1. 引言
腰椎间盘突出症(lumbar intervertebral disc protrusion, LIDP)简称腰突症，为临床常见病 [1] 。古代虽无“腰椎间盘突出症”这一病名，但早有类似的症状描述，《医学心悟》指出：“腰痛拘急，牵引腿足”，当属“腰痛”“腰腿痛”“痹症”等范畴。《素问·脉要精微论》曰：“腰者肾之府，转摇不能，肾将惫矣” [2] 。强药舒络散是由腰痹通胶囊与当归补血汤加减而来，且临床研究表明腰痹通胶囊可以通过促进炎症反应吸收而起到缓解LIDP患者腰部疼痛、恢复肢体功能等功效 [3] [4] [5] 。临床研究表明当归补血汤合肾四味加减可通过补益肝肾气血，以化瘀通络止痛，进而达到缓解LIDP患者疼痛及功能受限等症状 [6] 。具有活血化瘀，通经止痛，清热利尿，补气固表之功。本方由黄芪、三七、牛膝、川芎、当归、白芍、狗脊、防己、醋延胡索、泽兰、车前子组成。为了保证药品质量，并在临床中安全的应用与推广，因此对强腰舒络散进行质量标准研究。
本研究参考《中国药典》2020年版，通过TLC法对方中的黄芪、川芎、当归、白芍、泽兰、防己、延胡索进行定性鉴别，并对当归、川芎、白芍、黄芪、车前子5味药材中的4个特征成分，即阿魏酸、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷进行HPLC含量测定，为强腰舒络散质量标准提供参考依据。
2. 仪器与试药
Waters e2695型高效液相色谱仪(美国)；配2998PDADetector型蒸发光散射检测器(美国)；JE502型电子天平(上海蒲春)；SYG-A1-6型电子恒温水浴锅(天津泰斯特)；MS105DU型电子分析天平(梅特勒–托利多)；DZF-6050真空干燥箱(上海恒科技)；YJY-1823-06型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；WFH-203C四用紫外分析仪(上海驰唐)。阿魏酸标准品(中检所，批号：110773-201915)；当归对照药材(批号：120927-202118)、川芎对照药材(批号：120918-201813)、泽兰对照药材(批号：121081-201807)、白芍对照药材(批号：120905-202011)、莪术对照药材(批号：121628-201702)、防己对照药材(批号：121279-202113)、延胡索对照药材(批号：120928-201702)、芍药苷(批号：110736-201943；纯度 ≥ 95.1%)、阿魏酸(批号：110773-201915；纯度 ≥ 98.0%)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号：111920-201907；纯度 ≥ 96.8%)、毛蕊花糖苷(批号：111530-201914；纯度 ≥ 95.2%)、以上均购自中国食品药品检定研究院；水为纯化水；乙腈为色谱纯。强腰舒络散(批号：220401，220402，220403)及各单味药材均由河北全泰药业有限公司提供。
3. 方法与结果
3.1. TLC鉴别
3.1.1. 当归的TLC鉴别
称取强腰舒络散粉末6 g，加入乙醚40 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，将残渣加乙酸乙酯 1 mL，使其完全溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材0.5 g，按照相同的方法制备出三种不同的对照溶液：对照药材溶液，缺当归阴性对照溶液及缺当归与川芎的双阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，分别吸取对照药材溶液、供试品溶液(强腰舒络散批号依次为：230401、230402、230403)、阴性对照溶液和双阴性对照溶液各2 µL，在同一硅胶G薄层板上以展开系统为正己烷–乙酸乙酯(9:1)展开，取出并晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。在供试品色谱中，与对照药材色谱相比，在相同位置显示出蓝色荧光斑点，这些斑点的分离度极高，且双阴性检测没有任何干扰。结果如图1所示。
1. 对照药材(reference medicinal material)；2~4. 供试品(1, 2, 3) [sample (1, 2, 3)]；5. 阴性样品(negative sample)；6. 双阴性样品(Double-negative sample)。
Figure 1. TLC chromatogram of Angelica sinensis radix
图1. 当归TLC图
3.1.2. 川芎的TLC鉴别
称取强腰舒络散粉末6 g，加入乙醚40 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，将残渣加乙酸乙酯1 mL，使其完全溶解，作为供试品溶液。另取川芎对照药材0.5 g，按照相同的方法制备出两种不同的对照溶液：缺川芎阴性对照溶液及缺川芎与当归的双阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，分别吸取对照药材溶液、供试品溶液(强腰舒络散批号依次为：220401、220402、220403)、阴性对照溶液和双阴性对照溶液各2 µL，在同一硅胶G薄层板上以展开系统为正己烷–乙酸乙酯(9:1)展开，取出并晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。在供试品色谱中，与对照药材色谱相比，在相同位置显示出蓝色荧光斑点，这些斑点的分离度极高，且双阴性检测没有任何干扰。结果如图2所示。
1. 对照药材(reference medicinal material)；2~4. 供试品(1, 2, 3) [sample (1, 2, 3)]；5. 阴性样品(negative sample)；6. 双阴性样品(Double-negative sample)。
Figure 2. TLC chromatogram of chuanxiong rhizoma
图2. 川芎TLC图
3.1.3. 泽兰的TLC鉴别
称取强腰舒络散粉末6 g，加入丙酮40 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，将残渣加石油醚(30℃~60℃) 10 mL，浸泡2 min，弃去石油醚液，蒸干，将残渣加无水乙醇0.5 mL，使其完全溶解，作为供试品溶液。另取泽兰对照药材1 g，按照相同的方法制备出两种不同的对照溶液：对照药材溶液及缺泽兰的阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，分别吸取对照药材溶液、供试品溶液(强腰舒络散批号依次为：220401、220402、220403)和阴性对照溶液各3 µL，在同一硅胶G薄层板上以展开系统为环已烷–三氯甲烷–乙酸乙酯–甲酸(20:5:8:0.1)展开，取出并晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。在供试品色谱中，与对照药材色谱相比，在相同位置显示出蓝色斑点，这些斑点的分离度极高，且阴性检测没有任何干扰。结果如图3所示。
1. 对照药材(reference medicinal material)；2~4. 供试品(1, 2, 3) [sample (1, 2, 3)]；5. 阴性样品(negative sample)。
Figure 3. TLC chromatogram of lycopi herba
图3. 泽兰TLC图
3.1.4. 防己的TLC鉴别
称取强腰舒络散粉末4 g，加入乙醇30 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，将残渣加乙醇1 mL，使其完全溶解，作为供试品溶液。另取防己对照药材0.2 g，按照相同的方法制备出两种不同的对照溶液：对照药材溶液及缺防己的阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，分别吸取对照药材溶液、供试品溶液(强腰舒络散批号依次为：220401、220402、220403)和阴性对照溶液各 3 µL，在同一硅胶G薄层板上以展开系统为三氯甲烷–丙酮–甲醇–5%浓氨试液(6:1:1:0.1)展开，取出并晾干，喷以稀碘化铋钾试液。在供试品色谱中，与对照药材色谱相比，在相同位置显示出红色斑点，这些斑点的分离度极高，且阴性检测没有任何干扰。结果如图4所示。
1. 对照药材(reference medicinal material)；2~4. 供试品(1, 2, 3) [sample (1, 2, 3)]；5. 阴性样品(negative sample)。
Figure 4. TLC chromatogram of Stephania tetrandra radix
图4. 防己TLC图
3.1.5. 白芍的TLC鉴别
称取强腰舒络散粉末8.5 g，加入乙醚40 mL，超声处理10 min，滤过，药渣挥干后加乙酸乙酯30 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，将残渣加甲醇1 mL，使其完全溶解，作为供试品溶液。另取白芍对照药材1 g，按照相同的方法制备出两种不同的对照溶液：对照药材溶液及缺白芍的阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，分别吸取对照药材溶液、供试品溶液(强腰舒络散批号依次为：220401、220402、220403)和阴性对照溶液各5 µL，在同一硅胶G薄层板上以展开系统为乙酸乙酯–丙酮–甲酸–水(10:6:2:0.5)展开，取出并晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点清晰。在供试品色谱中，与对照药材色谱相比，在相同位置显示出蓝色斑点，这些斑点的分离度极高，且阴性检测没有任何干扰。结果如图5所示。
3.1.6. 延胡索的TLC鉴别
称取强腰舒络散粉末9.6 g，加入氨水50 ml，拌匀，加乙醚40 mL，超声20 min，滤过，滤液蒸干。将残渣加甲醇1 mL，使其完全溶解，作为供试品溶液。另取延胡索对照药材0.5 g，按照相同的方法制备出两种不同的对照溶液：对照药材溶液及缺延胡索的阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，分别吸取对照药材溶液、供试品溶液(强腰舒络散批号依次为：220401、220402、220403)和阴性对照溶液各5 µL，在同一硅胶G薄层板上以展开系统为正已烷–三氯甲烷–甲醇(7.5:4:1)展开，取出并晾干，置碘缸中至斑点清晰，取出，挥尽硅胶板上的碘后，置紫外灯(365 nm)下检视。在供试品色
1. 对照药材(reference medicinal material)；2~4. 供试品(1, 2, 3) [sample (1, 2, 3)]；5. 阴性样品(negative sample)。
Figure 5. TLC chromatogram of paeoniae radix alba
图5. 白芍TLC图
谱中，与对照药材色谱相比，在相同位置显示出黄色斑点，这些斑点的分离度极高，且阴性检测没有任何干扰。结果如图6所示。
1. 对照药材(reference medicinal material)；2~4. 供试品(1, 2, 3) [sample (1, 2, 3)]；5. 阴性样品(negative sample)。
Figure 6. TLC chromatogram of Corydalis rhizoma
图6. 延胡索TLC图
3.1.7. 黄芪的TLC鉴别
称取强腰舒络散粉末3 g，加入甲醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，将残渣加水20 mL，使其完全溶解，用水饱和正丁醇溶液20 mL洗涤2次，合并水饱和正丁醇溶液，用氨水20 mL洗涤2次，再用正丁醇饱和水20 mL洗涤2次，弃去洗涤液，正丁醇液蒸干，将残渣加甲醇1 mL，使其完全溶解，作为供试品溶液。同法制成缺黄芪的阴性对照溶液。另取黄芪甲苷1 mg，精密加入甲醇1 mL使其完全溶解，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，分别吸取对照品溶液、供试品溶液(强腰舒络散批号依次为：220401、220402、220403)和阴性对照溶液各3 uL，在同一硅胶G薄层板上以展开系统为三氯甲烷–乙酸乙酯–甲醇–水(10:20:11:5)的下层溶液展开，取出并晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰，分别置于日光和紫外光灯(365 nm)下检视。在供试品色谱中，与对照药材色谱相比，在相同位置显示出蓝黄色斑点，这些斑点的分离度极高，且阴性检测没有任何干扰。结果如图7所示。
1. 对照药材(reference medicinal material)；2～4. 供试品(1, 2, 3) [sample (1，2，3)]；5. 阴性样品(negative sample)。
Figure 7. TLC chromatogram of astrgali radix
图7. 黄芪TLC图
3.2. 含量测定
3.2.1. 对照品溶液的制备
用电子分析天平精密称定芍药苷对照品6.05 mg、阿魏酸对照品7.11 mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品5.42 mg、毛蕊花糖苷对照品7.57 mg，分别溶于10 mL甲醇中，得到对照品母液；分别吸取对照品母液各适量于同一量瓶中，并用甲醇稀释定容，得到芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷混合对照品溶液，浓度分别为105.89，10.47，40.72，57.55 µg·mL−1。
3.2.2. 供试品溶液的制备
精密称取强腰舒络散粉末5 g，加入甲醇25 mL，置100 ml具塞锥形瓶中，密塞，超声(功率比99%，频率45 kHz) 30 min，放冷，滤过，取上清液即得供试品溶液。
3.2.3. 阴性样品溶液的制备
按照强腰舒络散处方比例精密称取各味药材，按“3.2.2”项下制备供试品溶液方法得到缺当归、川芎、白芍、黄芪、车前子以及缺当归与川芎的阴性样品溶液。
3.2.4. 色谱条件的确定
色谱柱：SwellChromplus®C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm, 5 µm)；流动相为乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)-水(C)，梯度洗脱(0~18 min, 5%→10%A, 85%→80%B; 18~60 min, 10%→10%A, 80%→80%B; 60~80 min, 10%→15%A, 80%→75%B)。柱温为30℃；流速为1 mL·min−1；进样量为10 µl，检测波长为250 nm；强腰舒络散中4个成分分离度均>1.5，分离效果良好，同时阴性无干扰，符合含量测定的要求。结果见图8。
3.2.5. 线性关系考察
按“3.2.1”项下的方法混合对照品溶液，按“3.2.4”项下色谱条件测定峰面积，分别进样4，6，8，10，12，14 µL，以进样量为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，可知各成分在其范围内线性关系良好。结果见表1。
Figure 8. HPLC chromatogram. 1, Paeoniflorin; 2, Calycosin-7-glucosideacid; 3, Stames coside; 4, Stameningly cosides; A, Mixed controls; B, Test product; C, The lack of Angelica sinensis radix negative sample; D, The deficiency chuanxiong rhizoma negative sample; E, The lack of Angelica sinensis radix and chuanxiong rhizome negative sample; F, Deficiency paeoniae radix alba negative sample; G, Astragalus deficiency negative sample; H, Psyllium deficiency negative sample)
图8. HPLC图谱。(1——芍药苷；2——阿魏酸；3——毛蕊异黄酮葡萄糖苷；4——毛蕊花糖苷；A——混合对照品；B——供试品；C——缺当归阴性样品；D——缺川芎阴性样品；E——缺当归与川芎阴性样品；F——缺白芍阴性样品；G——缺黄芪阴性样品；H——缺车前子阴性样品)
Table 1. Standard curve equations with linear ranges
表1. 标准曲线方程与线性范围
3.2.6. 仪器精密度试验
精密吸取“3.2.1”项下对照品溶液，按“3.2.4”项下色谱条件测定峰面积，重复进样6次，芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷成分峰峰面积的RSD值分别为0.87%，2.00%，1.76%，2.30%，均<4.00%，表明仪器日内精密度良好。
3.2.7. 重复性试验
取同一批次强腰舒络散精密称定6份，每份约5 g，按“3.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“3.2.4”项下色谱条件分别进样测定，计算含量及RSD值。芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷的RSD值分别为2.23%，0.37%，0.95%，2.08%，RSD值均<3%，表明方法重复性良好。
3.2.8. 稳定性试验
取强腰舒络散粉末5 g，精密称定，按“3.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取该供试品溶液10 µL，按“3.2.4”项下色谱条件分别在0，2，4，8，12，24 h测定峰面积，记录峰面积并计算其RSD值。芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷的RSD值分别为2.60%，1.87%，2.31%，2.26%，表明供试品在24 h内较为稳定。
3.2.9. 加样回收率试验
取同一批强腰舒络散粉末5 g，精密称定6份，按已知含量的100%水平加入芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷对照品，按“3.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“3.2.4”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算含量和加样回收率。芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷的加样回收率均在 90%~110%，RSD < 3%，结果见表2。
Table 2. Experimental results of recovery rate (n = 6)
表2. 回收率试验结果(n = 6)
3.2.10. 样品含量测定
取强腰舒络散粉末3批，每批平行2次，精密称定6份，按“3.2.2”项下方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液10 µL，按“3.2.4”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算含量，结果见表3。
4. 讨论
4.1. TLC分析
研究采用TLC法 [7] [8] [9] 鉴别强腰舒络散中的黄芪、川芎、当归、白芍、泽兰、醋莪术、防己、醋延胡索8味药材，参照《中国药典》2020年版一部相关药材鉴别方法，通过对鉴别方法、展开系统组成、显色方式等反复试验，最终得到8味药材的鉴别方法分离度高，专属性好，可以纳入强腰舒络散质量控制标准。对于强腰舒络散中狗脊、桑寄生、杜仲和车前子等的薄层鉴别结果，分别出现阴性有干扰、斑点不清晰等问题，故未将其收入质量标准。
4.2. HPLC分析
研究比较了不同流动相比例(乙腈–甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.5%乙酸水溶液、甲醇-0.5%磷酸水溶液、四氢呋喃–甲醇-5 mmol/L枸橼酸水溶液)、检测波长(240, 320, 324, 330 nm) [10] [11] [12] [13] 、柱温(25℃, 30℃, 35℃)、流速(0.3, 0.8, 1.0 mL·min−1)，根据4个成分的峰型、分离度、重现性与干扰峰等确定了最佳色谱条件。在供试品溶液的制备中，反复试验了不同的提取溶剂(乙醇、甲醇、60%乙醇、60%甲醇、70%甲醇)、提取方法(超声、加热回流)、提取时间(15, 30, 45, 60 min)，确定重复性好、专属性强的最佳方法。确定了芍药苷在0.42356~1.48246 µg，阿魏酸在0.04188~0.14658 µg，毛蕊异黄酮葡萄糖苷在0.16288~0.57008 µg，毛蕊花糖苷在0.23020~0.80570 µg，线性关系良好。
5. 结语
本研究在崇尚经典的基本原则下，以发展的角度认识明方和复方制剂的研究。本研究将强腰舒络散采用薄层色谱法，建立了强腰舒络散的定性鉴别和含量测定方法。该方法简单、准确、稳定，为后续强腰舒络散相关制剂的研发以及质量标准研究奠定了基础。采用高效液相色谱法对药材进行精确检测，结果显示线性关系良好，仪器精密度、样品重复性、稳定性与加样回收率的RSD值均符合要求。所建立的方法简便、准确、重复性好，为强腰舒络散的质量标准的制定提供了一定依据。