彝医火草治疗大鼠骨关节炎作用机制研究

The Mechanism of Action of Yi Medicine Leontopodium franchetii in the Treatment of Osteoarthritis in Rats

摘要: 目的：研究彝药火草对大鼠骨关节炎的作用及作用机制，为火草的开发及研究提供相关证据。方法：将60只雄性SD大鼠随机分为6组，每组10只，分别为空白对照组、模型组、阳性药物(扶他林乳膏3.0 g/kg)组、火草低、中、高剂量(1.2 g生药/kg、2.4 g生药/kg、4.8 g生药/kg)组，采用注射0.2 mL 6%木瓜蛋白酶溶液方法进行造模。造模成功后，各组使用相应药物进行干预4周。4周后肉眼观察其关节、毛发等外观情况；光镜下观察软骨组织HE染色病理切片；使用酶联免疫吸附法(ELISA)对大鼠软骨组织的TNF-α、IL-1β含量水平进行检测；采用免疫组化法对大鼠软骨组织的MMP13、SOX-9基因表达水平进行检测。结果：与空白组比较，模型组的关节红肿严重，大鼠滑膜组织中炎症因子IL-1β、TNF-α含量显著上升(P < 0.01)，软骨组织中MMP13基因的表达量显著上升(P < 0.01)，SOX-9基因的表达量显著下降(P < 0.05)；与模型组相比，火草各剂量组大鼠滑膜组织中TNF-α含量及软骨组织中MMP13基因表达水平均显著下降(P < 0.01)，火草低、高剂量组滑膜组织中IL-1β含量显著下降(P < 0.05)，火草高剂量组软骨组织中SOX-9基因表达水平显著上升(P < 0.05)，其余含量差异无统计学意义。结论：外敷火草药物对大鼠软骨组织有着保护关节的作用，并对软骨组织有一定的修复功能，可缓解骨关节炎的病症。

Abstract: Objective: To study the effect and mechanism of tiacon of Yi medicine L. franchetii on osteoarthritis in rats, and to provide relevant evidence for the development and research of Fireweed. Methods: 60 male SD rats were randomly divided into 6 groups of 10 rats each, namely, the blank control group, the model group, the positive drug (3.0 g/kg of Voltaline cream) group, and the L. franchetii low, medium, and high dose (1.2 g of raw drug/kg, 2.4 g of raw drug/kg, and 4.8 g of raw drug/kg) groups, and were modeled by injecting 0.2 mL of 6% papain solution. Observe the appearance of joints and hairs with the naked eye after 4 weeks; observe the HE-stained pathological sections of cartilage tissues under light microscope; the levels of TNF-α and IL-1β in rat cartilage tissues were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); the levels of MMP13 and SOX-9 genes in rat cartilage tissues were measured by immunohistochemistry. Result: Compared with the blank group, the model group had severe joint redness and swelling, and the levels of inflammatory factors IL-1β and TNF-α, the expression of MMP13 gene increased significantly (P < 0.01), and the expression of SOX-9 gene decreased significantly (P < 0.05) in the synovial tissue of rats in each dose group of L. franchetii; compared with the model group, the TNF-α content and MMP13 gene expression level in the synovial tissue of rats in each dose group of L. franchetii were significantly decreased (P < 0.01), the IL-1β content in the low and high dose groups of L. franchetii was significantly decreased (P < 0.05), and theSOX-9 gene expression level in the high dose group of L. franchetii was significantly increased (P < 0.05), but the rest of the content differences were not statistically significant. Conclusion: The external application of L. franchetii drug has a joint-protective effect on the cartilage tissue of rats and has a certain repair function on the cartilage tissue, which can relieve the disease of osteoarthritis.

1. 引言

骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一种以软骨退行性病变为病理基础的低度炎症性疾病，又称退行性关节病、增生性骨关节炎，是一种很常见的中老年人骨骼肌肉疾病，其鉴别诊断可分为类风湿关节炎、银屑病性关节炎及痛风性关节炎 [1] 。长久以来，OA引发的病症困扰着人们，给患者的日常生活造成了诸多不便，致残率常年高居不下，严重威胁着人们的生产生活 [2] 。OA的主要发生部位在手脚的小关节、膝关节和髋关节，发病特征主要为关节软骨的进行性退化伴随着继发性滑膜炎 [3] 。其病因涉及炎症、氧化应激、关节损伤、年龄等多种因素，各种致病因素间又有着相互促进或抑制的关系，发病机制十分复杂。近年来，中药因多途径、多靶点、低成本等治疗优势在OA的治疗中占据了重要地位，中药有效成分在OA的治疗中可对相关信号通路进行调控，并展现出良好的抗炎活性、抗氧化活性、抗代谢活性、增殖活性等 [4] 。

近年来，以中药内服、针灸、推拿、中药外敷、熏洗等中医治法的疗效在临床上得到了证实 [5] [6] [7] [8] 。各类民族医药技法也逐渐走入大众的生活，其中以彝医火草灸、傣医睡药疗法等为突出代表。火草灸，是一种彝医特色技法，以火草为原料，在OA的治疗中显示出良好的疗效 [9] ，其使用历史最早可追溯到300年前。菊科坚杆火绒草Leontopodium franchetii Beauv.是火草的主要来源之一，有清热利湿，解毒消肿，祛风止咳之效 [10] 。为进一步明确彝医火草灸的作用机制及提高临床疗效，本研究以坚杆火绒草为原料，构建大鼠骨关节炎OA模型，通过对膝关节的病理切片染色、炎症因子水平检测、相关通路基因蛋白表达等指标评价其疗效并研究其作用机制，为火草在OA治疗中的应用奠定基础。

2. 材料

2.1. 实验动物

SPF级成年雄性SD大鼠60只，体重(220 ± 10) g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(湘)2019-0014。饲养环境光照充足，通风良好，实验室环境26℃，相对湿度50%~70%，每日定时为大鼠补充饮用水及饲料，按时更换垫料，实验室按常规定期消毒，进行为期7天的适应性饲养后进行下一步的试验。

2.2. 药品与试剂

火草药材于凉山彝族自治州采集(经西南民族大学张志锋教授鉴定)；木瓜蛋白酶(批号：716M022，索菜宝科技有限公司)；L-半胱氨酸(批号：820N0219，索莱宝科技有限公司)；苏木素染液(批号：C200301，珠海贝索生物技术有限公司)；伊红染液(批号：C200403，珠海贝索生物技术有限公司)；二甲苯(AR级) (批号：20200110，天津市致远化学试剂有限公司)；50×TAE (批号：20220920，北京索莱宝科技有限公司)；Ultrapure RNA Kit (批号：18721，康为世纪公司生产)；绿色荧光核酸染料(批号：20221020，北京索莱宝科技有限公司)；多聚甲醛(批号：71050900，Biosharp生物公司)；水合氯醛(批号：Q/12HB4218-2017，天津市科密欧化学试剂)；IL-1β测定试剂盒(批号：R221014-007b，欣博盛生物科技有限公司)；TNF-α测定试剂盒(批号：R221014-102b，欣博盛生物科技有限公司)。

2.3. 试验仪器

PPT-A+100型电子天平(美国康州HZ电子科技有限公司)；RM2235型轮转式切片机(德国徕卡仪器公司)；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)；DM500型正置荧光显微镜(德国徕卡仪器公司)；BMJ-A型包埋机(常州郊区中威电子仪器厂)；DEM-3型自动洗板机(北京托普)；EL10A型自动酶标仪(BIOBASE)；QuantStudio 1型实时荧光定量(qRT-PCR)仪(Applied Biosystems)；C2500型低温离心机(湖南湘仪实验仪器厂)；4600SF型凝胶成像仪(上海天能科技有限公司)。

3. 试验方法

3.1. 火草浸膏制备

采用渗漉法对火草进行提取，溶剂为药物八倍量70%乙醇，取火草粉末10 g (过六号筛)，将粉末装成药芯，溶剂浸渍24 h，渗漉，回收溶剂，浓缩，制成稠膏，以70%乙醇复溶，静置，滤过，加甘油适量，即得，于−20摄氏度冰箱冷藏备用。火草浸膏低剂量组给药剂量为1.2 g生药/kg，火草浸膏中剂量组给药2.4 g生药/kg，火草浸膏高剂量组给予4.8 g生药/kg。

3.2. 实验动物的分组与造模

选取健康SPF级SD大鼠雄性60只，分为空白对照组、模型对照组、阳性药物组、火草低、中、高剂量组，一共6组，每组10只。除空白组外各组分别于第1、3、7天注射0.2 mL 6%木瓜蛋白酶溶液(含有0.09 mol/L的L-半胱氨酸)进行造模，空白对照组注射0.2 Ml 0.9%氯化钠注射液，注射部位为大鼠膝关节，两周后观察造模情况。

3.3. 实验动物给药

造模成功后，空白对照组和模型组给予70%乙醇(含5%甘油)，阳性对照组给予扶他林乳膏3.0 g/kg，火草等低、中、高剂量组分别给予1.2 g生药/kg、2.4 g生药/kg、4.8 g生药/kg，每日一次，膝关节用药棉、绷带持续固定6 h，连续给药四周。

3.4. 实验动物取材

大鼠禁食24 h后麻醉，以腹主动脉方式取血，以3500 r/min低温离心15 min，吸取上清液于无菌EP管中，−80℃冰箱保存。将膝关节上下0.5 cm处剪断，取下膝关节，将膝关节部分用4%多聚甲醛浸泡固定，打开关节腔，分离滑膜组织，置于无菌EP管中，保存于−80℃冰箱。

3.5. 一般指标

对大鼠造模及给药前后的精神、反应、活动情况、食欲及膝关节部分的温度与肤色等情况观察记录，并对造模后大鼠膝关节的肤色、温度及肿大情况等进行观察记录。

3.6. HE染色检测软骨组织病理组织学改变

完整分离大鼠膝关节软骨组织于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h，依次进行不同浓度的乙醇脱水，并用二甲苯透明，然后放入石蜡中包埋进行固定、切片、脱蜡，染色后于显微镜下观察。

3.7. ELISA法检测滑膜组织中炎症因子含量

取冻存滑膜样本加入PBS，将样本置于匀浆器内充分研磨，4℃条件下，2000 r/min离心20 min (离心半径6 cm)，收集上清液按照试剂盒说明书分别检测滑膜中肿瘤坏死因子-α (Tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β (Interleukin-1β，IL-1β)含量｡

3.8. qRT-PCR检测膝关节软骨组织MMP13、SOX-9 mRNA的表达

取适量新鲜组织加入TRIzon Reagent，用匀浆仪进行匀浆处理。采用TRIzon法提取总RNA，−80℃保存RNA，防止降解。将RNA逆转录为cDCA，以cDCA为魔板进行real-time PCR扩增，反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，循环45次。引物设计，通过美国NCBI (National Biology Technology Information Center, NCBI)的数据库检索该基因的全部序列，并利用普里默(Primer Premier)引物设计软件，对每个基因的特异引物进行选择。将所用的引物按照生工生物工程(上海)有限责任公司的要求进行了设计和制备，采用PAGE技术进行了提纯，得到了表1中的引物顺序，产物大小均小于300 bp，引物设计合理可行。利用Thermo Scientific PikoReal软件(Thermo公司)对PCR处理中每个测试样品的CT (Threshold cycle)值进行。采用2^−ΔΔCT法，计算各样品中的mRNA表达量。

Table 1. Primer sequences and product sizes used for this test

表1. 本次检测所用引物序列及产物大小

3.9. 统计分析

采用SPSS25.0统计软件进行统计，以 $\bar{x}\pm s$ 表示，两组间比较经方差齐性检验后，单因素方差进行统计学处理，以P < 0.05或P < 0.01为差异有统计学意义。

4. 结果

4.1. 观察指标

空白组大鼠皮毛顺亮，精神状态良好，活动自如，饮食正常，体重明显增加，膝关节部位无肿胀；模型组皮毛较暗淡，精神状态较差，活动量较少，体重增加较慢，膝关节红肿较严重；各给药组大鼠精神状态随着治疗逐渐变好，皮毛变顺滑，饮食逐步增加，膝关节红肿程度逐步减轻，活动量之间增加。

4.2. 火草对OA大鼠病理切片变化的影响

为了解火草治疗对OA大鼠的膝关节组织的影响，对其病理切片进行观察，结果如图1所示。空白

注：a-f 100×，A-F 200×，aA：空白对照组，bB：模型组，cC：阳性药物组，dD：火草低剂量组，eE：火草中剂量组，fF：火草高剂量组。

Figure 1. HE staining to observe the knee joint lesions in each group of rats (Fibrohyperplasia: →)

图1. HE染色观察各组大鼠膝关节病变情况(纤维增生：→)

组可见大鼠膝关节囊没有明显病变，没有明显的组织增生和炎症细胞浸润；模型组大鼠膝关节表面透明软骨有明显纤维组织增生，炎性细胞出现浸润；阳性给药组膝关节表面透明软骨被部分破坏，纤维组织增生致关节大部分区域纤维化，见炎性细胞浸润；火草低剂量组大鼠膝关节表面透明软骨见明显纤维组织增生，炎性细胞产生浸润，火草中剂量组大鼠膝关节表面被覆薄层透明软骨，未见明显组织增生，火草高剂量组大鼠关节表面透明软骨被破坏，纤维组织增生致关节大部分区域纤维化，见大量炎细胞浸润。

4.3. 大鼠滑膜组织中TNF-α、IL-1β的含量

为了解火草治疗对OA大鼠滑膜组织中炎症因子的影响，对TNF-α、IL-1β进行了检测，结果如图2所示。与空白组相比，模型组的TNF-α、IL-1β含量均升高，差异具有统计学意义(P < 0.01)；火草不同剂量及阳性药物治疗组与模型组相比，TNF-α、IL-1β含量水平均明显下降，其中除火草中剂量组的IL-1β因子水平外，其余差异均具有统计学意义(P < 0.05)，且在火草治疗组中，低剂量组TNF-α、IL-1β含量水平下降最明显。

注：Control.空白对照组；Model.模型组；Positive.阳性给药组；H1-H3.火草低、中、高剂量组与空白组比较，^*P < 0.05，^**P < 0.01；与模型组比较，^#P < 0.05，^##P < 0.01；与阳性药组比较，^☆P < 0.05，^☆☆P < 0.01。

Figure 2. TNF-α and IL-1β levels in the synovial tissue of rats in each group

图2. 各组大鼠滑膜组织中TNF-α、IL-1β水平

4.4. 大鼠膝关节软骨组织中SOX-9、MMP13 mRNA的表达量

为了解火草治疗对OA大鼠关节软骨组织中SOX-9、MMP13 mRNA的表达量影响，对其进行了检测，结果如图3所示。与空白组相比，模型组的SOX-9表达量显著下降，MMP13的表达量显著升高，结果具有统计学意义(P < 0.05)；与模型组相比，阳性药物组与火草不同剂量组的MMP13表达量均显著下降，结果具有统计学意义(P < 0.01)，SOX-9表达量均上升，但只有火草高剂量组具有显著性差异。

5. 讨论

OA作为一种炎性病变，许多炎症细胞因子在它的发生中有着至关重要的地位，IL-1β和TNF-α是两种驱动软骨降解的细胞因子，可导致软骨细胞发生过氧化反应，加大对骨、软骨的破坏 [11] 。炎症因子与相关受体结合后，可激活NF-κB信号通路，在关节炎、自身免疫性疾病、肿瘤等多种病变中均存在NF-κB通路功能失调的现象 [12] 。NF-κB信号通路也可调控炎症因子的表达，并诱导基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)基因的活性上调，MMPs的表达在关节软骨的代谢方面起着决定性作用，其中MMP13是胶原降解过程中的主要酶，在OA病变过程是至关重要的因素。此外，SOX-9基因是软骨细胞分化、增殖过程中的关键性转录因子 [13] ，在维持软骨的细胞外基质和软骨细胞表型方面有着重要作用，而OA的发生往往伴随着软骨组织被破坏。本研究我们发现火草可在一定程度上可降低OA大鼠滑膜组织中TNF-α、IL-1β的含量水平，并抑制软骨组织中MMP13的基因表达、增强SOX-9的基因表达，对于OA的治疗有着一定的影响。

注：Control.空白对照组；Model.模型组；Positive.阳性给药组；H1-H3.火草低、中、高剂量组与空白组比较，^*P < 0.05，^**P < 0.01；与模型组比较，^#P < 0.05，^##P < 0.01。

Figure 3. Relative expression content of Sox-9 and MMP13 in the synovial tissue of rats in each group

图3. 各组大鼠滑膜组织中Sox-9、MMP13相对表达含量

彝医火草灸采用了灸法，与中医传统技法艾灸有着异曲同工之处，各类灸法在关节炎的治疗中表现出良好的抗炎、修复关节滑膜、保护软骨等作用 [14] [15] [16] ，且在临床上已有证实 [17] [18] [19] 。火草的有效成分主要为绿原酸、异绿原酸A及异绿原酸B [20] ，有着抗炎的药理作用 [21] [22] 。彝医火草灸结合了灸法的温热效应，可能提高了有效成分的透皮吸收 [23] ，从而增强了抗炎的作用，达到缓解关节疼痛、减轻关节炎症的效果。有研究表明，火草灸在膝骨关节炎 [24] 、肩周炎 [25] 等关节炎上表现出良好的疗效，此外，还可用于原发性痛经等的治疗 [26] 。彝医所使用的火草基源混杂，是一种多基源药材，本研究中仅选用了火草的一种基源物种——坚杆火绒草，对该物种在OA上的作用进行研究论证，后续还会对其他基源火草进行研究，以期为火草的疗法规范奠定基础。

6. 结论

外用火草药物可明显缓解OA的病症，抑制骨关节软骨细胞的破坏，并对软骨细胞有一定的修复作用，其作用机制可能与通过调节NF-κB通路降低关节软骨组织中MMP13基因的表达、IL-1β、TNF-α的含量，同时增强SOX-9基因的表达有关，为火草的进一步研究与开发提供了参考依据和基础。

基金项目

贵州省科技计划项目(黔科合后补助[2020]3003)；贵州中医药大学科研创新和探索专项(2019YFC171250102)。

NOTES

^*通讯作者。