1. 引言
黄土是由风沉积的、不成层的垆坶沉积物，通常孔隙较多且结构疏松。由于黄土的湿陷性导致其遇水会被浸湿，结构发生破坏而突然下沉，致使我国广阔的黄土面积利用率却十分低，亟需对松软黄土进行固化 [1] [2] 。目前多数的固化方法为机械固化，但此方法存在操作复杂、造价高、对环境不友好等种种问题 [3] 。研究一种环保高效的黄土固化技术是目前利用黄土资源首要解决的问题。
近年来，酶诱导碳酸钙沉淀(Enzyme Induced Calcium Carbonate Precipitation, EICP)技术由于其方法简便、材料便宜且对环境友好等特点在黄土固化方面迅速发展成为研究热点 [4] [5] [6] ，其原理是利用植物源脲酶与钙盐结合生成钙晶体作用于松软黄土，以达到固化效果的目的 [7] 。EICP在污染土修复 [8] 、防风固沙 [9] [10] 、古建筑保护 [11] 等具有研究成果。Hu等 [12] 通过酶促碳酸盐沉淀(EICP)进行了一系列试管试验，重现了EICP工艺，并分别在较高MgCl2、NH4Cl和CaCl2浓度的作用下，与改进后的EICP工艺产生的碳酸盐沉淀进行了比较。Shu等 [13] 以大豆为原料，利用粗脲酶催化砂中CaCO3的沉淀。为优化大豆粗脲酶提取效率，研究了大豆粉末粒度、浓度、浸泡时间、浸泡温度等因素对粗脲酶提取效果的影响，还进一步研究了大豆粗提物脲酶活性对EICP化学转化效率和生物胶结性能的影响。Zhang等 [14] 利用酶促碳酸钙沉淀(EICP)加固风沙，对比分析了碳酸钙含量、碳酸钙沉淀率、渗透系数和横波速度的差异。Shu等 [15] 研究脲酶、木质素及其混合物对粉土强度和抗液化性能的改善作用。基于无侧限抗压强度和动态三轴试验的结果和现象，分析了不同改善方案对粉土抗压强度、抗变形能力和抗液化能力的改善效果，得出了酶致碳酸钙沉淀(EICP)技术、单独使用木质素或EICP+木质素时水泥或木质素的最优值。
基于以上研究内容，本文主要通过试管试验研究大豆的脲酶活性及生成碳酸钙沉淀的影响，综合考虑了脲酶浓度、胶结液浓度、pH值及培养时间5种因素以及5个变量分析了最佳条件，通过正交试验设计对实验结果进行了极差分析与方差分析，同时分析了各因素对脲酶活性及碳酸钙生成量的影响规律，并确定了试验最优组合方案。
2. 材料与方法
2.1. 试验材料
选用市售大豆作为脲酶来源，产地为黑龙江绥化市。外表呈淡黄色，表面光滑呈椭圆形，其大小在0.5~1.5 cm之间。尿素与氯化钙(福晨化学试剂有限公司)混合而成的溶液作为胶结液，其中尿素化学式为CH4N2O，它是一种无色结晶固体，氯化钙化学式为CaCl2，呈白色多孔性颗粒，具有高度溶解性。两种试剂为分析纯试剂。试验用脱脂奶粉(内蒙古伊利实业集团股份有限公司)呈白色粉末状，用于稳固生成晶体类型。
2.2. 试样制备
脲酶溶液的制备方法是先将大豆置于101-2型电热鼓风干燥箱中50℃烘干4 h，使用800A型粉碎机(永康金味来电器有限公司)对黄豆颗粒进行粉碎，过100目筛后保留黄豆粉末，并与一定量去离子水在SN-MS-1型磁力搅拌机(西安康拓力仪器设备有限公司)上混合搅拌30 min，随后使用TGL-16G型离心机(湖南可成仪器设备有限公司)以4000 r/min的转速离心20 min，完成后提取上部分离清液于4℃冷藏备用，该清液即为大豆脲酶溶液。胶结液采用尿素与无水氯化钙按照一定的浓度，按体积比1:1混合至无沉淀产生，并调节相应pH值。
2.3. 试验方法
脲酶活性与碳酸钙生成量能直接反应影响因素的试验结果。本文采用5因素5水平正交试验进行EICP关键因素影响试验测试(表1)，考虑了脲酶浓度、胶结液浓度、脱脂奶粉浓度、pH值及培养时间共5种因素进行电导率测试和碳酸钙生成量试验。
电导率试验采用ST3100C型电导率仪(青岛精诚仪器仪表有限公司)进行测试，试验前需先调制不同浓度的脲酶溶液及胶结液，随后将3 ml脲酶溶液加入27 ml的不同浓度尿素溶液中混合，调制相应的pH值，在室温25℃，相对湿度50℃的情况下测试10分钟电导率的变化速率以得到脲酶活性。
CaCO3生成量采用酸洗法测试。先将20 ml相应浓度的胶结液溶液与脱脂奶粉于试管内进行混合，调整相应的pH值，然后与不同浓度20 ml脲酶溶液进行混合，控制室内温度为25℃、湿度为50%，在相应的培养时间下进行静置反应。到达预定时间后用滤纸对试管内的沉淀物进行反复过滤，用1 mol/L的盐酸对滤纸及试管进行充分酸洗后，将滤纸及试管放置在60℃的烘箱中烘干24 h，并用电子秤称量反应前后的试管及滤纸质量。
Table 1. EICP key factors orthogonal test
表1. EICP关键影响因素正交试验
3. 结果与分析
3.1. 脲酶浓度影响分析
脲酶浓度能直接影响脲酶活性及碳酸钙的生成量。图1为不同的脲酶浓度对脲酶活性与碳酸钙生成量的变化曲线。由图1(a)所见，随着脲酶浓度的增加，在60 g/L前脲酶活性呈线性增长趋势，在60 g/L后增加缓慢，这与文献 [16] 的研究结论一致。由图1(b)所见，碳酸钙生成量呈线性增加，这与文献 [13] 的研究结论一致。产生上述现象的主要原因在于增加脲酶浓度可提供更多活性催化剂分子，从而促进尿素的水解反应，产生更多氨和二氧化碳。增加的脲酶浓度有助于克服底物浓度限制效应，提高底物利用率，进而增加碳酸钙的产量。因此，通过增加脲酶浓度有效地提升了大豆脲酶活性，并促进碳酸钙的形成。
Figure 1. Curve of urease activity and calcium carbonate production with urease concentration
图1. 脲酶活性及碳酸钙生成量随脲酶浓度变化曲线
3.2. 胶结液浓度影响分析
胶结液的浓度能为EICP固化土壤提供必要的营养物质。图2为不同胶结液浓度对大豆脲酶活性与碳酸钙生成量的关系曲线。由图可见，随着胶结液浓度的增加，脲酶活性以及碳酸钙含量曲线发展规律基本一致，呈先上升后下降的趋势。这与文献 [17] 的研究结论一致。当胶结液浓度在0.8~1.4 mol/L时，脲酶活性以及碳酸钙含量出现较大幅度增长，当胶结液浓度为1.4 mol/L时，脲酶活性以及碳酸钙含量达到最大，随后曲线呈逐渐下降的趋势。产生上述现象的主要原因在于适量的胶结液浓度提供的反应底物会促进脲酶活性及碳酸钙生成量增长；而高浓度的胶结液会增加胶结液的粘稠度和黏度，从而限制了反应物的扩散能力，使得大豆脲酶与底物之间的有效接触变得困难，最终导致大豆脲酶活性的下降。
Figure 2. Urease activity and calcium carbonate production as a function of cementing fluid concentration
图2. 脲酶活性及碳酸钙生成量随胶结液浓度变化曲线
3.3. 脱脂奶粉浓度影响分析
图3为不同脱脂奶粉浓度与大豆脲酶活性以及碳酸钙生成量的关系曲线。由图可见，随着脱脂奶粉浓度的增加，脲酶活性以及碳酸钙含量曲线发展规律基本一致，呈先上升后下降的趋势。脱脂奶粉浓度在0~6 g/L时，脲酶活性以及碳酸钙含量出现较大幅度增长，当脱脂奶粉浓度为6 g/L时，脲酶活性以及碳酸钙含量达到最佳，当脱脂奶粉浓度大于6 g/L时，曲线呈逐渐下降的趋势。产生上述现象的主要原因在于溶液中加入较低浓度的脱脂奶粉可以起到一定的催化作用，促进碳酸钙生成的过程，进而导致大豆脲酶活性和碳酸钙生成量的增加；然而，随着脱脂奶粉浓度的进一步增加，溶液的粘度和浓度效应将限制反应物的扩散和酶与底物的有效接触，导致大豆脲酶活性和碳酸钙生成量的下降；因此，增加脱脂奶粉浓度在一定程度上可以促进大豆脲酶活性和碳酸钙生成量的增加，但超过一定浓度后可能产生抑制效应。
Figure 3. Curve of urease activity and calcium carbonate production with the concentration of skim milk powder
图3. 脲酶活性及碳酸钙生成量随脱脂奶粉浓度变化曲线
3.4. 培养时间影响分析
图4为不同培养时间下的大豆脲酶活性及碳酸钙生成量的变化曲线。由图可见，随着培养时间的增加，脲酶活性以及碳酸钙含量曲线发展规律基本一致，呈增长趋势。培养时间在1~4天时，脲酶活性以及碳酸钙含量出现较大幅度增长，当培养时间大于4天时，脲酶活性以及碳酸钙含量的曲线增长速率逐渐趋于平缓。产生上述现象的主要原因在于随着培养时间的延长，会出现多个关键因素的综合影响，包括反应平衡、酶底物比例的变化及抑制效应，导致其趋向于相对稳定的状态，大豆脲酶活性和碳酸钙生成量呈现先上升后趋于平稳的动态变化模式。
3.5. pH值影响分析
酸碱度对大豆脲酶活性以及碳酸钙生成量的影响较为显著，图5为不同pH值下大豆脲酶活性及碳酸钙生成量的关系曲线。由图可见，随着pH值的增加，脲酶活性以及碳酸钙含量曲线发展规律基本一致，呈先上升后下降的趋势。这与文献 [18] 的研究结论一致。当pH值在6~8时，脲酶活性以及碳酸钙含量呈上升趋势，当pH值大于8时，脲酶活性以及碳酸钙含量呈逐渐下降的趋势。随着溶液pH值的增加，大豆脲酶的活性和碳酸钙生成量表现出一个典型的酸碱效应曲线，即先升高后降低。在低pH区域，酸性条件下的催化剂稳定性增强，反应物的解离和转化速率增加，从而促进大豆脲酶的催化活性和碳酸钙的生成。然而，过高的pH值会导致大豆脲酶中氨基酸的质子化，破坏酶的活性位点的形成，从而抑制大豆脲酶的活性，限制了碳酸钙的生成量。
Figure 4. Curve of urease activity and calcium carbonate production with culture time
图4. 脲酶活性及碳酸钙生成量随培养时间变化曲线
Figure 5. Curve of urease activity and calcium carbonate production with pH value
图5. 脲酶活性及碳酸钙生成量随pH值变化曲线
3.6. 极差与方差分析
根据正交设计所得试验结果(表2)，本文采用了极差分析和方差分析方法对脲酶活性及碳酸钙生成量的主要和次要影响因素进行了分析(表3、表4)。极差分析与方差分析用于验证EICP脲酶活性及碳酸钙生成量的影响程度，并能得到最优组合，方差分析取0.05作为设定值。
Table 2. Orthogonal test results of EICP influencing factors
表2. EICP影响因素正交试验结果
极差分析结果如表3所示，脲酶浓度、胶结液浓度、pH值、脱脂奶粉浓度和培养时间这些因素对脲酶活性及碳酸钙生成量按影响程度排序为：脲酶浓度 > 胶结液浓度 > pH值 > 脱脂奶粉浓度 > 培养时间。通过数据观察得到最佳组合，即脲酶浓度为100 g/L，胶结液浓度为1.4 mol/L，脱脂奶粉浓度为6 g/L，pH值为8，培养时间为5天。
方差分析结果如表4所示，脲酶浓度和胶结液浓度对于脲酶活性和碳酸钙生成量的效应显著，而脱脂奶粉浓度、pH值以及培养时间的影响则较为轻微。方差分析中显著性因素的优先级高于极差分析中的R值。综上所述，根据前文中正交试验极差分析和方差分析的结果，各影响因素对脲酶活性和碳酸钙生成量的优先级顺序以及各因素的推荐水平，具体为脲酶浓度100 g/L，胶结液浓度1.4 mol/L，脱脂奶粉浓度6 g/L，pH值为8，培养时间为5天。
Table 3. Range analysis results of EICP influencing factors
表3. EICP影响因素极差分析结果
Table 4. Analysis of variance results of EICP influencing factors
表4. EICP影响因素方差分析结果
4. 结论与展望
本文围绕EICP技术中脲酶活性、CaCO3生成量与影响因素之间的关系进行了试验研究，基于五因素五水平正交试验设计对实验结果进行了极差分析与方差分析，同时分析了各因素对脲酶活性及碳酸钙生成量的影响规律，并确定了试验最优组合方案，主要结论如下：
(1) 脲酶活性与碳酸钙生成量呈线性增加，增加的脲酶浓度有助于克服底物浓度限制效应，提高底物利用率，进而增加碳酸钙的产量。因此，通过增加脲酶浓度有效地提升了大豆脲酶活性，并促进碳酸钙的形成。
(2) 增加胶结液浓度与脱脂奶粉浓度在一定程度上可以促进大豆脲酶活性和碳酸钙生成量的增加，但超过一定浓度后可能产生抑制效应。而培养时间的增加会让脲酶活性以及碳酸钙含量的增长速率逐渐趋于平缓。
(3) 通过正交实验极差与方差分析得到，对脲酶活性及碳酸钙生成量按影响程度排序为：脲酶浓度 > 胶结液浓度 > pH值 > 脱脂奶粉浓度 > 培养时间。通过数据观察得到最佳组合，即脲酶浓度为100 g/L，胶结液浓度为1.4 mol/L，脱脂奶粉浓度为6 g/L，pH值为8，培养时间为5天。
基金项目
本研究由省级大学生创新创业训练计划资助项目(S202312715038)资助。
NOTES
*通讯作者。