术后肺功能的减弱及手术并发症，还要面临术后残留病灶进展或恶变。因此，预防发生、尽早发现和及时治疗就显得尤为重要，而体现“治未病”思想的中医药就显现出独特的优势。

按祖国传统医学理论，COPD属“肺胀”范畴，其主要表现为胀、咳、喘。肺胀病名首见于《内经》。《灵枢·胀论》有云：“肺胀者，虚满而喘咳”，认为“肺胀”乃病位在肺之胀病，是目前最早提出“肺胀”一词的医学典籍。朱丹溪在《丹溪心法》提出：“肺胀而咳，……此痰挟瘀血碍气而病”，说明了痰、瘀对肺胀发病的重要性，后世医家在其经验上运用四物汤加减治疗肺胀，疗效甚佳 [37] 。现代医家对COPD的认识已初步形成一个较为成熟的理论体系，认为病因有内外之分，病性多属本虚标实。本虚为脏气亏虚，尤其是肺脾肾，肺虚无力宣发肃降，肺气聚于胸中，故胸部胀满；肺气受损，协病及子，累及于肾，肺肾两虚，则摄纳无权，故出现气喘；肺为脾之子，子病及母，脾虚则痰内生，故见咳嗽、咳痰；肺朝百脉，肺虚无力助心行血，从而成瘀，故严重者可出现胸闷心悸、下肢水肿、舌质黯淡等表现。痰、瘀是肺胀之病理产物的同时，也是其重要的致病因素，痰瘀互结乃COPD发病的夙根这一理论已被现代许多医家所认可。至于肺癌，祖国医学并无相对应的病名，根据其临床症状，可将其归属于“肺积”范畴。《难经·五十六难》载：“肺之积，名曰息贲，……喘咳，发肺壅。”对肺积的临床表现进行简要的描述并首次提出该病病名。国医大师晁恩祥教授论肺积，认为其病因主要在虚、毒、痰、瘀，病机为气阴亏虚、痰瘀互结、毒邪积聚，病性多为本虚标实 [38] 。本虚主要责之肺脾，肺本为娇脏，极易受邪，邪毒伤肺，易伤津耗气，致气阴两虚；肺虚累脾，脾失运化则聚湿成痰，痰阻气机加之肺虚无力助心行血，从而成瘀，痰凝血瘀毒聚加之肺脾气阴亏虚则发为肺积。肺胀与肺积，二者病位均在肺，病性均为本虚标实，痰、瘀均为重要致病因素，且肺胀长期不愈，气虚更伤，逐渐加重发展可成肺积。

痰是一种因人体脏腑失和、津液代谢失常而产生的病理产物，具有重浊、粘滞之性，可随气机升降游窜至人体各处，还易夹他邪，致气滞、血瘀等而变生他病，是许多疾病的重要病机，古人有云“怪病多痰”。早在《神农本草经》便有“胸中痰结留饮痰癖”的记载，说明古人很早就认识到痰同瘤癌的关系密切。朱丹溪在《丹溪心法》提出“凡人身上、中、下有块者，……，无处不到”、“痰之为物，……，五脏六腑皆有”等阐发。痰的发病特征具有广泛性和流动性，这与恶性肿瘤起病部位难以确定且易转移至他处的特点有异曲同工之处，且痰为无形之邪，符合恶性肿瘤转移时隐匿的特点。因此，痰是炎症向癌症转化的重要病理因素 [39] 。瘀血为积存体内的离经之血，也是人体气血津液代谢失常的病理产物。其具有阻塞脉道、蓄积成块等特点，同恶性肿瘤的临床表现相符合。《张氏医通》指出“痰挟死血，……流走刺痛”，说明痰可通过阻滞气机而致瘀。《血证论》还指出“血积既久，亦能化为痰水”，说明痰、瘀可以相互转化。王清任在《医林改错》中提到“气无形不能结块，……血受热则煎熬成块”，进一步说明痰、瘀二者相辅相成，共同促进炎癌转化的进展。以病为本，治病求本为祖国医学所遵循的基本原则。全真一气汤为清代名医冯兆张的经典方剂，专为肺脾肾三脏俱虚而设，盖因肺为贮痰之器，脾为生痰之源，肾为生痰之本，三脏同补则痰浊自消。全方仅有7味药，其中炒白术健脾益气，麦门冬补肺生津，熟地黄滋阴补肾，意在培土生金，补肺益肾，三脏同补；再有川牛膝、五味子，取“牛膝趋下，五味收敛”之性，使纳气藏源，澄清降浊；黑顺片辛温，性善走，温肾助阳，同时助药力复可行经，生晒参大补元气，还可驾驱药力 [40] 。诸药配伍，共奏“补气、滋阴、纳敛”之功。除此之外，这7味中药均为现代药理学研究证实有调整人体免疫机能的作用，麦冬能抑制中性粒细胞起到抗炎作用，还能通过诱导IL-6等调节免疫系统 [41] ；白术虽不具有杀菌效果，但能在一定程度上抗炎、抗菌，同时和熟地黄一样均能促进淋巴细胞增殖 [42] [43] ；牛膝可以有效地防治机体免疫低下所致的呼吸系统感染，并在一定程度上抑制由于嗜酸性粒细胞增多而导致的支气管炎 [44] ；五味子的水煎液可对肺组织起保护作用，同时还能兴奋呼吸中枢，改善呼吸衰竭 [45] ；黑顺片，即附子，具有显著的抗炎、改善循环、增强免疫等效果 [46] ；生晒参可以保护肺结构，改善肺功能 [47] ，且对附子的心脏毒性有一定的治疗作用，这些作用都与中医的功效相符合，故笔者推测全真一气汤可能具有调节炎症反应和免疫功能的作用，与本实验结果并不相悖。

6. 结论

本研究采用全真一气汤对COPD大鼠模型进行灌胃干预处理后发现，中药组LASP1 mRNA表达丰度为模型组的 0.145倍，中药组CXCR1 mRNA表达丰度为模型组的0.614倍，中药组LASP1、CXCR1蛋白表达均降低，表明全真一气汤可能通过下调CXCR1和LASP1的表达，从而调节COPD大鼠气道免疫应答和减轻炎症反应。炎症反应及异常免疫应答是COPD炎癌转化机制的核心，阐明其潜在的发病机制可能为COPD炎癌转化治疗提供潜在的治疗靶点和基础依据。

基金项目

国家自然科学基金面上项目(81774097)；福建省自然科学基金(2020J01251)。

NOTES

^*通讯作者。