Coumestan类天然产物合成及其生物活性研究进展

Research Progress on the Synthesis and Biological Activity of Coumestan Natural Products

摘要: Coumestans是一类以四环内酯为核心骨架的天然产物，主要存在于蝶形花科(Papilionaceae)，豆科(Leguminosae)，菊科(Compositae)等植物中，具有广泛的药理作用和生理活性，如抗肿瘤、抗菌、抗病毒、止血、治疗骨质疏松、雌激素样作用等。近年来，随着化学合成和生物技术的发展，人们对Coumestan类天然产物的骨架构筑及其生物活性进行了深入研究。本文将全面梳理Coumestan类天然产物的结构特征、骨架构筑方法以及其生物活性方面的最新研究进展。

Abstract: Coumestans are a class of natural compounds characterized by a four-ring lactone as their core structure. They are predominantly found in plants of the Fabaceae (Papilionaceae), Leguminosae, Compositae, and other botanical families, exhibiting diverse pharmacological and physiological activities such as anti-tumor, antimicrobial, antiviral, hemostatic, treatment of osteoporosis, and estrogenic effects. In recent years, with advancements in chemical synthesis and biotechnology, there has been a profound exploration of the scaffold construction and biological activities of coumestan-type natural products. This article aims to comprehensively review the structural features, methods of scaffold construction, and the latest research developments in the biological activities of coumestan-type natural products.

1. 引言

香豆素(coumarin)是广泛存在于自然界中的一种内酯类化合物。其独特的含氧杂环的骨架结构使其成为药物化学和材料科学领域中备受青睐的支架材料之一 [1] 。许多香豆素衍生物已从天然来源中提取、设计、合成，并在不同的药理靶点上进行了评价 [2] ，表现出多样的生物活性。如抗菌 [3] [4] 、抗HIV [5] 、抗氧化 [6] 、抗癌 [7] [8] [9] 、抗炎 [10] 、抗凝 [11] 、丝氨酸蛋白酶抑制 [12] 、类固醇5α还原酶抑制 [13] 等。其中，苯并呋喃香豆素衍生物作为植物生产中的一类重要化合物，在植物的生命活动中发挥着独特的作用 [14] 。如图1，许多天然产生的具有生物活性香豆素，作为雌激素受体拮抗剂的coumestrol、IKB激酶抑制剂wedelolactone、denthyrsin和fluorophore等，已经被开发应用在医药、科研等多个领域 [15] 。

Figure 1. Some representative active benzofuranocoumarin compounds

图1. 一些具有代表性的活性苯并呋喃香豆素化合物

2. Coumestan类天然产物分离及其重要的生理活性和药理活性

Coumestans是一类含有香豆素骨架的多环芳香族植物次生代谢产物，是天然存在的香豆素类化合物的一个特殊亚类 [16] 。作为香豆素家族的一员广泛分布于各种植物中，尤其是豆科(Leguminosae)和菊科(Compositae) [17] 。其母核结构如图2所示，可被称为苯并呋喃[3,2-c]香豆素，其系统名称为6H-苯并呋喃[3,2-c]苯并吡喃-6-酮 [18] 。

1956年，Govindachari等 [19] 首次从金盏蟛蜞菊(Wedelia Calendulacea)的叶子中分离得到了第一个Coumestan化合物-蟛蜞菊内酯(Wedelolactone)。Bickoff等 [20] 于1957年再次从拉迪诺三叶草(Landinoclover)中分离并确定了其结构。Dhar [21] 和Jongheon Shin [22] 课题组分别于1990年和2014年从中药补骨脂种子中分离得到了3个新型的Coumestan类天然产物，并将其命名为bavacoumestan A、B、C。2006年，Wang等从红花岩黄耆(Hedysarum multijugum)的根中分离得到了10个Coumestan化合物 [23] 。Chai和Zhu等在2019年分别从补骨脂种子中分离得到了化合物bavacoumestan D [24] 和bavacoumestan E [25] 。2022年，杨秀伟课题组 [26] 继续从该植物中分离、鉴定得到了6个新的bavacoumestan类天然产物，分别是bavacoumestan F-K。

根据我们对Coumestan的文献调研表明，自1956年生物学家在金盏蟛蜞菊中首次发现Coumestan化合物以来，在不同的植物来源中已鉴定出超过数百种结构各异的Coumestans [27] 。Coumestans作为豆科植物的特征性次生代谢产物，在豆科植物中被广泛分离和鉴定 [28] 。

最初的药理学实验显示出Coumestans良好的药理作用，因此随着人们一直在天然产物中不断提取得到Coumestan化合物。并通过大量的生物实验，显示出这类化合物都表现出良好、广泛的生物活性。

Figure 2. Representative coumestans

图2. 具有代表性的coumestans

2.1. 抗炎活性

类风湿性关节炎(RA)是一种常见的炎症性自身免疫性疾病 [29] ，全球患病率逐年增加，对患者生活质量造成严重影响。RA治疗具有挑战性，病因和发病机制复杂。现有治疗方法主要旨在延缓疾病进展，缓解症状，通过药物administration，包括疾病修饰抗风湿药物(DMARDs)、非甾体抗炎药(NSAIDs)、糖皮质激素和生物制剂，患者生活质量得到显著改善 [30] 。然而，尽管近年来RA治疗取得了巨大进展，但这些药物的长期干预仍伴有疗效有限、成本高昂和治疗相关副作用的问题，因此迫切需要开发新型、更安全的RA治疗药物。

大豆的根在民间医学中用于治疗类风湿性关节炎(RA)和关节感染。如图3，Glytabastan B (GlyB)是一种新报道的从该物种中分离的coumestan类化合物 [31] 。Tu等通过细胞实验和动物实验的方法，探究了GlyB对关节炎炎症、骨质破坏和疾病进展的影响 [32] 。研究结果表明，GlyB能够抑制炎症因子和基质金属蛋白酶(MMPs)的产生，减轻炎症反应；同时，它还能抑制RANKL诱导的破骨细胞生成，减少破骨细胞相关标志物的表达和骨吸收。此外，GlyB在小鼠模型中也显示出抑制炎症、破骨细胞形成和疾病进展的效果。通过网络药理学、定量磷酸蛋白组学和实验药理学的综合分析，研究人员发现GlyB通过抑制MAPK和PI3K/AKT途径的激活，以及它们的下游信号通路(包括NF-κB和GSK3β/NFATc1)来发挥其治疗作用。此外，药物亲和性响应靶标稳定性(DARTS)实验、细胞热稳定(CETSA)实验和分子对接分析证实了GlyB与其靶蛋白ERK 2、JNK 1和PI3K催化亚基p110 (α、β、δ和γ)之间的直接相互作用，这对于抑制MAPK和PI3K/AKT途径的激活起到了重要作用。综上所述，这些研究结果表明GlyB是一种有潜力的多靶点候选物，可用于预防和治疗RA。

Figure 3. Structure of compound Glytabastan B

图3. 化合物Glytabastan B结构

2.2. 抗结核活性

结核病(TB)作为一种传染病，对全球公共卫生构成威胁。目前，该病已成为单一感染原导致死亡的主要原因 [33] ，仅2018一年就有1000万人感染此病，超过了艾滋病。组合化疗是控制结核病的主要手段，但多药耐药(MDR)和广泛耐药结核病(XDR-TB)的出现威胁到一线药物的效果。在第一线抗结核药物和方案确立的四十年后，仅有两种新抗结核药物贝达喹啉(bedaquiline)和普托马尼迪(pretomanid)获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准，用于治疗耐药性结核病。毫无疑问，新型抗结核药物和新靶点对于实现世界卫生组织(WHO)采纳的终结结核病策略至关重要。

Bishai课题组探索了关于coumestan的化合物在结核病治疗中的潜在疗效 [33] 。研究人员发现coumestan化合物可以通过抑制Mycobacterium tuberculosis中的Pks13酶来发挥抗结核作用。Pks13酶是一种重要的酶，它能将两个脂肪酰链合成α-烷基β-酮酸酯，进而作为合成结核分枝杆菌细胞壁必需的组成部分—肉豆蔻酸的前体。研究发现coumestan化合物对药物敏感和耐药株的结核分枝杆菌均具有活性，并且对健康细胞的毒性较低，具有良好的选择性。此外，coumestan化合物与一线结核药物之间没有交叉耐药性。实验结果显示，使用图4中所示化合物1的15倍最小抑菌浓度(MIC)处理结核分枝杆菌，可以将细菌数量从6.0 log10单位减少到检测限以下(1.0 log10单位)。药代动力学研究表明，化合物1具有良好的相对生物利用度(19.4%)。在小鼠感染和化疗模型中，化合物1的治疗表现出剂量依赖的单药疗效，而与利福平的联合治疗则显示出明显的协同效应。综上所述，这些数据表明Coumestan化合物是进一步开发结核病药物的有希望的候选物。

Figure 4. Compound 1 with antituberculosis effect

图4. 具有抗结核作用的化合物1

2.3. 抗癌活性

如图5所示，是一些有代表性的具有抗癌活性的coumestan类天然产物。其中，Wedelolactone是分离得到的第一个coumestan类化合物。通过文献调研，我们发现Wedelolactone及其Demethylwedelolactone衍生物表现出对VEGFR-2的显著抑制活性 [34] 。在浓度为0.1 mg/ml的条件下，两个化合物的抑制率分别为93.32%和78.66%。值得注意的是，对Demethylwedelolactone进行磺酸酯化后，其水溶性得到显著提高，同时活性也增加，使得在相同的浓度下(0.1 mg/ml)，抑制率达到100%。这与阳性对照药舒尼替尼相当，后者的抑制率为101.08%。

Wedelolactone (2)已被发现是一种有效且选择性的5-脂氧合酶抑制剂(IC₅₀ = 2.5 mM)，其效力是coumestrol (5)的40倍 [35] 。该抑制作用通过氧自由基清除机制实现 [36] 。此外，有报道指出，Wedelolactone (2)在体外通过下调蛋白激酶C的方式触发人前列腺癌细胞凋亡。有关其衍生物Demethylwedelolactone (3)，已证实其具有抑制乳腺癌异种移植物侵袭性生长和转移的效果。同样，Psoralidin (4)的研究表明其能够诱导乳腺癌、结肠癌、胃癌和前列腺癌细胞凋亡 [37] 。此外，高剂量的coumestrol (5)也已被发现能够诱导乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌细胞凋亡。

Figure 5. Coumestan natural products with anticancer activity

图5. 具有抗癌活性的coumestan类天然产物

2016年，Wellington课题组 [38] 以商业上可获得的儿茶酚和香豆素作为反应底物，通过使用一种名为漆酶(Laccase EC 1.10.3.2)的真菌酶催化合成了一系列coumestan衍生物(见图6)，并评估它们的抗癌活性。研究人员使用了三种人类癌细胞系(TK10，UACC62和MCF7)进行实验，并使用了细胞生长抑制的指标来评估化合物的活性。我们计算了每个化合物在不同细胞系中的GI₅₀ (50%生长抑制浓度)、TGI (完全生长抑制浓度)和LC₅₀ (50%致死浓度)。实验结果显示，其中一种衍生物(化合物7)对黑色素瘤细胞株UACC62和乳腺癌细胞株MCF7表现出强效的抗癌活性，而另一种衍生物(化合物8)对这两种细胞株表现出中等活性，还有一种衍生物(化合物6)对这两种细胞株表现出较弱的活性。研究还发现，含有氯或氟取代基的coumestan衍生物没有显著的抗癌活性，而甲基基团是获得抗癌活性的首选取代基。此外，研究还发现，这些coumestan的抗癌活性与其脂溶性之间没有线性相关性。总体而言，该研究为coumestan衍生物的合成和抗癌活性提供了有价值的信息，并为进一步改进这些化合物的生物活性和确定其作用机制提供了基础。

Figure 6. Coumestan derivatives 6, 7, 8 with anticancer activity

图6. 具有抗癌活性的coumestan衍生物6、7、8

2.4. 植物雌激素作用 [39]

Ben课题组在研究中发现了wedelolactone的全新生物活性，即使在小剂量(nM)下，它也能发挥功效。wedelolactone被证实是雌激素受体(ER)a和b的激动剂，这一特性通过转染瞬时表达ERa或ERb的细胞中的雌激素反应元件(ERE)的转激活和分子对接实验得以证实。在乳腺癌细胞中，wedelolactone能刺激雌激素受体阳性细胞的生长，上调雌激素响应基因的表达，并激活快速非基因组雌激素信号传导。这些效应可被纯ER拮抗剂ICI 182、780预处理所抑制，而在ER阴性乳腺癌细胞中则未观察到这些效应。因此，wedelolactone在乳腺癌细胞中作为植物雌激素发挥作用，通过刺激ER基因组和非基因组信号通路起到效应。

近二十年，在香豆素的提取和分离、结构鉴定、生物评价、药代动力学和化学合成等方面进行了大量的研究，表明香豆素可作为开发新型药物先导物的重要化学骨架。

3. Coumestan类天然产物的合成方法

3.1. Coumestan类天然产物结构特征及骨架构筑策略

Coumestans是一类含有四个环的内酯类化合物，作为各种天然产物和生物活性分子的关键结构被广泛存在，因其生物学特性和合成方面的挑战而引起了研究者的广泛关注。该类化合物主要特征包括独特的香豆素骈苯并呋喃结构作为分子的基本骨架，它们共享一个C=C键。具有一个6/6/5/6的四元并环结构和一个内酯环。如图7所示，目前，构筑coumestan骨架的方法主要可分为三类：第一类是通过紫檀烷(pterocarpan)氧化脱氢来构筑coumestan骨架；第二类是在苯并吡喃环的基础上构建苯并呋喃环；第三类是在苯并呋喃环的基础上构建苯并呋喃环(图7)。

Figure 7. Framework construction strategy of Coumestan natural products

图7. Coumestan类天然产物骨架构筑策略

3.2. 通过Pterocarpan的氧化脱氢构筑coumestan骨架

Pterocarpan的氧化脱氢方案是一种模拟coumestan类化合物仿生合成的方法。

2001年，Costa教授课题组 [40] 报道了通过Pterocarpan的氧化为关键反应，合成了5个A环和B环具有不同氧合模式的coumestan类化合物(见图8)。研究人员以芳香醛9为起始原料，通过Baeyer-Villiger Oxidation反应得到酚中间体10，然后分别与3-碘丙烷二甲基缩醛环化和与(AcO)₂Hg反应生成苯并吡喃化合物11和相应的有机汞化合物12。再在PdCl₂催化作用下发生了Heck偶联反应得到了关键反应前体Pterocarpan13，最后Pterocarpan13与DDQ在THF中于室温下氧化脱氢得到一系列不同取代的coumestan类化合物14a-d。

Figure 8. Professor Costa’s project

图8. Costa教授课题组的方案

2007年，Naito课题组 [41] 通过对氧肟醚进行酰化、重排和环化反应，实现了对二氢苯并呋喃和苯并呋喃的高效合成(见图9)。研究人员将一种普通的O-苯基羟胺16与4-铬酮缩合，然后对得到的肟醚17进行乙酰化和重排，通过两步得到所需的三环苯并呋喃18。最后，通过PCC处理三环苯并呋喃18，引入碳基，得到天然产物coumestan，产率为76%。研究发现，在三氟乙酰基化反应过程中，通过三氟乙酰基基团促进的[3,3]-Sigmatropic重排反应可以顺利进行，从而实现了苯并呋喃的合成。此外，研究人员还发现这种重排反应可以应用于合成更复杂的杂环化合物。通过这种方法，研究人员成功地合成了几种天然产物，包括Stemofuran A、Eupomatenoid 6和Coumestan。这种合成方法具有高效、通用的特点，并且无需对酚羟基进行保护。

Figure 9. The project of Naito

图9. Naito课题组的方案

3.3. 在苯并吡喃环的基础上构筑coumestan骨架

3.3.1. FeCl₃介导的氧化闭环 [42]

2011年，Zhao及其同事报道的一种合成方法，该方法利用FeCl₃介导分子内环化，通过直接氧化芳香C-O键成功构建了苯并呋喃结构，从而得到了coumestan骨架(见图10)。在这个反应过程中，通过改变反应条件，例如使用不同取代基的4-羟基-3-苯基-2H-茚酮衍生物作为反应底物，调节FeCl₃的用量和反应温度等因素，成功合成了30多种不同取代基的coumestan衍生物。总体而言，这一方法具有反应条件温和、产率高的特点，为有机合成化学领域提供了一种有效的合成策略，尤其适用于合成具有不同取代基的coumestan类化合物。这项研究为开发新的合成路线以及合成多样性的coumestan类化合物提供了有力的工具，并有望在药物合成等领域产生广泛的应用。

3.3.2. Pd(OAc)₂催化的偶联反应构筑coumestan骨架

2016年，McGlacken和Xu课题组分别独立地报道了通过Pd(OAc)₂/Ag₂O和Pd(OAc)₂/AgOAc共催化分子内的环化反应合成coumestan类化合物。

McGlacken课题组 [43] 通过双C-H活化反应实现4-苯氧基-2-香豆素和2-吡喃酮24的环化(见图11)。

Figure 10. Fecl₃-mediated oxidation loop of 4-hydroxycoumarin

图10. FeCl₃介导的4-羟基香豆素的氧化闭环

Figure 11. Double C-H activation under Pd(OAc)₂/Ag₂O cocatalysis

图11. Pd(OAc)₂/Ag₂O共催化下双C-H活化

研究团队首先优化了反应条件，发现使用Pd(OAc)₂作为催化剂、Ag₂O作为氧化剂、NaOtBu作为碱以及PivOH作为溶剂时，反应效果最佳。然后，他们对反应底物范围进行了研究，发现在不同的底物结构下，反应仍然能够高效进行。此外，研究团队还对反应机理进行了探究，发现C-3-H键的活化在反应中起到了重要的作用。通过测量同位素效应，他们确定了C-3-H键的活化是可逆的，并且对反应的速率没有显著影响。值得注意的是，研究人员利用该方法三步合成了天然产物flavichapparin C (产率48%)。

Xu课题组 [44] 通过Pd(OAc)₂/AgOAc共催化发展了一种高效、原子经济的分子内交叉偶联(CDC)反应来合成含coumestan结构的稠合多杂环化合物，如coumestans和[3,2-c]coumarins (见图12)。该方法具有高度原子经济性和步骤经济性，并且可以在良好至优异的产率(高达99%)下合成多种生物活性分子。通过优化反应条件，可以实现对不同电子性质的4-芳氧基香豆素31的选择性活化，从而实现了对多样化底物的反应。这种方法为合成香豆素类化合物提供了一种快速、高效的途径。

Figure 12. Pd(OAc)₂/AgOAc cocatalyze intramolecular cross-coupling reactions

图12. Pd(OAc)2/AgOAc共催化分子内交叉偶联反应

3.3.3. 邹永教授课题组对coumestan类天然产物的合成策略

2019年，中山大学药学院邹永教授课题组 [45] 报道了一种简单、高效、无贵金属催化剂、对多酚基底物具有很好官能团相容性的合成策略，用于合成coumestan类化合物(见图13)。研究人员通过Cu(OAc)2和1,10-菲罗啉共催化2’-羟基-3-芳基香豆素33分子内交叉脱氢C-O偶联反应，以中等至优异的产率构建了coumestan骨架并得到了一系列coumestan衍生物。该方法具有重要的合成应用潜力，并为合成coumestan类天然产物和其他复杂有机分子提供了新的策略。

Figure 13. Cu(OAc)₂ catalyzes intramolecular cross dehydrogenation C-O coupling

图13. Cu(OAc)₂催化分子内交叉脱氢C-O偶联反应

然而，对金属催化剂和配体的要求以及相对较高的反应温度仍将限制其应用。因此，开发一种简单、无金属和配体、更良性的香豆素合成策略是非常需要的。在过去的几十年里，oxa-Michael反应已经成为C-O键构建的强大工具，并在仿生学中得到了广泛的应用。

在2022年，该小组对过往金属催化的合成方法进行了改进，研究人员通过串联的脱氢反应和oxa-Michae反应，成功地将2',4'-二羟基-3-芳基香豆素35转化为酚类coumestan类化合物 [46] (见图14)。该方法以2′,4′-二羟基-3芳基香豆素35为原料，在40℃无金属和配体的条件下由1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)有效促进的连续分子内脱氢/oxa-Micheal反应。该方法具有以下几个显著特点：反应条件简单，无需金属催化剂、配体或保护基；底物范围广泛，对多羟基官能团具有良好的兼容性；此外，研究者还利用该方法成功地合成了天然产物4'-甲氧基coumestrol、coumestrol和plicadin。通过这项研究，研究者解决了合成酚类coumestan化合物的方法不够高效、环境友好的问题，并为合成天然产物提供了新的策略。

3.4. 在苯并呋喃环的基础上构筑coumestan骨架

3.4.1. 碘环化和钯催化的内分子内酯化反应

2005年，Larock课题组 [47] 报道了通过碘环化和钯催化的内分子内酯化反应高效的合成Coumestrol

Figure 14. Tandem dehydrogenation and oxa-Michae reaction

图14. 串联的脱氢反应和oxa-Michae反应

和Coumestan类化合物的方法(见图15)。研究人员发现，在内酯化过程中使用乙酰氧基基团作为亲核试剂，可以作为一个潜在的羟基保护基团。这种方法不需要对羟基进行去保护，可以在一锅法的羰基化反应中完成。通过对适当的炔烃进行碘环化反应，可以高效制备所需的起始材料。这些起始材料易于获取，使得整个合成过程特别具有吸引力。通过对苯并呋喃化合物进行钯催化和CO反应，可以在单步反应中实现羰基化和内酯化。研究人员还通过对反应条件的优化，实现了高产率的合成。总的来说，这项研究提供了一种高效合成Coumestrol和Coumestan类化合物的方法，并且避免了羟基保护和去保护的步骤。

Figure 15. Intramolecular esterification catalyzed by iodine cyclization and palladium

图15. 碘环化和钯催化的内分子内酯化反应

3.4.2. 新型[3 + 3]环化策略用于高效合成coumestan类化合物

2013年，Wang课题组 [48] 成功应用Pd催化的C-S活化反应，将(2-甲硫基-3-酯基)苯并呋喃42与2-羟基苯硼酸43进行交叉偶联，并在Liebeskind-Srogl条件下进行顺序分子内酯交换反应。从易得的起始物质中开发出了一种高效合成香豆素衍生物的新型[3 + 3]环化策略(见图16)。这种方法为合成香豆素类化合物提供了一种新颖且高效的途径。

Figure 16. Novel [3 + 3] cyclization strategy

图16. 新型[3 + 3]环化策略

3.5. 直接构筑coumestan骨架

2016年，Tang课题组 [49] 开发了一种合成coumestan的新方法(见图17)。研究人员通过一步串联反应，将易得的2,3-双(2-甲氧基苯基)-3-氧代丙醛45作为起始底物，经过去甲基化、环化和氧化反应，成功地合成了coumestan。这种方法简便实用，反应条件温和，产率良好。研究人员还通过引入卤素取代基，利用钯催化的Suzuki偶联反应，进一步合成了更复杂的coumestan衍生物，产率良好。同时这种方法具有良好的官能团兼容性，对苯环A和B上的取代基(无论是富电子还是亏电子)都不影响底物的反应性。

Figure 17. The one-pot tandem demethylation/cyclization/oxidation synthesis of coumestan

图17. 一锅法串联去甲基化/环化/氧化合成coumestan

4. 结论

本文全面综述了Coumestan类天然产物的合成方法及其生物活性的研究进展。通过对近年来相关研究的分析，我们得出以下结论：

首先，已有的合成方法在实现Coumesta类化合物的高效合成方面取得了显著进展。其中，FeCl₃介导的分子内环化方法因其温和条件和高产率而备受关注，为合成具有广泛生物活性的Coumestan衍生物提供了一种简便而有效的途径。

其次，通过合成得到的Coumesta类天然产物的结构与天然产物的相似性，初步证明了这些合成产物具有潜在的生物活性。这为进一步深入研究这些化合物在医药领域的应用奠定了基础。

在应用方面，这些合成方法在药物合成、医药化学和其他领域展现出广阔的应用前景。这不仅促进了天然产物的合成，也为新型药物的研发提供了新思路。

然而，我们也意识到当前研究中仍存在一些挑战和未解之谜。例如，一些合成产物的具体生物活性仍需要更深入的研究和验证。此外，有必要进一步改进合成方法，以提高合成的效率和可操作性。

综上所述，Coumesta类天然产物的合成及其生物活性研究取得了显著的进展，为该领域的发展提供了坚实的基础。未来的研究应重点关注解决当前面临的挑战，并不断拓展这一领域的深度和广度。这将有助于揭示Coumesta类天然产物的更多生物学功能，并推动其在医药和相关领域的应用。