1,25(OH)₂D₃通过稳定线粒体DNA对GCDC诱导的HiBECs凋亡的作用研究

The Role of 1,25(OH)₂D₃ on GCDC-Induced Apoptosis in HiBECs by Stabilising Mitochondrial DNA

摘要: 目的：探讨骨化三醇(1,25(OH)₂D₃)对甘氨鹅脱氧胆酸盐(GCDC)诱导的人肝内胆管上皮细胞(HiBECs)凋亡的影响，并初步阐明其潜在的作用机制。方法：采用1 nM GCDC处理HiBECs建立原发性胆汁性胆管炎细胞模型，并采用不同浓度(0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM) 1,25(OH)₂D₃处理12 h。流式细胞术检测细胞凋亡水平，ELISA检测细胞培养液中炎症因子IL-6和IL-8水平，qPCR检测PDC-E2、PGC-1α、NrF-1和NrF-2的mRNA相对表达水平，Western blot检测细胞内Bcl-2、PDC-E2表达水平。结果：1 mM GCDC可以降低HiBECs细胞增殖活性，诱导HiBECs凋亡，提高细胞培养液中IL-6和IL-8水平，上调PDC-E2蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达，抑制COX-1、PGC-1α、NrF-1和NrF-2 mRNA相对表达水平。可以提高GCDC诱导的HiBECs细胞增殖活性，抑制GCDC诱导HiBECs细胞凋亡，降低细胞培养液中IL-6和IL-8水平，下调PDC-E2蛋白表达水平，提高COX-1、PGC-1α、NrF-1和NrF-2 mRNA相对表达水平。结论：1,25(OH)₂D₃可抑制诱导HiBECs细胞凋亡，其作用机制可能与线粒体DNA稳定有关。

Abstract: Objective: To investigate the effects of osteotriol (1,25(OH)₂D₃) on Glycochenodeoxycholate (GCDC)-induced apoptosis of human intrahepatic biliary epithelial cells (HiBECs) and to preliminarily elucidate its potential mechanism of action. Methods: Primary biliary cholangitis cell model was established by treating HiBECs with 1 nM GCDC and treated with different concentrations (0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM) of 1,25(OH)₂D₃ for 12 h. The apoptosis level was detected by flow cytometry, the levels of the inflammatory factors IL-6 and IL-8 were detected by ELISA in the cell culture fluid, and qPCR was performed to detect the relative mRNA expression levels of PDC-E2, PGC-1α, NrF-1 and NrF-2 were detected by qPCR, and the intracellular expression levels of Bcl-2 and PDC-E2 were detected by Western blot. Results: 1 mM GCDC could reduce the proliferative activity of HiBECs cells, induce apoptosis of HiBECs, increase the levels of IL-6 and IL-8 in the cell culture medium, up-regulate the expression of PDC-E2 protein, down-regulate the expression of Bcl-2 protein, and inhibit the relative expression levels of COX-1, PGC-1α, NrF-1, and NrF-2 mRNA. It can increase the proliferative activity of GCDC-induced HiBECs cells, inhibit GCDC-induced apoptosis of HiBECs cells, reduce the levels of IL-6 and IL-8 in the cell culture medium, down-regulate the level of PDC-E2 protein expression, and increase the level of COX-1, PGC-1α, NrF-1 and NrF-2 mRNA relative expression. Conclusion: 1,25(OH)₂D₃ can inhibit the induction of apoptosis in HiBECs, and its mechanism of action may be related to mitochondrial DNA stabilisation.

1. 引言

原发性胆汁性胆管炎(Primary Biliary Cholangitis, PBC)是一种免疫介导的慢性胆汁性肝病。线粒体抗原作为PBC的自身免疫抗原，最重要的亚单位是丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基(Pyruvate dehydrogenase complex E2, PDC-E2) [1] 。针对PDC-E2产生的抗线粒体抗体(Anti-mitochondrial antibody, AMA)是PBC的血清学标志，可见于90%的PBC患者，常用作该病的重要实验室诊断指标 [2] 。

人肝内胆管上皮细胞(Human Intrahepatic biliary epithelial cells, HiBECs)是肝细胞的重要组成部分，也是PBC的靶细胞，其损伤机制是研究PBC发病机制的关键 [3] 。甘氨鹅脱氧胆酸盐(Glycochenodeoxycholate, GCDC)作为胆汁酸的重要组成部分，可以诱导肝细胞和胆管上皮细胞凋亡，采取GCDC诱导凋亡可更好的模拟PBC疾病状态。因此大多数研究采取GCDC诱导肝内胆管上细胞凋亡来构建PBC细胞研究模型 [4] [5] 。

线粒体是能量细胞器，依靠呼吸链电子传递，将氧和糖代谢产物转化为三磷酸腺苷(ATP)。在胆汁淤积性疾病中，线粒体功能障碍和氧化应激相互作用，是诱导细胞死亡的重要因素 [6] 。过氧化物酶激活受体γ激活剂-1α (peroxidase-activated receptor gamma activator-1α, PGC-1α)是线粒体生物合成和功能的主要调节因子，可以增强核呼吸因子(nuclear respiratory factor, NRF)-1和NRF-2的表达和线粒体转录因子A (mitochondrial transcription factor A, TFAM)的转录活性，促进线粒体调节蛋白的转录及生物生成，提供能量代谢，对细胞产生保护作用 [7] 。越来越多的证据表明，胆汁酸损害肝细胞线粒体功能，导致胆汁淤积 [8] 。当机体处于高水平氧化应激时，线粒体DNA (mtDNA)容易受到氧化损伤，促进细胞凋亡 [9] [10] 。因此，防止胆管上皮细胞线粒体功能障碍可以改善肝功能，减少胆汁淤积 [11] 。

维生素D是一种类固醇激素，具有多种生物效应，包括钙磷平衡 [12] 、骨代谢 [13] 、免疫调节 [14] [15] 、细胞增殖和分化以及多种组织的转录调节 [16] 。有研究发现许多肝脏疾病，都检测到血清维生素D水平过低，包括原发性胆汁性胆管炎(PBC) [17] 、自身免疫性肝炎 [18] 、慢性乙型肝炎 [19] [20] 、慢性丙型肝炎 [21] [22] 和非酒精性脂肪肝(NAFLD) [23] [24] 。

尽管维生素D具有调节肝损伤和抑制细胞凋亡的作用，但目前维生素D在PBC肝内胆管上皮细胞的作用和具体潜在机制尚未明确。因此，本研究采用维生素D的活性形式，作用于PBC细胞模型，检测其对HiBECs凋亡的影响，并进一步探讨是否通过稳定mtDNA来抑制HiBECs凋亡，为PBC的治疗研究提供更多的基础资料。

2. 材料与方法

2.1. 实验细胞

HiBECs购自智立中特(武汉)生物科技有限公司。将细胞培养在含10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素的DMEM培养基中，放置于37℃、5% CO₂饱和湿度的培养箱中培养。每2天换液1次，待细胞融合度达到80%以上时，进行细胞传代。

2.2. 主要试剂及仪器

DMEM培养基购于青岛赛尚科贸有限公司，GCDC购于大连美仑生物技术有限公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、BCA试剂盒、逆转录试剂盒、实时定量试剂盒购于翌圣生物科技(上海)股份有限公司，CCK-8增强型细胞活力检测试剂盒、TBST Buffer (10×)购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，胎牛血清、实时荧光定量PCR仪购于美国Thermo公司，抗PDC-E2抗体、抗Bcl-2抗体购于美国Abcam公司。自动酶标仪(ELX800酶标仪)购于美国Bio Tek公司。

2.3. 细胞分组与处理

将HiBECs分为：① 对照组(NC)：正常HiBECs；② GCDC组：1 mM GCDC处理HiBECs建立PBC细胞模型；③ GCDC + 低、中、高浓度(GCDC + VD-L、GCDC + VD-M、GCDC + VD-H)：采用1、10、100 nM与1 mM GCDC共同处理人肝内胆管上皮细胞12 h。

2.4. CCK-8

CCK-8法检测处理对细胞活力的影响。将生长状态良好HiBECs消化后接种于96孔板中，待细胞生长至约70%融合度时进行分组处理，同时设置空白组，培养12 h。每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续培养1.5 h，用自动酶标仪在450 nm下检测吸光度，并计算细胞增殖活性。细胞存活率 = (处理组OD值 − 空白对照组OD值)/(处理组OD值 − 空白对照组OD值) × 100%。

2.5. 酶联免疫吸附试验(ELISA)

收集各组细胞培养液，采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中IL-6及IL-8水平。

2.6. 流式细胞术

根据生产商的说明书(上海翌圣生物科技有限公司)，使用Annexin V-FITC测定法通过流式细胞仪测量细胞凋亡。简单地说，收获细胞，用PBS冲洗两次，在2500 r-min⁻¹、4℃下离心5 min，弃去上清液。将细胞重悬于400 μL含有5 μL FITV和10 μL PI的1 × 结合缓冲液中，室温暗处孵育15 min。孵育后1小时内用流式细胞仪分析样本。

2.7. qPCR

采用TRIzol法从细胞中提取总RNA，采用逆转录试剂盒将总RNA逆转成cDNA，再采取荧光定量PCR试剂盒以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR条件：95℃预变形30 s，95℃变性3 s，60℃退火/延伸20 s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2^−ΔΔCT法计算各组细胞中mRNA相对表达水平。实验中使用的引物序列见表1。

Table 1. qPCR primer information

表1. qPCR引物信息

2.8. Western Blot

用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的放射免疫共沉淀测定(RIPA)裂解缓冲液在冰上裂解6孔板中的细胞10分钟。收集上清液，用BCA试剂盒测定蛋白质样品的浓度。各蛋白样品经SDS-PAGE分离，电印迹到PVDF膜上。然后用一抗封闭，4℃孵育过夜。洗膜后加入二抗室温孵育1 h。采用ECL显影液于显影仪显影。用Image J软件进行密度分析。

2.9. 统计学

本实验结果数据利用Graphpad Prism 10.0软件进行统计分析和作图。正态分布的数据利用两独立样本T检验或单因素方差分析，非正态分布的数据利用Wilcoxon秩和检验及Kruskal-Wallis秩和检验。P < 0.05代表差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. PBC细胞模型建立

PBC的病理特征是HiBECs凋亡性损伤，HiBECs凋亡后，PDC-E2暴露诱导胆管上皮产生自身免疫损伤的靶抗原。因此，需要检测HiBECs凋亡率和PDC-E2的表达水平，来验证PBC细胞模型是否构建成功。采用1 nM的GCDC作用于HiBECs 12 h后，采用qPCR法检测PDC-E2 mRNA相对表达量，结果发现PDC-E2 mRNA水平相较于NC组表达升高约2.3倍(P < 0.05) (见图1(a))，Western Blot结果显示PDC-E2蛋白表达水平升高约2.1倍(P < 0.01) (见图1(b)、图1(c))。同时采用流式细胞术检测细胞凋亡百分情况，结果显示正常的早期凋亡细胞在12.01%，而应用了GCDC诱导后的细胞凋亡率明显增加，达到31.78% (见图1(d))。以上证明了PBC细胞模型成功建立，可以用于后续研究。

(a) 正常HiBECs组和GCDC组PDC-E2 mRNA相对表达水平；(b) 正常HiBECs组和GCDC组PDC-E2蛋白表达水平；(c) PDC-E2蛋白的定量分析；(d) 流式细胞术检测HiBECs凋亡率。

Figure 1. Establishment of the PBC cell model

图1. PBC细胞模型的建立

3.2. 1,25(OH)₂D₃对正常HiBEC细胞增殖活性的影响

为筛选出对HiBECs合适浓度，采用CCK-8法检测不同浓度1,25(OH)₂D₃对正常HiBECs增殖水平的影响。不同浓度(1 nM、10 nM、100 nM、300 nM) 1,25(OH)₂D₃处理正常HiBECs 12 h，实验结果表明，当1,25(OH)₂D₃浓度达到300 nM时，HiBECs增殖活性受到明显抑制(P < 0.05) (见图2(a))，而采用1 nM、10 nM、100 nM 1,25(OH)₂D₃处理对HiBECs增殖活性无明显抑制作用(P > 0.05) (见图3(a))。因此，本研究后续研究中，分别以1 nM、10 nM、100 nM作为维生素D的低、中、高浓度(GCDC + VD-L、GCDC + VD-M、GCDC + VD-H)进行实验。

3.3. 1,25(OH)₂D₃对PBC细胞分泌细胞因子的影响

我们通过ELISA检测细胞培养液中的IL-6、IL-8促炎细胞因子，结果发现，与NC组相比较，应用GCDC诱导的PBC细胞的培养液中促炎细胞因子IL-6 (P < 0.01) (见图3(a))、IL-8 (P < 0.05) (见图3(b))浓度均显著升高。应用1,25(OH)₂D₃处理后，GCDC + VD-L组、GCDC + VD-M和GCDC + VD-H组IL-6浓度均呈浓度梯度性下降(见图3(a))。与GCDC组相比，GCDC + VD-H组的IL-8浓度出现下降(P < 0.05) (见图3(b))。

(a) 1,25(OH)₂D₃对正常HiBECs增殖活性的影响；(b) 1,25(OH)₂D₃对PBC细胞增殖活性的影响。^#P < 0.05, ^##P < 0.01 vs. NC组. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001 vs. GCDC组。^ΔP < 0.05 vs. GCDC + VD-L组。GCDC + VD-L组：GCDC + 1 nM 1,25(OH)₂D₃；GCDC + VD-M组：GCDC + 10 nM 1,25(OH)₂D₃；GCDC + VD-H组：GCDC + 100 nM 1,25(OH)₂D₃。

Figure 2. The effect of 1,25(OH)₂D₃ on the proliferation of HiBECs

图2. 1,25(OH)₂D₃对HiBECs增殖的影响

(a) 各组培养基中IL-6水平；(b) 各组培养液中IL-8水平。^#P < 0.05, ^##P < 0.01 vs. NC组。^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001 vs. GCDC组。^ΔP < 0.05 vs. GCDC + VD-L组。GCDC + VD-L组：GCDC + 1 nM 1,25(OH)₂D₃；GCDC + VD-M组：GCDC + 10 nM 1,25(OH)₂D₃；GCDC + VD-H组：GCDC + 100 nM 1,25(OH)₂D₃。

Figure 3. The effect of 1,25(OH)₂D₃ on IL-6 and IL-8 in cell culture fluid

图3. 1,25(OH)₂D₃对细胞培养液中IL-6、IL-8的影响

3.4. 1,25(OH)₂D₃对PBC细胞凋亡率的影响

早期凋亡细胞为膜联蛋白V-FITC阳性和PI阴性。如图5(a)所示，与对照组相比，GCDC组早期细胞凋亡增加，而维生素处理部分逆转了GCDC诱导的HIBEC凋亡，差异具有统计学意义(P < 0.05) (见图4(a))。检测凋亡相关标志物的表达。结果发现，与对照组相比，PDC-E2 mRNA及蛋白表达上升，而Bcl-2蛋白表达下调。与GCDC组相比，应用1,25(OH)₂D₃后的PDC-E2 mRNA及蛋白表达水平下降，而Bcl-2蛋白表达上调(见图4(b)、图4(c))。

3.5. 1,25(OH)₂D₃对细胞mtDNA的影响

COX1用于测定mtDNA拷贝数，PGC-1α、NRF1、NRF2和TFAM作为参与线粒体生物合成的转录

(a) 维生素D对HiBECs凋亡率的影响；(b) 维生素D对PBC细胞增殖活性的影响；(c) 各组培养基中IL-6水平；(d) PDC-E2蛋白的定量分析；(e) Bcl-2蛋白的定量分析。^#P < 0.05, ^##P < 0.01 vs. NC组。^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001 vs. GCDC组。^ΔP < 0.05 vs. GCDC + VD-L组。GCDC + VD-L组：GCDC + 1 nM 1,25(OH)₂D₃；GCDC + VD-M组：GCDC + 10 nM 1,25(OH)₂D₃；GCDC + VD-H组：GCDC + 100 nM 1,25(OH)₂D₃。

图4. 1,25(OH)₂D₃对HiBECs细胞凋亡率的影响

因子，是mtDNA增殖标志物。通过qPCR检测，结果发现与NC组相比，GCDC的处理显著降低了PGC-1α (P < 0.01，见图5(a))、Nrf-1 (P < 0.01) (见图5(b))，Nrf-2 (P < 0.01) (见图5(c))和TFAM (P < 0.05) (见图5(d))、COX1 (P < 0.01) (见图5(e))的mRNA水平。而1,25(OH)₂D₃的干预逆转了GCDC的负面影响，使Nrf-1 (P < 0.01) (图5(b))，Nrf-2 (P < 0.01) (图5(b))和TFAM (P < 0.05) (图5(d))、COX1 (P < 0.05) (图5(e)) mRNA表达明显升高。

(a) qPCR检测各组COX1 mRNA表达水平。(b) qPCR检测各组PGC-1α mRNA表达水平。(c) qPCR检测各组Nrf-1 mRNA表达水平。(d) qPCR检测各组Nrf-2 mRNA表达水平。(e) qPCR检测各组TFAM mRNA水平。^#P < 0.05，^##P < 0.01 vs. NC组。^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001 vs. GCDC组。^ΔP < 0.05 vs. GCDC + VD-L组。GCDC + VD-L组：GCDC + 1 nM 1,25(OH)₂D₃；GCDC + VD-M组：GCDC + 10 nM 1,25(OH)₂D₃；GCDC + VD-H组：GCDC + 100 nM 1,25(OH)₂D₃。

图5. 1,25(OH)₂D₃对GCDC诱导的HiBECs mtDNA的影响

4. 讨论

在本研究中，我们建立了GCDC诱导的PBC细胞模型，以检测1,25(OH)₂D₃在PBC中的功能。近年来的研究表明维生素D对PBC有保护作用 [25] [26] [27] 。然而，大多数研究主要集中在血清中维生素D水平与PBC疾病进展的关系上，少数研究探讨了1,25(OH)₂D₃在PBC细胞模型中的影响及其机制。本研究首次发现1,25(OH)₂D₃可通过稳定mtDNA，调节线粒体代谢抑制GCDC诱导的HiBECs凋亡，可能是治疗PBC的潜在靶点。

首先本研究选择了人胆汁内主要毒性成分GCDC诱导人肝内胆管上皮细胞凋亡，PBC特异性自身抗体PDC-E2表达升高，细胞凋亡率增加，证明我们成功构建了PBC细胞模型，并且通过CCK-8实验确定了维生素D的合适作用剂量范围。实验结果显示GCDC诱导的HiBEC细胞增殖活性显著降低，细胞培养液中炎症因子IL-6、IL-8水平升高，同时HiBEC凋亡水平也显著增加。而维生素D提高了GCDC诱导的HiBEC细胞增殖活性，降低了细胞培养液中IL-6和IL-8水平，并且可以通过稳定mtDNA影响线粒体功能，抑制GCDC诱导的HiBEC凋亡，说明了维生素D对GCDC诱导的HiBEC具有保护作用。。这些结果提示维生素D可能是治疗PBC的一种选择。

以往的一些研究发现，维生素D可抑制细胞凋亡，在多种疾病中发挥治疗和预防作用。维生素D能减少顺铂诱导的人肾小管上皮细胞凋亡 [28] ，保护胃黏膜上皮细胞免受幽门螺旋杆菌诱导的凋亡 [29] ，改善链脲佐菌素诱导的大鼠胰腺组织凋亡和氧化应激 [30] 。维生素D对慢性肝胆疾病 [31] [32] [33] ，尤其是自身免疫性肝病(AILD)有保护作用。自身免疫性肝病(AILD)患者血清维生素D水平普遍降低，补充血清维生素D可减轻肝损伤和肝纤维化程度 [27] [34] [35] 。与之前研究结果一致，本研究发现维生素D减少PBC的HiBEC凋亡，在PBC中发挥保护作用。

线粒体功能障碍与肝胆汁淤积症有关。线粒体功能障碍与肝胆汁淤积症有关 [36] 。有毒胆盐积累会导致慢性损伤，如线粒体损伤、ROS增加和细胞凋亡，从而导致肝功能异常。研究发现，PGC-1α在维持线粒体和能量代谢平衡方面具有重要功能 [36] 。PGC-1α主导线粒体DNA复制和细胞氧化代谢，其表达水平是线粒体基因表达的限制因素 [37] 。此外，PGC-1α与NrFs (如NrF-1和NrF-2)共同作用，提高TFAM的表达来控制线粒体的生物生成 [38] [39] 。迄今为止，很少有研究报道1,25(OH)₂D₃通过线粒体途径对细胞凋亡具有保护作用。而我们的研究也发现，GCDC处理HiBEC通过抑制线粒体DNA稳定性、降低PGC-1α表达诱导细胞凋亡。维生素D通过激活PGC-1α，增加NrF-1，NrF-2表达，稳定mtDNA，并减少促炎细胞因子，减少HiBEC的细胞凋亡。

综上所述，本研究表明GCDC诱导HiBECs凋亡，1,25(OH)₂D₃通过稳定mtDNA途径参与GCDC诱导的HiBECs的抗凋亡作用。我们的研究结果阐明了1,25(OH)₂D₃在PBC中发挥保护作用的新机制。然而，该研究仍有一些不可忽视的局限性。目前的研究仅限于体外细胞模型，需要进一步的动物模型和临床实验，以全面阐明维生素D对PBC的治疗作用和机制，为PBC的研究提供理论基础。

5. 结论

本研究结果表明，维生素D可通过减轻线粒体mtDNA损伤，来抑制GCDC诱导的HiBEC凋亡，最终对PBC具有保护作用。这些结果拓展了我们对维生素D在PBC中治疗的认识，并为治疗PBC提供了新的靶点思路。

作者贡献声明

李永新负责文章撰写、实验设计及数据整理；王战负责实验验证、数据分析整理；高炜泽参与数据整理和实验验证；鲁文龙参与数据收集；刘明军负责课题总体设计和文章修改。

利益冲突

本人与其他作者宣称没有任何利益冲突，未接受任何不当的职务或财务利益。

NOTES

^*通讯作者。