磁性多壁碳纳米管净化技术快速测定水中多种抗生素残留

Quick Determination of Antibiotics Residues in Water Samples by Magnetic Multiwalled Carbon Nanotubes Cleaning Technology

摘要: 采用磁性多壁碳纳米管-超高效液相色谱/质谱/质谱(UPLC/MS/MS)技术测定水样中23种抗生素残留量。水样基质中的23种抗生素药物先采用磁性多壁碳纳米管(MWCNTs)富集和净化，再用5%的氨水甲醇溶液脱附，23种化合物以CORTECS^TM C₁₈₊色谱柱分离，甲醇和0.1%的甲酸水溶液作为流动相，采用电喷雾正离子(ESI+)和多反应监测模式(MRM)分析，外标法定量。23种抗生素在0.5~50 μg/L的浓度范围内线性相关系数均大于0.99，检出限为0.01 μg/L，定量限为0.03 μg/L。在0.05、0.5、10 μg/L不同浓度水平下，23种抗生素的平均回收率在87.5%~105.8%之间，相对标准偏差在0.3%~4.2%之间。由于该技术简便、快速、灵敏度高，适用于水中23种抗生素残留的快速测定。

Abstract: A method was established for determining 23 antibiotics residues in water samples by magnetic multiwalled carbon nanotubes and ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC/MS/MS). The 23 antibiotics in water samples were first enriched and cleaned up by magnetic multiwalled carbon nanotubes, and then eluted with ammonium hy-droxide-methanol (5:95, v/v). The target antibiotics were separated by Waters CORTECS^TM C₁₈₊ column using methanol and 0.1% formate in water as mobile phases. The analytes were detected by positive electrospray ionization with multiple reaction monitoring. External standard method was used to determine the quantity. In the linear range of 0.5~50 μg/L, the correlation coefficients of 23 antibiotics were greater than 0.99, the limit of detection (LOD) was 0.01 μg/L, and the limit of quantitation (LOQ) was 0.03 μg/L. The mean recoveries at the three spiked levels of 0.05, 0.5, 10 μg/L were 87.5%~105.8%. The relative standard deviation (RSD) was 0.3%~4.2%. The simplicity, sensitivity and good precision of the method made it be well suitable for quick determination of the 23 antibiotics residues in water samples.

1. 引言

近年来，抗生素药物在畜牧业和渔业的养殖及饲养中发挥着重要的作用。由于摄入的抗生素会通过各式各样的途径进入环境，因此，抗生素残留极大地污染并破坏了人类生存的资源和空间 [1] [2] [3] 。

目前，有报道饮用水中被一些抗生素药物所污染，由于水体中含量低、抗生物药物种类繁多，好的前处理技术显得尤为重要。分散固相萃取(QuEChERS)技术是多残留检测中普遍使用的前处理净化技术 [4] [5] [6] ，由于该技术不能将水体浓缩，直接影响检测灵敏度。HLB固相萃取小柱对水样中药物的富集和净化效果较好 [7] [8] [9] ，但是HLB是商品化的固相萃取小柱，价格昂贵，试验成本较高。多壁碳纳米管作为一种新材料，具有较强的吸附和富集能力，能有效地吸附有机化合物，在固相萃取领域具有广泛的应用前景 [10] [11] [12] 。

本试验将多壁碳纳米管材料应用于水样中多种药物残留的快速检测，所建立的方法简单、方便，具有一定的实用意义。

2. 材料与方法

2.1. 主要仪器与装置

超高效液相色谱–串联质谱仪：美国Waters公司(Xevo^TM TQ-S系列)；Milli-Q超纯水器：美国Millipore公司；涡旋混合器：太仓市华利达实验设备有限；氮气吹干仪：天津市恒奥科技有限公司。

2.2. 主要材料与试剂

甲醇、乙腈、甲酸：色谱纯，德国Merck公司；氨水：分析纯，国药集团化学试剂有限公司； MWCNTs：纯度 > 97%，直径40 - 60 nm，长度5 - 15 μm，深圳市纳米港有限公司。

磺胺醋酰(纯度 ≥ 99.5%)，磺胺嘧啶(纯度 ≥ 99.5%)，磺胺甲基嘧啶(纯度 ≥ 99.2%)，甲氧苄胺嘧啶(纯度 ≥ 99.5%)，磺胺恶唑(纯度 ≥ 98.5%)，磺胺二甲嘧啶(纯度 ≥ 99.0%)，磺胺对甲氧嘧啶(纯度 ≥ 98.0%)，磺胺甲氧哒嗪(纯度 ≥ 99.2%)，磺胺-6-甲氧嘧啶钠纯度 ≥ (99.0%)，磺胺氯哒嗪(纯度 ≥ 99.0%)，磺胺邻二甲氧嘧啶(纯度 ≥ 99.5%)，磺胺甲基异恶唑(纯度 ≥ 99.0%)，磺胺二甲异恶唑(纯度 ≥ 98.0%)，苯甲酰磺胺(纯度 ≥ 98.8%)，磺胺间二甲氧嘧啶(纯度 ≥ 99.5%)，磺胺喹恶啉(纯度 ≥ 98.0%)，羟基甲硝唑(纯度 ≥ 99.5%)，甲硝唑(纯度 ≥ 99.5%)，羟基二甲硝基咪唑(纯度 ≥ 99.0%)，二甲硝基咪唑(纯度 ≥ 99.0%)，洛硝哒唑(纯度 ≥ 99.0%)，羟基异丙硝唑(纯度 ≥ 99.0%)，异丙硝唑(纯度 ≥ 99.0%)，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司产品。

2.3. 试验条件

2.3.1. 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC CORTECS^TM C₁₈₊柱(2.1 mm × 100 mm，粒径1.6 μm)；柱温：30℃；样品温度：20℃；进样体积：5 μL；流速：0.2 ml/min；流动相：0.1%甲酸水溶液(A)，甲醇(B)；梯度洗脱程序：0 - 4 min，80%A；4 - 7 min，80%~60%A；7 - 10 min，60%A；10 - 13 min，60%~80%A；13 - 16 min，80%A。

2.3.2. 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子模式；检测方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压为3.00 kV，离子源温度为150℃，脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流量为1000 L/h。

2.4. 磁性多壁碳纳米管的制备

称取2 g 多壁碳纳米管于250 mL单口烧瓶中，加入150 mL浓硫酸和浓硝酸的混合溶液(体积比为1:2)，超声1 h后移入恒温油浴槽中，再120℃回流1 h，冷却静置后去除上层酸液，用超纯水反复洗至中性，烘干后研磨成细粉末。

取1.0 g上述制备好的MWCNTs于200 mL硫酸铁氨和硫酸亚铁氨的混合溶液中，在氮气保护下逐滴加入氨水使溶液的pH控制在11 - 12，于 50 ℃ 下搅拌反应30 min。反应完后用磁铁将磁性MWCNTs分离出来，去离子水洗涤后真空干燥。

2.5. 样品前处理

量取100 mL水于烧杯中，加入50 mg磁性MWCNTs，用玻璃棒搅拌均匀，放置30 min后用磁铁吸出磁性MWCNTs，弃去水溶液，在磁性MWCNTs中加入6.0 mL 5%的氨水甲醇溶液，放置5 min后用磁铁吸出磁性MWCNTs，洗脱液于45℃下氮吹至近干，加入1 mL乙腈-水(V: V = 1:9)溶解，涡旋混合1 min，过0.22 μm微孔滤膜后，于UPLC-MS-MS仪上分析。

3. 结果与讨论

3.1. 色谱条件的优化

高效的色谱柱是多残留分析的前提，本试验选用Waters ACQUITY UPLC CORTECS^TM C₁₈₊ (2.1 mm × 100 mm，1.6 μm)色谱柱来分离23种抗生素化合物，此色谱柱对各化合物具有较强的保留，各色谱峰峰形较好，并得到了有效的分离，减少了杂质的干扰。

由于磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪和磺胺-6-甲氧嘧啶是三种同分异构体，选择乙腈作为强洗脱流动相时，三种化合物不能得到很好的分离，而选用甲醇作为流动相时，不仅峰形对称，三种磺胺同分异构体均得到了很好的分离，故本试验采用甲醇作为强洗脱流动相。由于酸能增加物质在ESI+模式下的离子化效率，改善峰形。本试验分别配制0.05%，0.1%和0.2%的甲酸水溶液作为流动相，经试验表明0.1%的甲酸水溶液体系灵敏度最高。

3.2. 质谱条件的优化

分别优化各种化合物的毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量和选择离子等参数，并选取丰度较高的两个子离子作为定量和定性离子，确定监测离子的最佳碰撞能量。具体参数见表1。根据23化合物的出峰时间，同时设置3个MRM通道，尽量使保留时间接近的化合物设置在不同的通道中，避免相互干扰，23种抗生素药物的总离子流图如图1所示。

Table 1. Mass conditions of antibiotics

表1. 抗生素药物的质谱条件

*离子对为定量离子对。

Figure 1. TIC of antibiotics

图1. 抗生素药物的总离子流图

3.3. 水样pH值的影响

分别调节超纯水pH值2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，加入23种抗生素混合标准品后进行回收率试验，试验结果表明，pH值为4.0 - 8.0时，各种抗生素的回收率差别不大，当酸性或碱性时，部分抗生素的回收率有一定的影响。在实际试验中，由于水样的pH值一般介于4.0 - 8.0之间，不需要进行pH值得调节。

3.4. 磁性多壁碳纳米管性能的优化

3.4.1. 吸附剂用量

分别研究10 mg、25 mg、50 mg、75 mg和100 mg不同用量的磁性MWCNTs对23种抗生素药物的吸附性能。结果表明：随着磁性MWCNTs量的增加，对23种抗生素药物的吸附能力也随之增加，当磁性MWCNTs使用量为50 mg时，所有的抗生素药物能被完全吸附，再加大磁性MWCNTs量时，吸附在上面的抗生素很难被洗脱下来，增加的洗脱剂溶液量会影响试验的回收率。因而，本试验中磁性多壁碳纳米管的使用量为50 mg。

3.4.2. 吸附剂时间

分别对5 min、10 min、20min、30 min、40 min和50 min不同的吸附时间进行研究，随着吸附时间的增加，抗生素的吸附量也随之增加，当吸附时间为30 min时，水中所有的抗生素药物能被完全吸附，因而，本试验的吸附时间选定为30 min。

3.4.3. 洗脱溶剂

分别选择甲醇、5%的氨水甲醇、乙酸乙酯、丙酮作为洗脱溶剂，试验结果表明：5%的氨水甲醇溶液洗脱能力最强，随着洗脱溶液体积的增加，各种抗生素药物的回收率也随之增加，当使用6.0 mL 5%的氨水甲醇溶液时，各种抗生素药物的回收率趋于平衡，因而，本试验选择6.0 mL 5%的氨水甲醇溶液作为洗脱溶液。

3.5. 方法学验证

3.5.1. 标准曲线、检出限和定量限

取浓度分别为0.5，5，10，25，50 μg/L一系列标准溶液，以峰面积(y)为纵坐标，对应的质量浓度(x)为横坐标，相应的线性回归方程及线性相关系数见表2。23种抗生素药物在0.5~50 μg/L的浓度范围内相关系数r²均在0.99以上。以3倍信噪比作为仪器检出限，10倍信噪比作为定量下限，抗生素药物的检出限和定量限见表2。

3.5.2. 回收率和精密度

分别在超纯水中添加0.05 μg/L，0.5 μg/L和10 μg/L三种不同浓度的抗生素混合标准溶液，按1.5方法进行前处理，回收率见表3。结果表明：各种抗生素药物的回收率在87.5%~105.8%，精密度在0.3%~4.2%。

Table 2. Linear equations, correlation coefficients, LOD and LOQ of antibiotics

表2. 抗生素药物的线性方程、相关系数、检出限和定量限

Table 3. The recovery and RSD of antibiotics (n = 6)

表3. 抗生素药物的回收率和精密度(n = 6)

3.6. 实际样品的测试

分别取超市购买的5份饮用水(超市购买)和5份河道水，按1.5方法进行前处理，测试结果见表4。

实验结果表明：在3分河道水中检测到了磺胺类药物，磺胺二甲嘧啶核磺胺-6-甲氧嘧啶是畜牧业常用的抗生素药物，摄入动物体内的抗生素通过代谢物进入环境，从而影响了环境水资源。

4. 结论

本文采用磁性MWCNTs–超高效液相色谱–串联质谱技术分析水中23种抗生素残留。该方法灵敏度高，选择性好，前处理简单，回收率稳定，准确度和精密度好，适用于水样中抗生素多残留的测定。由于磁性MWCNTs吸附性能好，价格低廉，操作，在固相萃取净化方面具有很好的应用前景。

Table 4. The results of sample test

表4. 样品测试结果

备注：ND表示未检出

资助项目

浙江省科技厅公益性科技计划(No. 2015C37019)和浙江省质量技术监督系统科研计划(No. 20150204)资助项目。

NOTES

^*通讯作者。