摘要: 目的：本研究旨在使用孟德尔随机化(Mendelian randomization, MR)的方法探究脓毒症患者28天死亡率与血浆代谢物之间的相关性。方法：脓毒症患者28天死亡相关数据来源于UK Biobank (486,484例)，代谢物数据来自加拿大老龄化纵向研究(CLSA)队列(8091名个体的1091种代谢物和309种代谢物比率)，均可从全基因组关联研究(GWAS)获取。使用R软件，采用逆方差加权法、MR-Egger回归、简单众数法、加权中位数法和加权众数等方法进行MR分析，并对结果进行异质性、多效性、敏感性分析。结果：本研究利用孟德尔随机化方法，对1400种代谢物与脓毒症28天死亡之间的因果关系进行了分析。通过IVW、MR-Egger、加权中位数、简单模式和加权模式五种方法的综合评估，共发现12种与脓毒症28天死亡显著相关的代谢物。其中，2-甲氧基间苯二酚硫酸盐(2-methoxyresorcinol sulfate)、1-(1-烯基棕榈酸酰基)-2-GPC (1-(1-enyl-palmitoyl)-2-oleoyl-gpc (p-16:0/18:1))和1-亚油酸酰基-2-花生四烯酸酰基-GPC (1-linoleoyl-2-arachidonoyl-GPC (18:2/20:4n6))被发现具有保护作用，而棕榈酰基鞘氨醇磷脂(Hydroxypalmitoyl sphingomyelin)则表现为危险因素。结论：研究发现多种代谢物显著关联于脓毒症的死亡风险，为其作为潜在生物标志物和治疗靶点提供了重要参考。这些发现可能为未来脓毒症的诊断与治疗策略优化提供新的研究方向和理论依据。
Abstract: Aim: The aim of this study was to investigate the correlation between 28-day mortality in sepsis patients and plasma metabolites using the method of Mendelian randomization (MR). Methods: The 28-day mortality data of sepsis patients were obtained from the UK Biobank (486,484 cases), and the metabolite data were from the Canadian Longitudinal Study on Aging (CLSA) cohort (8091 individuals with 1091 metabolites and 309 metabolite ratios), which could be obtained from genome-wide association studies (GWAS). Perform MR analysis using methods such as Inverse Variance Weighted (IVW), MR-Egger regression, Simple Mode, Weighted Median, and Weighted Mode, and conduct heterogeneity, pleiotropy, and sensitivity analyses on the results. Results: Using MR, this study analyzed the causal relationships between 1400 metabolites and 28-day mortality in sepsis. A comprehensive evaluation using five methods—IVW, MR-Egger, Weighted Median, Simple Mode, and Weighted Mode—identified 12 metabolites significantly associated with 28-day mortality in sepsis. Among these, 2-methoxyresorcinol sulfate, 1-(1-enyl-palmitoyl)-2-oleoyl-GPC (p-16:0/18:1), and 1-linoleoyl-2-arachidonoyl-GPC (18:2/20:4n6) were found to have protective effects, while hydroxypalmitoyl sphingomyelin was identified as a risk factor. Conclusions: This study identified several metabolites significantly associated with sepsis-related mortality risk, providing critical insights into their potential as biomarkers and therapeutic targets. These findings may contribute to future research on optimizing diagnostic and therapeutic strategies for sepsis, offering new directions for clinical practice and precision medicine.
1. 引言
脓毒症(Sepsis)发病机制复杂，是危重患者住院死亡的主要原因之一，具有高发病率和高死亡率，是当前重要的公共卫生问题。在中国，每年约有342.06/100,000人被诊断为脓毒症，住院死亡率高达25.2% [1] [2]。脓毒症是机体对感染反应失调引起危及生命的器官功能障碍的临床综合征[3]。其机制包括早期的促炎反应阶段和后期的免疫抑制阶段[4] [5]，以模式识别受体(如Toll样受体)识别病原分子模式为起点，通过激活NF-κB和中性粒细胞，引发促炎和抗炎介质释放[6]，经过一系列复杂的免疫反应最终导致多器官功能障碍[7]。尽管目前主要依靠抗生素、液体复苏及对症支持的治疗方案，脓毒症患者的预后改善有限，死亡率仍然居高不下。因此，亟需开发更加针对性和有效的干预手段来进一步改善患者预后。
近年来，血浆代谢产物在脓毒症发病机制和患者预后中的作用逐渐受到关注。研究发现，代谢产物的异常变化可能及时反映或影响脓毒症患者的炎症反应、免疫调节和多器官功能障碍[8]。例如，一些代谢物，如短链脂肪酸(SCFAs)能参与免疫调节、肠道屏障功能维持，而研究发现其在脓毒症中水平降低[9]；丙酮酸、乳酸等能量代谢的产物水平能反映脓毒症患者的代谢状态和能量缺乏问题[10] [11]；此外，诸如色氨酸、精氨酸等氨基酸的代谢产物则通过调节免疫反应和一氧化氮合成等途径，参与脓毒症的免疫失调和细胞功能障碍[12] [13]，这些代谢物的水平变化可能通过调控炎症因子和细胞代谢途径，影响脓毒症的进展和患者的死亡风险[14]。目前，随着代谢组学技术的不断发展，越来越多新的代谢物被陆续发现，并逐渐揭示它们与脓毒症之间的潜在联系。尽管这些代谢物的具体机制尚不明确，但它们在脓毒症中的潜在作用值得深入研究。
孟德尔随机化(Mendelian Randomization, MR)是一种基于遗传变异的因果推断方法[15]，本研究通过使用基因变异作为工具变量，评估代谢产物与脓毒症结局之间的因果关系，该方法能有效减少混杂因素和逆向因果关系的影响，是探讨代谢产物与疾病因果关系的强有力工具[16] [17]。通过孟德尔随机化分析，可以揭示代谢产物在脓毒症患者死亡中的潜在因果角色，为预防和治疗提供新的靶点和策略。
2. 材料与方法
2.1. 研究设计
本研究使用公开发表的循环代谢物和脓毒症死亡相关表型的GWAS数据，采用了变量孟德尔随机化方法，以探究循环代谢物与脓毒症之间的因果关系。
2.2. 数据来源
血浆代谢物数据来源于加拿大老龄化纵向研究(Canadian Longitudinal Study on Aging, CLSA)收集的数据/生物样本。CLSA参与者年龄在45岁及以上，特别关注65岁及以上的老年人群体。这一数据集包括来自加拿大老龄化纵向研究(CLSA)队列的8091名个体的1091种代谢物和309种代谢物比率。数据提取基于CLSA代谢组学数据(v1)、CLSA 基线数据集(v5)和基因组学数据(v3)进行。以上数据可于GWAS目录(https://www.ebi.ac.uk/gwas/)获取。
脓毒症28天死亡数据来源于英国生物银行(UK Biobank )发布的数据。标识符为“ieu-b-5086”(Sepsis-28 day death)。数据集包括来自欧洲人群队列的486,484个样本量及12,243,487个SNP，其中11,643人被诊断出患有脓毒症，28天死亡患者1896人。数据可于GWAS数据库(https://gwas.mrcieu.ac.uk/)获取。
在本研究中，我们使用的数据集为公开数据库中单一来源的代谢物数据，所有代谢物的测量单位一致，因此不需要额外的标准化处理，数据分析基于R语言及其相关分析包。
2.3. 工具变量筛选
为了筛选适合用于敏感性分析的SNP，本研究将与暴露相关的SNP的全基因组关联分析阈值设定为1 × 10−5。针对血浆代谢物相关的SNP，则采用了传统的GWAS标准(P < 5 × 10−8)。为保证数据质量，我们排除了含有较多缺失值的SNP，确保后续分析中的数据完整性。此外，为了剔除存在连锁不平衡的SNP，并减少多个基因位点等位基因共同出现在同一染色体上的可能性，我们参考欧洲人群(千人基因组计划数据)，计算了r2 (连锁不平衡度)和window (连锁不平衡区域长度)。在此基础上，分别设定r2 < 0.001和window > 10,000 kb作为筛选标准。同时，仅保留次要等位基因频率(MAF)大于0.01的SNP。
2.4. 孟德尔随机化方法
在进行MR分析时，统一暴露和结局的效应方向是必需的，以确保分析的一致性。本研究主要采用逆方差加权法(Inverse-variance weighted, IVW)进行分析，通过整合SNP效应值来获得总效应，固定效应模型适用于无异质性的情况，若存在异质性，则使用随机效应模型。此外，MR-Egger回归、加权中位数法、简单众数法和加权众数法等也作为补充方法[18]。在IVW方法的结果中，为了控制假阳性风险，采用FDR校正，并将q值 ≤ 0.05作为强因果关系的标准。为评估IV之间的异质性，我们使用Cochran’s Q检验，若P值 < 0.05，则认为存在显著的异质性。同时，水平多效性检验旨在检查工具变量是否与多个独立的生物学因素相关，若违反了MR的排他性假设，可能会影响结果的准确性。为了检测这一点，我们通过MR-Egger回归计算截距项，如果截距的P值 < 0.05，说明工具变量可能存在水平多效性。
在孟德尔随机化分析中，我们筛选了P值小于1 × 10−5的SNP，并涉及1091种代谢物及309种代谢物比率。为了确保分析结果的可靠性，使用了留一法敏感性分析法(Leave-one-out sensitivity test)剔除潜在异常值。
3. 结果
3.1. 孟德尔随机化结果
通过一系列筛选标准确定工具变量后，基于逆方差加权法、MR-Egger回归、简单众数法、加权中位数法和加权众数等五种MR方法分别对1400种代谢物和脓毒症28天死亡进行MR分析以探究其因果关系。我们采用IVW方法作为主要分析方法，显著性达到P < 0.01的结果被认为存在可信的潜在因果关联，共筛选得到12种与脓毒症28天死亡强相关的代谢物(图1)。其中4种呈正相关，8种为负相关。
其中2-甲氧基间苯二酚硫酸盐(2-methoxyresorcinol sulfate)，1-(1-烯基棕榈酰)-2-油酰甘油磷脂(p-16:0/18:1) (1-(1-enyl-palmitoyl)-2-oleoyl-gpc (p-16:0/18:1))，1-亚油酸酰基-2-花生四烯酸酰基-GPC (1-linoleoyl-2-arachidonoyl-GPC (18:2/20:4n6))是脓毒症28天死亡的保护因素，而棕榈酰基鞘氨醇磷脂(Hydroxypalmitoyl sphingomyelin)则是危险因素，这几种代谢物与脓毒症28天死亡存在显著的因果关系，在所有分析方法中包括主分析在内的4种以上分析方法中均显著，并表现出一致的效应方向，这些代谢物水平可能在影响脓毒症28天死亡中具有重要作用(表1)。
图注：Erythritol：赤藓糖醇；1H-indole-7-acetic acid：1H-吲哚-7-乙酸；2-methoxyresorcinol sulfate：2-甲氧基间苯二酚硫酸盐；Trans 3,4-methyleneheptanoate：Trans-3-(4-甲基苯甲酰)丙烯酸；1-(1-enyl-palmitoyl)-2-oleoyl-gpc (p-16:0/18:1) 1-(1-烯基棕榈酰)-2-油酰甘油磷脂(p-16:0/18:1)；1-linoleoyl-2-arachidonoyl-GPC (18:2/20:4n6)：1-亚油酸酰基-2-花生四烯酸酰基-油酰甘油磷脂(18:2/20:4n6)；Palmitoleoylcarnitine (C16:1)：棕榈酰肉碱；Hydroxypalmitoyl sphingomyelin (d18:1/16:0(OH))：羟基棕榈酰鞘氨醇；X-18888；1-stearoyl-2-arachidonoyl-gpc (18:0/20:4)：1-硬脂酰-2-花生四烯酰-GPC；Adenosine 5’-diphosphate (ADP) to aspartate：ADP/天门冬氨酸；Salicylate to taurocholate：水杨酸盐/牛黄胆酸钠。
Figure 1. Mendelian randomized forest maps of metabolites significantly associated with 28-day death in sepsis
图1. 与脓毒症28天死亡显著相关的代谢物孟德尔随机化森林图
Table 1. Main analysis results of significant metabolites in MR
表1. 显著代谢物的MRS主要分析结果
暴露 |
方法 |
SNP数 |
Beta值 |
P值 |
OR值 |
2-methoxyresorcinol sulfate |
Inverse variance weighted |
25 |
−0.157 |
0.0068 |
0.855 (0.764~0.958) |
|
MR Egger |
25 |
−0.193 |
0.0199 |
0.825 (0.709~0.959) |
|
Weighted median |
25 |
−0.161 |
0.0442 |
0.851 (0.727~0.996) |
|
Simple mode |
25 |
−0.056 |
0.7501 |
0.946 (0.674~1.327) |
|
Weighted mode |
25 |
−0.157 |
0.0495 |
0.854 (0.736~0.992) |
1-(1-enyl-palmitoyl)-2-oleoyl-gpc (p-16:0/18:1) |
Inverse variance weighted |
24 |
−0.265 |
0.0028 |
0.767 (0.644~0.913) |
|
MR Egger |
24 |
−0.339 |
0.1096 |
0.713 (0.479~1.061) |
|
Weighted median |
24 |
−0.285 |
0.0241 |
0.752 (0.587~0.963) |
|
Simple mode |
24 |
−0.556 |
0.0392 |
0.573 (0.348~0.944) |
|
Weighted mode |
24 |
−0.519 |
0.0497 |
0.595 (0.364~0.972) |
1-linoleoyl-2-arachidonoyl-GPC (18:2/20:4n6) |
Inverse variance weighted |
24 |
−0.212 |
0.0055 |
0.809 (0.697~0.94) |
|
MR Egger |
24 |
−0.151 |
0.324 |
0.85 (0.641~1.153) |
|
Weighted median |
24 |
−0.258 |
0.0126 |
0.773 (0.631~0.946) |
|
Simple mode |
24 |
−0.442 |
0.0414 |
0.643 (0.43~0.96) |
|
Weighted mode |
24 |
−0.293 |
0.0133 |
0.746 (0.602~0.924) |
Hydroxypalmitoyl sphingomyelin (d18:1/16:0(OH)) |
Inverse variance weighted |
31 |
0.196 |
0.0048 |
1.217 (1.062~1.395) |
|
MR Egger |
31 |
0.36 |
0.0174 |
1.434 (1.084~1.897) |
|
Weighted median |
31 |
0.265 |
0.0164 |
1.303 (1.05~1.618) |
|
Simple mode |
31 |
0.356 |
0.1386 |
1.428 (0.902~2.261) |
|
Weighted mode |
31 |
0.293 |
0.019 |
1.341 (1.063~1.69) |
森林图中显示了各代谢物在孟德尔随机化分析中的效应估计值(比值比及其95%置信区间)。工具变量选择了关联显著性P < 0.01的SNP。横轴表示比值比(Odds Ratio, OR)，点代表效应值，横线为其95%置信区间。中间的竖线为无效线(OR = 1)，表示暴露与结局之间无效效应的界限。置信区间未跨越无效线的代谢物提示可能具有显著的因果关联。
其他MR方法分析，绝大多数与主分析效应方向一致，巩固了因果关系的可靠性。代谢物与脓毒症之间的因果关系的散点图中，各MR分析方法得到的回归直线方向大致一致(图2)。
3.2. 敏感性分析
为了验证孟德尔随机化分析的稳健性，我们对潜在的多效性和异质性进行了敏感性分析。为了评估研究结果的稳健性，我们对潜在的多效性和异质性进行了敏感性分析。MR-Egger回归分析P值均大于0.05，提示我们得到的工具变量未表现出显著的多效性偏倚；同时，在异质性分析中，IVW法Cochran’s Q统计的P值均大于0.05，表明工具变量间无显著异质性(表2)。
进一步通过逐步排除分析(Leave-one-out analysis)，发现去除任何单个SNP后，效应估计值均未发生显著变化(变化范围为0.32~0.38)，表明结果不受单个异常值的显著影响(图3)。
图注：(A) Erythritol; (B) 1H-indole-7-acetic acid; (C) 2-methoxyresorcinol sulfate; (D) Trans 3,4-methyleneheptanoate; (E) 1-(1-enyl-palmitoyl)-2-oleoyl-gpc (p-16:0/18:1); (F) 1-linoleoyl-2-arachidonoyl-GPC (18:2/20:4n6); (G) Palmitoleoylcarnitine (C16:1); (H) Hydroxypalmitoyl sphingomyelin (d18:1/16:0(OH)); (I) X-18888; (J) 1-stearoyl-2-arachidonoyl-gpc (18:0/20:4); (K) Adenosine 5’-diphosphate (ADP) to aspartate; (L) Salicylate to taurocholate。
Figure 2. Mendelian randomized scatterplot of metabolites significantly associated with 28-day death in sepsis
图2. 与脓毒症28天死亡显著相关的代谢物孟德尔随机化散点图
图注：图中展示了留一法敏感性分析的结果，即每次移除一个工具变量(SNP)后重新计算效应估计值(点)及其95%置信区间(横线)。横轴表示效应估计值，竖线为无效线(β = 0)。结果显示，无论去除任何单个工具变量，效应估计值均无显著变化，提示研究结果具有稳健性，不受单一工具变量的显著影响。
Figure 3. The effects of individual instrumental variables on the estimates of causal effects were evaluated by exclusion analysis
图3. 留一法敏感性分析评估单个工具变量对因果效应估计值的影响
Table 2. Results of pleiotropic and heterogeneous analysis of related metabolites
表2. 相关代谢物的多效性及异质性分析结果
Outcomes |
Heterogeneity |
Pleiotropy |
P-value for Cochran’s Q |
Cochran’s Q statistic |
P-value for MR-Egger intercept |
Trans 3,4-methyleneheptanoate |
0.637 |
18.192 |
0.433 |
1H-indole-7-acetic acid |
0.828 |
20.943 |
0.884 |
X-18888 |
0.212 |
29.207 |
0.479 |
Salicylate to taurocholate |
0.831 |
8.184 |
0.981 |
1-stearoyl-2-arachidonoyl-gpc (18:0/20:4) |
0.776 |
17.658 |
0.692 |
Adenosine 5'-diphosphate (ADP) to aspartate |
0.229 |
27.656 |
0.639 |
Erythritol |
0.690 |
13.678 |
0.741 |
1-(1-enyl-palmitoyl)-2-oleoyl-gpc (p-16:0/18:1) |
0.772 |
23.998 |
0.199 |
Hydroxypalmitoyl sphingomyelin (d18:1/16:0(OH)) |
0.527 |
21.883 |
0.486 |
1-linoleoyl-2-arachidonoyl-GPC (18:2/20:4n6) |
0.130 |
42.252 |
0.472 |
2-methoxyresorcinol sulfate |
0.272 |
26.642 |
0.622 |
Palmitoleoylcarnitine (C16:1) |
0.773 |
16.819 |
0.460 |
4. 讨论
脓毒症作为一种严重的全身性炎症反应，涉及复杂的免疫、代谢和微生物相互作用。在脓毒症的发病过程中，代谢途径的改变扮演着至关重要的角色。本研究利用孟德尔随机化(MR)方法探讨了1400种代谢物与脓毒症28天死亡之间的因果关系。通过使用五种常见的MR方法(IVW、MR-Egger、加权中位数、简单模式和加权模式)进行分析，我们发现了12种与脓毒症28天死亡之间存在显著的因果关系的代谢物。
在得到的12种代谢物中，1-stearoyl-2-arachidonoyl-gpc (18:0/20:4)水平在IVW方法与简单众数法的效应估计则呈现相反方向，我们推测这种差异可能与工具变量的多效性或异质性有关。然而其异质性和多效性分析未显示显著结果，说明这一差异可能与两种方法的基本假设和工作原理有关。为了进一步验证这些结果，未来研究应考虑使用更多的工具变量、增大样本量并应用不同的统计方法进行敏感性分析，以确保结果的稳健性和可靠性。
然而，现有研究中针对这些代谢物的功能及其生物学机制的报道极少，尤其是与脓毒症的研究十分匮乏，因此我们对其在脓毒症发展中的作用机制仍无法得出明确结论。1-(1-烯基棕榈酸酰基)-2-GPC、1-亚油酸酰基-2-花生四烯酸酰基-GPC均是甘油磷酸胆碱的一种衍生物，从它们的结构可以推测该代谢物可能存在于细胞膜并与脂质代谢相关，前者被部分研究提及可能与胰岛素抵抗相关[19]，这提示其可能在脂肪酸代谢和糖代谢中发挥作用，进而影响脓毒症患者的代谢状态，后者则与骨质疏松相关[20]。
尽管我们的分析结果具有一定的稳健性，并通过多种方法进行了验证，仍然需要注意研究中的一些局限性。首先，尽管选择了P值小于0.01的工具变量并通过敏感性分析验证了结果的稳定性，但一些潜在的偏倚因素仍可能影响我们的结论。例如，某些工具变量可能存在与暴露不完全相关或较弱的关联，这可能导致结果的轻微偏差。其次，本研究依赖于欧美人群的数据集，这在一定程度上限制了研究结果的外部效度。脓毒症在不同地区和种族中的流行病学特征可能存在差异，尤其是在人种、基因背景、环境因素以及生活方式等方面有待更进一步的分层研究。
本研究仍为代谢物在脓毒症发展中的作用提供了新的视角，尤其是它们作为潜在生物标志物和治疗靶点的应用前景。为了进一步验证这些结果，未来的研究应特别关注代谢物在脓毒症个体化治疗中的潜在应用。通过深入探索特定代谢通路的改变，结合高通量代谢组学技术和精密医疗的进展，可能会为脓毒症的早期诊断、治疗策略优化以及个体化干预提供新的思路。同时，探索代谢物与免疫反应、微生物群落变化等因素的相互作用，将有助于揭示脓毒症的复杂机制，并推动代谢调节作为脓毒症治疗的新途径。相信随着技术的不断进步和研究的深入，代谢物作为脓毒症治疗的新靶点可能会迎来广阔的发展前景，为脓毒症患者带来更有效的治疗方法。
NOTES
*通讯作者。