基于TGF-β1/Smads信号通路探讨中医药治疗心脏纤维化

Study on the Treatment of Cardiac Fibrosis by Traditional Chinese Medicine Based on TGF-β1/Smads Signaling Pathway

摘要: 心脏纤维化是遗传性和获得性心血管疾病(Cardiovascular Disease, CVD)的最终常见病理，导致功能和电生理异常，并同时参与了各种疾病的发展与转归，长期以来一直被视为一种治疗靶点。现有多项研究证实转化生长因子-β (Transforming Growth Factor β, TGF-β)与下游Smad家族所介导的纤维化在心脏纤维化中起着关键作用。以此通路为靶点的中医药研究是目前逆转心脏纤维化的热点。因此，文章以TGF-β1/Smads信号通路为线索，概述近年来中药复方及单味药提取物干预该通路和上下游相关因子，以达到逆转心脏纤维化的作用机制，借以阐明中医药靶向治疗的作用及机制。

Abstract: Cardiac fibrosis is the ultimate common pathology of inherited and acquired cardiovascular disease (CVD), resulting in functional and electrophysiological abnormalities, and is simultaneously involved in the development and outcome of various diseases and has long been regarded as a therapeutic target. A number of studies have confirmed that transforming growth factor β (TGF-β) and downstream Smad family-mediated fibrosis plays a key role in cardiac fibrosis. Currently, the research of traditional Chinese medicine targeting this pathway focuses on reversing cardiac fibrosis. Therefore, in this paper, TGF-β1/Smads signaling pathway clues were used to summarize the mechanism of intervention of TCM compounds and single drug extracts in this pathway and related upstream and downstream factors in recent years to reverse cardiac fibrosis, so as to clarify the role and mechanism of targeted therapy of traditional Chinese medicine.

1. 引言

2022年全球因心血管疾病致死人数达1980万人，尽管至1990年以来全球年龄标准化CVD死亡率降低了34.9%，但是实际心血管疾病死亡人数却呈上升趋势，其也反应为患病人数的增加[1] [2]。虽然我国许多心血管技术已达到或接近世界领先水平，CVD死亡率得到明显控制，但在城乡居民疾病死亡构成比中，CVD占首位。随着人口老龄化加重，对其防治显得更有意义[3]。而在病情进展中，心脏纤维化是遗传性和获得性CVD的最终常见病理，最终导致功能和电生理异常。纤维化还参与了CVD相关疾病的发展与转归，长期以来一直被视为一种治疗靶点[4]。

2. TGF-β1/Smads信号通路在心脏纤维化发生发展中的作用

心脏纤维化是细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)蛋白在心脏组织中的过度沉积，ECM主要由I型胶原(Collagen I) (85%)和Ⅲ型胶原(Collagen Ⅲ) (11%)组成[5]。就纤维化转化来看，可分为两种：一是反应性纤维化，诱因为心脏对机械和神经激素压力增加的反应，可表现为血管周围纤维化与间质纤维化；二是修复性纤维化，其是对失去活力的组织形成疤痕的反应，可表现为心肌细胞损伤后的修复，其中心肌梗死是其最主要的原因[6] [7]。

在目前关于心脏纤维化机制的研究中，提示转化生长因子-β (Transforming Growth Factor β, TGF-β)在心脏纤维化中起着关键作用[8]-[10]。TGF-β分别有TGF-β I型受体(TGFBR1)和TGF-β Ⅱ型受体(TGFBR2)。TGF-β1首先结合TRⅡ，诱导其磷酸化后再与TRI结合，形成二聚体的复合物，然后该活性复合物会使受体调节型Smads蛋白(Smad2/3)磷酸化，再与结合型Smads蛋白(Smad4)结合形成Smads复合物，接着转位到细胞核，诱导基因转录[11]。

TGF-β1在结缔组织、内皮细胞和造血细胞中普遍表达[12]，但正常情况下表达量较稳定，且受smad6、smad7负反馈调节，其可竞争性地结合TGF-β受体，阻止Smads蛋白磷酸化，对TGF-β1/Smads信号传导具有阻断作用，抑制纤维化产生[13]。而当TGF-β1过度表达后可激活下游Smad-2/3信号，增加Smad2/3表达，促进Smad2/3磷酸化和核转位，刺激心脏成纤维细胞(Cardiac Fibroblasts, CFs)分化、增殖和细胞外基质蛋白合成，导致纤维母细胞引起细胞外基质的过度沉积，从而促进纤维化形成，诱导细胞凋亡，导致心肌纤维化、心肌梗死等[14]-[16]。

基于TGF-β1/Smad2/3这一传导路径，目前临床上有少量靶向TGF-β信号治疗纤维化的药物(例如，TGF-b3、卵泡抑素、BMP-7、吡非尼酮)，但使用存在诸多限制，且这些小分子抑制剂的混杂性质使它们更容易产生副作用，因此仍然缺乏有效的抗纤维化治疗方法[4] [10] [17]。这里将探讨近几年中药复方制剂及单味药提取物干预TGF-β1/Smads 通路及通路上下游相关因子如何改善心脏纤维化，为阐明中医药的作用机制提供新策略。

3. 中药复方调控TGF-β1/Smads信号通路治疗不同诱因下的心脏纤维化

3.1. 高血压

高血压导致的压力过载介导形成反应性纤维化，其表现为弥漫性粗胶原纤维主要沉积在间质区和心内血管周围，肌内膜单个心肌细胞周围有细胶原纤维带，肌膜周围有成束的心肌细胞[18]。补阳还五汤出自《医林改错》具有“补气，活血，通络”之功，常用于偏瘫、肢体麻木，但现也多治疗辨证为气虚有瘀的诸多疾病。Chen等[19]研究发现补阳还五汤组相较于主动脉弓缩窄(Transverse Aortic Constriction, TAC)模型组，在Masson染色下显著抑制了心脏胶原沉积，且抑制了Tgf-β/Smads和MAPKs信号激活，使Smad3失活，并使MAPKs去磷酸化，减轻压力过载诱导的反应性纤维化，从而抑制心脏重塑，并部分逆转了心脏纤维化、改善了心脏功能。黄芪作为补阳还五汤君药，其黄芪、当归比值为20:1。基于组方重用黄芪这一特点，进一步研究发现，作为黄芪主要成分之一的黄芪甲苷(Astragaloside IV, ASIV)，对纤维化的进展有明显抑制效果。李佳莘等[20]在异丙肾上腺素(Isoprenaline, ISO)诱导的SD大鼠心脏纤维化中，大鼠予40 mg/kg的黄芪甲苷治疗后，组织形态学观察下心肌纤维化程度较模型组减轻，且ASIV组与ISO组相比其TGF-β1、Smad2/3、Smad4表达降低，而Smad7表达增高。在该实验的基础上，李佳莘进一步加入针刺“内关”穴后发现，与普萘洛尔组相比，ASIV组的Smad2/3、Smad4表达较多，而Smad7较少(P < 0.05)，且TGF-β1差异无统计学意义；但是在ASIV + 针刺“内关”组的效果却与普萘洛尔组相似(P > 0.05) [21]。Wei等[22]研究发现ISO诱导的心脏纤维化中黄芪甲苷显著降低瞬时感受器电位M7的电流，以及mRNA和蛋白质的表达，并且TGF-β/Smads通路被抑制，同时α-SMA和I型胶原蛋白的表达也明显降低，提示TGF-β/Smads的激活与瞬时感受器电位M7的升高之间有正反馈关系。除了黄芪甲苷，作为主要活性成分之一黄芪多糖(Astragalus polysaccharide, APS)也表现出明显抗纤维化作用。张石在等[23]发现在TAC模型中，以每天0.1 mL∙(10 g)^-1 APS干预下，PRS染色显示APS干预对TAC诱导的心肌组织纤维化具有显著的保护作用，且TGF-β1的表达水平较TAC组显著降低。此外，方中其他成分诸如环黄芪醇、当归多糖、红花黄色素等被发现对降低TGF-β的表达抑制纤维化有不同程度的作用。

被誉为“伤寒第一方”、“群方之首”的桂枝汤，通过加减变化被广泛用来治疗内、外、妇、儿多种疾病，临床上在高血压、冠心病等心血管疾病中也有明显疗效。全方由桂枝、芍药、生姜、大枣、炙甘草5味药组成，方药量少严谨[24] [25]。陈纪烨等[26]对方中桂枝与白芍不同比例配伍，去调节TGF-β1/Smads信号通路改善盐敏感高血压大鼠心肌纤维化，结果显示Masson染色下，相较模型组，桂枝汤各组胶原沉积程度减轻；桂枝汤各组Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性面积较模型组表达减少；TGF-β1、Smad2/3、α-SMA蛋白表达明显降低，且Smad7蛋白表达显著增高(P < 0.01)。就实验中桂枝与白芍比例结果差异显示，上述指标中，桂芍1∶1组改善均优于桂芍1:2、2:1组。

Su等[27]在研究压力过载介导的心脏纤维化的过程中发现，四妙勇安汤(Si-Miao-Yong-An Decoction, SMYAD)除了具有传统治疗热毒脱疽的功效，还发现其抑制了TAC诱导的TGF-β1蛋白和mRNA表达，SMYAD还抑制了p-Smad2和p-Smad3水平，提高了Smad7的表达。总的研究发现MNYAD不仅抑制了TGF-β1/Smad，还抑制了TGF-β1/TAK1/p38通路发挥抗纤维化作用。此外，SMYAD还通过调节基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases, MMPs)及组织金属蛋白酶抑制物(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase, TIMPs)的平衡来保护心脏纤维化和胶原蛋白的合成。方中药物金银花、玄参、当归和甘草按重量比3:3:2:1组成，既往研究报道证实金银花及其提取物能抑制肺、肝脏的纤维化[28] [29]，然而对其在心脏纤维化中的作用未有研究报道。

3.2. 心肌梗死

心肌纤维化是心肌梗死(Myocardial Infarction, MI)后心脏重构的病理生理状态，MI促进心肌成纤维细胞增殖和细胞外胶原沉积，最后导致心力衰竭。桃红四物汤是治疗血虚血瘀证的经典名方，是在“血证立法”之称的四物汤基础上，加桃仁、红花。Tan等[30]通过永久结扎小鼠LAD冠状动脉诱导心肌缺血和心室重构后，连续给予低、中、高剂量(50, 100, 200 mg/kg/day)桃红四物汤28天。与假手术组比较，模型组左室舒张末期内径(Left Ventricular End-Diastolic Dimension, LVD)、左心室收缩末内径(Left Ventricular End-Diastolic Dimension, LVS)的超声心动图参数明显升高，射血分数(Ejection Fraction, EF)、左心室短轴缩短率(Fractional Shortening, FS)明显降低，提示心功能受损。桃红四物汤治疗呈剂量依赖性，提高心肌梗死后整体心功能指数(EF, FS) (P < 0.01)。Masson染色显示模型组大鼠胶原沉积增多，桃红四物汤治疗以剂量依赖性方式抑制心肌梗死诱导的胶原沉积和心肌纤维化(P < 0.01)。qPCR分析显示模型组心肌梗死区TGF-β1和TGFBR1 mRNA水平显著上调，而高剂量的桃红四物汤强烈抑制其上调(P < 0.01)。免疫组化显示MI上调了TGFBR1和Smad3的表达，而高剂量桃红四物汤治疗显著抑制了它们的表达(P < 0.01)。胶原表达上，模型组I、III型胶原的表达显著升高，α-SMA上调，而高剂量桃红四物汤明显抑制其上调(P < 0.01)。检测CFs的增殖活性中发现桃红四物汤显著抑制TGF-β1诱导的CFs增殖，依旧呈剂量依赖性(P < 0.05)，这些结果一致表明，桃红四物汤抑制TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞增殖。但是桃红四物汤对胶原表达、Smads激活、CFs增殖的抑制依旧会被TGFBR1的过表达部分消除。对于药物组成研究发现，桃红四物汤中的芍药苷(Paeonia tacti lora Pall.)可通过调节MAPK信号通路，减轻高血压下心肌纤维化和炎症，逆转心脏重塑，改善左室功能[31]。

“心下逆满，气上冲胸，起则头眩，脉沉紧；发汗则动经，身为振振摇者，茯苓桂枝白术甘草汤主之”，苓桂术甘汤首见于《伤寒论》第67条，同样作为经典名方，在太阳伤寒、饮停胸胁心下及中阳不振等证候颇有奇效。Wang等[32]发现苓桂术甘汤(Linggui Zhugan Decoction, LZD)改善了左前降支冠状动脉结扎后的模型老鼠的血流动力学功能障碍，蛋白表达量上，LZD组和辛伐他汀组的TGF-β1、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3表达均显著低于模型组(P < 0.01)。mRNA表达量上LZD组和辛伐他汀组心肌TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达量均显著或极显著低于模型组(P < 0.01或P < 0.05)。与模型组相比，LZD阻断心肌中Ⅰ和Ⅲ型胶原的过度表达(P < 0.01)。

在治疗心梗与纤维化的研究中，不仅经方表现出明显效果，对于一些中成药及经验方的研究也有发现。冠心合剂V (Guanxin V, GXV)作为南京市中医院自制制剂，Zhang等[33]发现，GXV可以通过使RASS系统失活来延缓心室重构过程。对于其潜在分子机制的研究，Liang等[34]发现GXV可以减轻心肌肥厚，并抑制TGF-β1表达，抑制了纤维化的进展，从而逆转心室重构。此外发现波形蛋白(Vimentin)与TGF-β1存在相互作用，且这种相互作用在病理性重塑中增加，在GXV中得到抑制。在中成药活心丸(Huoxin Pill, HXP)对MI纤维化的研究上，发现其减轻了MI的炎性浸润和胶原沉积，并下调了TGF-β1和p-Smad2/3的表达，但总的Smad2/3蛋白水平却保持不变[35]。

3.3. 房颤

房颤(Atrial Fibrillati, AF)产生的重要因素之一是心房结构的重塑，而心房纤维化是其中一种特征性变化，其与结构重塑密切相关，同时有研究发现，房颤的发生也进一步加重心房纤维化，两者相互相成[36] [37]。颜晓睿等[38]通过建立“痰浊血瘀”型阵发性房颤(Paroxysmal Atrial Fibrillation, PAF)大鼠模型，观察基于“痰瘀生风”理论基础上的复方制剂对PAF纤维化的影响。发现透射电镜下，模型组除了肌小节断裂，还存在“Z”带不连续、排列紊乱，“I”带不清、肌丝断裂、可见空隙。而高剂量中药组中，其心房肌细胞肌小节仅轻度断裂，排列相对整齐，肌丝稍溶解，其结构完整程度呈浓度依赖型。且各用药组的α-SMA、Smad-3、Smad-2、TGF-β蛋白表达水平均下降(P < 0.05)。在其方药活性成分上，方中苦参的苦参碱和氧化苦参碱在过去研究中发现两者都能明确抑制TGF-β1诱导下心脏纤维化的发生，苦参碱还可以改善左心房的传导速度和均匀性[39] [40]。

房颤的形成是一个由复杂的多因素导致的过程，而左心房纤维化程度是房颤复发和相关疾病风险的良好预测因素[41]。在防治房颤纤维化的中药复方中，发现一些小复方制剂也有明显疗效，如丹七胶囊(Danqi Soft Capsule, DQ)由丹参和三七两味中药的基础配方制成[42]，在对心肌梗死诱发心衰大鼠房颤的研究中发现，与模型组相比，DQ降低房颤的诱发率和持续时间(P < 0.05)，且Masson染色显示DQ治疗也明显减轻了心肌纤维化(P < 0.01)，实验证明DQ能通过TGF-β1/Smad3途径抑制肌成纤维细胞的分化，调节CFs抑制左心房重塑，降低MI后大鼠的房颤易感性，此外还发现DQ通过诱导细胞周期停滞在S期来抑制CFs的增殖。DQ虽然仅两味药物组成，但其有效成分包括丹参酚酸A、丹参酚酸B、丹参酮IIA、隐丹参酮、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1等。因此，推测DQ的抗心肌纤维化作用是由多种活性成分产生的。

3.4. 心衰

心力衰竭(Heart Failure, HF)是各种心血管疾病的终末期表现，按射血分数划分可分为射血分数降低性心力衰竭和射血分数保留性心力衰竭(HFpEF, LVEF ≥ 50%)。左心室重塑和舒张功能障碍已被公认为是HFpEF的基本病理生理机制，心肌纤维化是其重要原因。Shi等[43]通过化裁伤寒论苓桂术甘汤，提出Ling-Gui-Qi-Hua (LGQH)汤，组方为茯苓、肉桂、赤芍、白术。临床前研究显示LGQH能显著缓解HFpEF大鼠的左心室结构重塑和舒张功能障碍。实验发现LGQH可减轻HFpEF大鼠的左心室重塑，包括左心室肥厚和扩大(P < 0.01)，且心肌间质和血管周围区域广泛的胶原沉积被逆转(均为P < 0.05或0.001)。mRNA及蛋白表达上LGQH可显著降低TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、α-SMA、I型胶原和III型胶原mRNA表达以及TGF-β1、Smad4、Smad2、Smad3和P-Smad2/Smad3、α-SMA和I型胶原蛋白表达，并且上调了Smad7 mRNA和蛋白表达(均为P < 0.05、0.01或0.001)，上述结果高剂量和低剂量LGQH组的疗效相似。表明LGQH能缓解HFpEF大鼠心肌间质和血管周围纤维化。

在慢性心力衰竭(Chronic Heart Failure, CHF)的治疗中，Zhang等[44]研究发现麝香通心滴丸(Shexiang Tongxin Dropping Pill, STDP)降低了TGF-β和Smad3的蛋白表达水平，这与Masson染色结果一致。此外STDP治疗完全阻断了ERK1/2的磷酸化，导致肥大心肌细胞体积缩小。由于炎症与CHF的进展有关，该实验发现大量炎症通路在STDP治疗后明显富集。

4. 中药成分调控TGF-β1/Smads信号通路治疗心脏纤维化

当归在中药中被广泛运用，又称“十方九归”，因其补血活血的特性，在心血管疾病也得到普遍应用，且有明显疗效。结合现代药理学发现，其主要活性成分包括酞类、单萜、倍半萜、芳香族化合物、脂肪烃及其衍生物、多糖、有机酸和其他化学成分[45]。但是现在的研究发现具有抗纤维化活性成分的只有当归多糖(Angelica Sinensis Polysaccharide, ASP)。Song等[46]通过ASP治疗高血压性心脏病(HHD)大鼠发现，ASP治疗组免疫荧光检测结果显示相较于模型组的过度表达，明显降低了TGF-β1和α-SMA表达量。在Masson染色中，模型组大鼠的心肌间质中发现了明显增粗的肌纤维和明显的心肌纤维化，而这种心肌纤维化在使用ASP治疗后呈剂量依赖性减轻。并且ASP使得HHD大鼠的EF和FS明显提高，并且显著降低LVD、LVS、左心室收缩末期容积(ESV)、左心室舒张末期容积(EDV)。值得注意的是上述结果中，存在明显剂量依赖性，其结果在高剂量中更为显著(P < 0.01)。

人参作为中医药治疗心慌、心悸的代表药物，其代表方诸如生脉饮、参附汤、保元汤、参蛤散等在临床也频繁使用，而人参皂苷Rg3是中药人参中的一种天然三萜类皂苷，人参皂苷Rg3有S和R光学异构体[47]。就物理性质和生物活性而言，20(S)异构体比20(R)异构体的溶解度更高，生物利用率更好[48]。Xu等[49]的研究发现，20(S)-人参皂苷Rg3改善了心脏功能和心肌梗死后纤维化，以及心肌梗死后的心脏功能并抑制胶原沉积，运用SPRi技术评估Rg3与TGFBR1的结合机制，分析得出Rg3与TGFBR1重组蛋白结合迅速，其平衡解离常数(KD)为1.78 × 10⁻⁷ M，表明其具有良好的结合亲和力。Rg3不但明显抑制了Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的上调，WB检测还显示其显著降低了TGFBR1、Smad2和Smad3磷酸化水平。IHC分析发现，Rg3可剂量依赖性地降低梗死心肌中TGFBR1、p-Smad2和p-Smad3的水平。并且研究还发现心肌Tgfbr1基因缺失逆转了Rg3对TGFBR1通路相关蛋白水平的抑制作用。接着发现Tgfbr1的基因缺乏抵消了Rg3对心功能不全和心肌纤维化的保护作用，反映了Rg3对心脏纤维化和心功能的保护作用依赖于TGFBR1。

附子首见于《神农本草经》，其“大辛，大热”常为回阳救逆之功，现多用于心衰、肾病综合征等病症，但由于其有大毒“重者必死”等不良反应，临床上常用干姜、肉桂代替。但历代著名医家不仅用附子也善于运用附子治疗一些疑难病症。现代药理研究中，Ling等[50]发现白附片煎剂(Decoction of White Aconite, DWA)在ISO诱导的大鼠心脏纤维化模型实验中，DWA相较模型组显著抑制了心肌纤维断裂程度，并且降低了炎性浸润，减少了胶原积累，并提高EF、FS。且蛋白水平表达上相较模型组DWA明显抑制p-Smad2/3 (P < 0.01)。研究还发现DWA通过半乳糖代谢参与心脏纤维化代谢紊乱的调节。

随着现代药理学的发展，逐渐发现植物miRNA对哺乳动物靶基因具有跨界调控作用[51]，这使得一些传统药物的用途有了新的发现。Zhang等[52]发现尖叶假龙胆(Gentianella acuta (Michx.))中提取的活性成分山酮类化合物Hiitonen (Gentianella acuta)能减轻心脏成纤维细胞的炎症反应从而抑制心脏纤维化。研究团队从提取来的Gentianella acuta中分离总RNA，并选取Gen-miR-1进行外源性给药后发现可抑制小鼠胶原积累并改善ISO诱导的心脏纤维化，并且Gen-miR-1通过抑制心脏组织或CFs中I、III型胶原和α-SMA的表达，抑制了ISO/TGF-β1诱导的心脏纤维化和肌成纤维细胞活化。通过转染Gen-miR-1发现其可显著抑制TGF-β1在蛋白和mRNA中上调IL-6、IL-1β和TNF-α的表达，并抑制TGF-β1诱导ROS的生成。

5. 结论

通过TGF-β1/Smads信号通路，概述了近年来国内外中药复方及单味药物对心脏纤维化的干预作用，许多研究已经肯定了中医药具有调节TGF-β1/Smads通路及通路上下游相关信号因子，从而逆转心脏纤维化的作用。研究结果也显示纤维化的产生不单单局限于该通路，其他诸如炎性因子和miRNA等也在发挥着作用，体现了中医药治疗心脏纤维化具有多途径、多通道的优势。上述中医药复方及单味药成分通过聚焦于调控TGF-β1/Smads通路，抑制性调节Smad家族中smad2/3/4蛋白和mRNA的表达及相关蛋白磷酸化水平，提高激活负反馈因子Smad7表达，最终抑制CFs分化、增殖和ECM过度沉积，并通过正向调节作用逆转心脏纤维化的发生发展。综合既往研究肯定了中医药治疗心脏纤维化方面的积极作用，不仅通过实验解释了临床疗效，也发现一些药物在动物实验中呈现剂量依赖性，而有的却相反，这为临床诊治提供诊治新思路。