微小RNA在糖尿病视网膜病变的机制研究进展

Research Progress on the Mechanism of miRNA in Diabetes Retinopathy

摘要: 近些年，我国的糖尿病患者人数逐年增加，糖尿病视网膜病变(DR)成为患有糖尿病的主要眼部并发症，其致病机制复杂。新出现的很多证据表明，微小RNA (miRNA)具有多种细胞和生物学功能，在DR病程中，发挥了极其重要作用。本文通过阅读微小RNA在DR发生、发展中的相关文献，通过整理、探索miRNA在DR发生、发展中的作用机制，为miRNA在DR的应用提供实际依据。

Abstract: In recent years, the number of diabetes patients in China has increased year by year. Diabetes reti-nopathy (DR) has become the main ocular complication of diabetes, and its pathogenesis is complex. Much emerging evidence suggests that miRNA has multiple cellular and biological functions and plays an extremely important role in the pathogenesis of DR. This article provides practical basis for the application of miRNA in DR by reading relevant literature on the occurrence and development of DR, by organizing and exploring the mechanism of miRNA in the occurrence and development of DR.

1. 引言

DR是患有糖尿病微血管眼部的并发症之一，在调控新生血管生成、血管内皮细胞增生、炎性反应、细胞凋亡等在DR发生、发展中发挥了重要作用。miRNA是由大约22个核苷酸所组成的非编码RNA，不能直接翻译蛋白。

2. 微小RNA表达在糖尿病视网膜病变中的作用

在糖尿病病人中，DR是一种常见的眼部并发症，是成年人视力下降甚至变盲的主要致病原因 [1] ，我国普通人群患有视网膜病变概率为1.14%，而糖尿病人DR患病率高达18.45%，使患者生活质量严重降低 [2] 。在患病前一阶段，患者本身一般无明显不适症状，当黄斑区受累后就会表现为不同程度的视力下降，最终有失明的风险 [3] 。高血糖环境的长期慢性损害和慢性炎症反应导致DR发生，造成了视网膜血管新生，神经元凋亡，血–视网膜屏障破坏 [4] 。根据研究，miRNA在人类中有1000多种，miRNA靶向调控人类蛋白质编码基因的60%，故这些小分子可以对众多蛋白质的功能产生深远的影响。大约20年前发现miRNA，但对于我们理解转录后水平基因调控产生了巨大影响，许多研究已经证明了miRNA在细胞功能(如分化、生长、增殖和凋亡)中的作用。由于miRNA可以调节关键的生理过程和病理生理疾病状态，因此迫切需要确定miRNA的身份及其与糖尿病视网膜病变相关的靶标，因为其可以辨别从没出现过的生物标志物，并且为治疗靶标提供机会 [5] 。

3. 微小RNA

3.1. 微小RNA生理特征

miRNA是由22个核苷酸序列组成的非编码RNA，不具有直接翻译蛋白的功能，是一类新型的调控基因表达的因子 [6] 。一个miRNA可调控多个mRNA的表达，而且有多于60% mRNA含有多个miRNA结合位点，能够同时与多个miRNA发生交互反应。miRNA主要特征为：广泛分布、高度保守、时序特异性表达、组织特异性表达和特异性结构。通过与下游靶基因(3’端)的结合，或由互补配对方式去抑制mRNA，在转录后水平控制目的基因表达 [4] 。

3.2. 微小RNA作用

miRNA自1993年在线虫体内首次被发现后，研究者对它进行了更深入的研究，同时也证实在细胞的生长发育、细胞增殖、凋亡及生物的代谢等各个方面miRNA均有作用。miRNA作为生物学参考指标，能够显示某种疾病的发生、发展过程，并且可被有效检测出来的客观指标。它能高度监测经过高血糖诱导后的糖尿病视网膜病变的动物模型，更准确表现疾病病变阶段过程，对于诊断、治疗糖尿病视网膜病变以及对预后的判断具有重大的意义。在糖尿病大鼠与正常大鼠经对比检测视网膜组织的miRNA，检测结果显示共有86种miRNA在糖尿病大鼠视网膜中有明显的差异性表达，这与视网膜疾病的发生关系密切。此外也证明经VEGF诱导的6种miRNA在DR的大鼠视网膜血管内皮细胞(retinal endothelial cells, REC)过表达，表明miRNA可能通过提高VEGF表达参与DR发生的病理过程。miRNA通过抑制特异性转录、翻译或促进mRNA的降解 [7] ，进一步调节细胞的生长发育、增殖凋亡等各个过程 [8] [9] 。

4. 微小RNA与糖尿病视网膜病变

近几年在研究中发现，DR患者中有许多miRNA异常表达，miRNA可破坏足细胞，导致足细胞增殖凋亡 [10] [11] 。黄明蕾 [12] 等研究表明，患有肿瘤疾病及后期肿瘤进一步扩散的过程中，miRNA也是不可忽视的一环，存在肿瘤的发生及发展各个过程中 [13] ，因此可能成为诊断和治疗肿瘤的新型参考标志物。已有研究报道，在食管癌 [14] 、肝癌 [15] 、甲状腺癌 [16] 等癌细胞的增殖和凋亡过程中miRNA发挥了重要的调控作用，但是关于其在DR中的作用机制仍未完全明确 [7] 。有证据表明miRNA是糖尿病重要的调节者和参与者，视网膜血管新生 [17] 、炎症反应、核转录因子、氧化应激、胰岛素抵抗、胰岛素敏感性的降低等过程，miRNA均参与其中。

4.1. 微小RNA与VEGF的关系

视网膜新生血管形成、血管通透性增强是DR发生的重要机制。血管内皮生长因子(VEGF)在DR病理变化中发挥着关键性的作用 [18] ，如果此因子水平升高，就能够促进血管的生成 [19] ，同时还导致血管壁的通透性增加。当VEGF结合相应的细胞表面受体后，能够提高细胞内很多信号通路活性，最后导致血管新生。

有多项研究验证miRNA的亚型基因miR-29、miR-31、miR-126和miR-200b等通过初期Notch和Hedgehog信号通路，在某种程度上与DR新生血管的生成有关，黄俊 [20] 等研究证明，VEGF可由miR-200b靶向调控其表达，miR-31可通过影响Spred-1和PIK3R2/p85-b信号通路来调控视网膜新生血管生成。而DR主要是以微血管病变和视网膜新生血管为特点，陈云霞 [21] 等研究表明，miR-27高表达可加快DR血管新生，诱导VEGF表达，加快细胞分化、增殖，加重血管炎症反应，导致DR微血管损伤。在经过高糖诱导的糖尿病模型大鼠的视网膜组织中MiR-199-3p含量明显下降，VEGFA和miR-199-3p具有靶向关系。

最近，在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中发现miR-16的过表达在血管生成中起到了显著的抑制作用，同时链脲佐菌素经由葡萄糖转运蛋白进入细胞，对β细胞产生细胞毒性作用，β细胞是由胰腺分泌的胰岛素诱导产生，miR-16在诱导的糖尿病大鼠视网膜色素内皮细胞(REC)的表达也显著升高 [22] 。陈治谕 [23] 等在糖尿病大鼠视网膜色素内皮细胞体外培养的实验中发现，经ERK和Akt信号通路的高度表达，miR-21可很大程度上增加DR大鼠视网膜色素内皮细胞的存活力、导致血管新生。miRNA可能靶向特定分子以保护DR中的视网膜微血管内皮细胞，其靶点是VEGF，miR-29b-3p可以负向调节VEGFA表达水平，通过细胞周期相关蛋白降低阻碍细胞周期进程，从而防止RMEC的异常增殖。既往研究也发现miR-29b-3p可下调SIRT1促进RMEC凋亡。然而，潘 [24] 等人发现SIRT1可以正向调节miR-20a的表达，使miR-20a诱导YAP/HIF1α下调VEGF活性，阻碍HG状态下RMECs的异常增殖，提示SIRTI的恢复可能保护HG状态下的RMECs。陈治谕 [25] 等研究证实，在DR患者血清中miR-1243含量显著升高，其下游的血管动蛋白(angiomotin, AMOT) mRNA可与miR-1243直接结合，AMOT导致色素内皮细胞的管形成，从而加快血管新生。周永红 [26] 等研究证实，在Aldo-MR通路中，miRNA-181a与VEGF关系密切，血清miRNA-181a水平降低与VEGF水平提高预警了糖尿病患者出现视神经病变。

李瑞 [27] 等研究表明，miR-126可以通过调节靶基因VEGF的翻译导致血管新生，是在血管内皮细胞中唯一特异性表达的miRNA [28] ，万石峰 [29] 等研究证实，高度表达的miR-126可通过下调其靶基因IRS-1的表达水平从而下调VEGF、PI3K、AKT等通路蛋白的表达水平，且抑制视网膜EC细胞和RP细胞的增殖能力及侵袭能力。miRNA能影响DR微血管的稳定性以及血管内皮细胞的萌芽和迁移，且其基因水平的高低与VEGF的表达呈明显负相关 [26] 。张红等研究发现，miR-126在采用激光光凝法诱导C57BL/6小鼠脉络膜新生血管CNV中，miR-126对人微血管内皮细胞(HMECs)的过表达作用也被证实，miR-126在CNV小鼠中显著降低。在CNV模型中VEGF-A的表达水平提高，是通过miR-126的恢复得到了改善，在转染miR-126后CNV明显降低，转染的miR-126降低了HMECs 2d毛细血管的形成以及迁移，证明miR-126是眼部血管生成的负调控因子，miR-126有较高治疗潜力，提示了它可以作为一个治疗人类AMD的靶点 [30] 。眼部血管生成的负调控因子还有miRNA-let-7c、miR-15b。欧玉仑 [31] 等研究证实DR大鼠VEGFA蛋白含量明显增加，经过提高miRNA-let-7c表达或者降低STAT3表达，可以降低其含量，证实了miRNA-let-7c极有可能是经由STAT3通路负反馈作用于其下游的靶基因VEGFA。刘有娅 [32] 等研究发现，在PDR患者的视网膜增值膜中，miR-15b参与了血管新生，吴心池 [33] 等研究发现，在VEGF信号通路上miR-19a显著集中分布，其与DR密切相关。

4.2. 微小RNA与核转录因子的关系

核转录因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB)在REC增殖和表达若干类型的炎症方面，起着调控中心作用，也与DR的形成、发现密切相关。顾顺 [34] 等研究表明miR-146a调控了NF-κB炎症通路，miR-146a能够通过抑制NF-κB磷酸化水平和细胞间黏附分子-1 (ICAM-1)的表达，减轻DR的炎症反应。相关实验表明，对DM小鼠的REC具备诱导作用的miR-146、miR-21、miR-132以及miR-155有不断提高的表现，活化了REC-NF-κB途径，加快提升下游基因MCF-1以及黏附因子-1的转录，进一步激发视网膜炎性反应。研究发现miR-146a在高糖培养的HREC中含量下降，而高表达miR-146a能使TLR4/NF-κB和TNF-α下调，表明在DR炎症机制中miR-146a抑制了NF-κB活化，miR-146a在T1DM大鼠模型中REC的表达下降，纤维黏连蛋白(FN)则表达上调，导致视网膜微血管内皮细胞损伤、迁移，引起DR的相关病理改变。王素贞 [35] 实验研究发现通过上调miR-146a，抑制IL-1R/TLR和GPCR介导的NF-κB信号通路，及靶向下调IL-6/STAT3/VEGF信号通路在糖尿病大鼠视网膜组织中发挥抗炎作用。

4.3. 微小RNA与炎症因子的关系

目前对视网膜miRNA与炎性反应的相关性研究比较少 [36] ，在高糖环境中培养的人视网膜上皮细胞-19 (ARPE-19)，经检测后发现miR-646高表达，在使用miR-646抑制剂后，经EGFR/AKT途径导致ARPE-19凋亡显著增加 [25] ，造成炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β高表达 [24] 。DR患者的miRNA-873高度表达 [37] ，贾蒙岚等研究发现，miRNA-873通过其靶基因HDGF，不仅可以抑制细胞增殖、造成细胞凋亡，而且可以炎症免疫反应中发挥作用。在DR大鼠的视网膜中发现NF-κB-靶基因miRNA：miR-146a/B、miR-155、miR-132和miR-21的表达上调，因此NF-κB可以作为DR的生物学标志。

4.4. 微小RNA与视神经的关系

DR神经受损改变主要有两种：1) 神经元的凋亡；2) 神经胶质细胞的反应性增生。在DR中，如果活化p53会提高miR-34家族(miRNA-34a/b/c)的含量表明，miR-34家族与由p53导致的REC凋亡具有相关性。当敲除老鼠的miRNA-34基因后能成功阻滞由p53诱导细胞凋亡，表明在p53调控过程中miRNA-34发挥着重要作用。也有研究表明miRNA-34c在糖尿病大鼠视网膜组织和视网膜色素内皮细胞中有明显升高，同时在DR中发现有活化的p53，由此认为由miRNA-34的家族成员导致的p53诱导细胞凋亡与神经退行性变参与DR的发生、发展。miRNA-29b经调控转录因子特异蛋白1 (Specificity protein 1, SP1)的表达来调节DR早期视网膜muller细胞(retinal muller cells, RMCs)凋亡 [38] 。

4.5. 微小RNA与胰岛素抵抗的关系

糖尿病主要是由胰岛素生成缺陷或者机体对胰岛素抵抗导致 [39] ，miRNA抑制靶基因表达来调控信号通路，在糖尿病病程及其并发症中发挥重要作用。在胰岛素合成过程中和胰岛细胞释放过程中miR-375和miR-9发挥着重要作用；miR-103，miR-107，miR-143，miR-144和miR-145也经过调控胰岛素受体通路的若干步骤以调节骨骼肌细胞与肝脏细胞的外周胰岛素敏感性。MiR-15b-5p及其靶基因参与了胰岛素信号通，表达的上调参与DR过程 [40] 。

4.6. 微小RNA与氧化应激

在糖尿病视网膜病变过程氧化应激(Oxidative Stress, OS)是不可或缺的一环，氧化应激是指在机体遇到不利刺激时，产生自由基与抗氧化之间平衡被打乱，导致组织细胞受损。自由基生成与降解不平衡会提高活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的含量，从而促进氧化应激水平升高。席晓婷实验研究表明，在STZ诱导的DR小鼠模型视网膜组织中miR-130a表达显著下调，TNF-α和SOD1表达显著上调，且过表达miR-130a可显著抑制DR模型中氧化应激和细胞焦亡 [41] 。有21个miRNA的33个靶基因(包括miR-4267)参与了凋亡的信号通路过程 [42] 。

综上所述：miRNA在糖尿病进程中是重要的参与者和调控者，许多表达异常的miRNA存在DR中患者的外周血血清、视网膜细胞中，在DR发展过程中具有显著的作用 [43] 。慢慢深入广泛研究miRNA在DR发生发展过程中的作用机制，未来能证明更多的miRNA存在及miRNA对DR的调控机制，目前来说，在DR作用机制中对miRNA分子机制研究尚无明确定论。在研究中发现一个新的脂肪因子，视黄醇结合蛋白4，在AG4KO小鼠中RBP4有利于建立胰岛素耐受。脂肪细胞分泌RBP4，当血糖浓度下降时，可向其它细胞传递信号。在DR过程中，深入研究miRNA的分子作用机制，miRNA有望成为一个生物学指标，早期预警、诊断及干预DR，且能为DR新的靶基因治疗提供新的理论依据。所以在这里想问个问题，就是RBP4增多会不会抗胰岛素作用更强？

NOTES

^*通讯作者。