1. 引言
消化系统肿瘤是严重危害人类健康的疾病。消化系统肿瘤生长速度快，恶性程度高，极易早期转移，且患者预后较差。由于得不到早期及时治疗而贻误时机是导致癌症患者死亡的主要原因。因而早期发现并早期进行干预是肿瘤治疗的关键。近些年来，有关肿瘤生物标志物的研究发现，miRNA在肿瘤早期即呈现失控性生长，血循环中miRNA含量的检测对早期肿瘤的检测会有帮助。可以作为恶性肿瘤新的生物标志物和治疗反应的检测指标。为恶性肿瘤的诊断和治疗开辟一个新的视野。本文将针对血循环中miRNA在消化系统恶性肿瘤的早期诊断，作用机制及个体化治疗以及预后监测等方面的应用价值做出综述。
2. miRNA简介
2.1. miRNA历史起源
Lee等[1] 人在1993年首次在线虫中发现基因lin-4通过转录生成的RNA调控其发育过程。2000年Reinhart[2] 有在线虫中发现了另外一种具有类似功能的miRNA-let-7。在随后的时间内研究者通过克隆测序及生物信息学的方法发现了多种miRNA。至今已达到几千种[3] 。miRNA是一类由18-25个核苷酸组成的内源性非编码小分子单链RNA，广泛存在于各种植物和动物中。miRNA对靶基因的调控是在转录后水平上进行，通过对靶基因的切割或对其翻译抑制两种机制来下调靶基因的表达。miRNA对基因的调控是通过构成RISC来进行的。在人类体内，大部分miRNA不能与靶基因的转录体完全配对，故被认为主要通过翻译抑制的方式来调控靶基因。
2.2. miRNA的特征
miRNA本身的生物学特征：miRNA广泛存在于真核生物中，成熟的miRNA结构为单链结构，其5’端有一磷酸基团，3’端为羟基，且本身不具有开放阅读框架。这使其区别于大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段。miRNA在不同的物种和组织之间有高度的保守性。仅在3’端有1~2个碱基变化。miRNA有细胞特异性和组织特异性。miRNA的这些生物学特性说明它们在细胞生物学和人体研究中有重要的意义。
2.3. 血循环中miRNA特征
血循环中的miRNA有几个主要的特征：第一，miRNA是小分子非编码RNA，在血循环中有很高的稳定性，能够抵制RNA酶的降解。现已证明血清中miRNA在严酷的状态下(如煮沸、冻存时间过长、过高或过低的PH值)仍然保持完整，这种稳定性使其成为潜在的生物标志物，用于临床监测和病理标本的检查[4] 。研究发现这种稳定性和miRNA的高度保守性相关[5] 。第二，miRNA在肿瘤的早期失控性生长，其表达水平和正常组织相比有很大的改变。因此可以用于临床上肿瘤早期的监测.第三，miRNA组成复杂，任何某个miRNA都可以调节很多基因，每个基因都可以被不同的miRNA调节。miRNA作用于细胞功能、信号系统和生物过程的调节。一个单个miRNA可以调节多个mRNA的表达水平，有实验证明通过比较一些miRNA在良性肿瘤和恶性肿瘤中表达水平的改变，显示miRNA比mRNA能提供更简单的表达谱，有更优的生物学特征[6] 。第四，miRNA分布广泛，不仅存在于植物和动物体内，在人体的任何体液内也可以检测到。组织中，血浆及血清中都可以检测到[7] 。因此增加了其临床应用的可行性。因此，miRNA可以用于区分恶性肿瘤和正常组织。更重要的是，可以辨别不同的癌症亚型。
2.4. microRNA的加工、成熟与分布
microRNA是动、植物自身基因组编码形成的一类小分子首先由基因组转录形成长链RNA分子— pri-miRNA，约60%的microRNA为独立转录表达；约15%miRNA为成簇存在而共同转录；其余还有约25%的miRNA定位于功能基因内含子，随基因转录表达。Pri-miRNA经双链RNA核酸酶Drosha酶作用，加工形成70~100 nt长度的pre-miRNA。Pre-miRNA在Exportin5介导作用下，转运出胞核至胞质中进行下一步加工。Pre-miRNA在胞质中，经双链RNA核酸酶Dicer酶作用加工形成单链成熟miRNA分子。miRNA的加工成熟过程与RNAi技术中常用的siRNA有许多相似之处–均经过Dicer酶对双链RNA的识别加工而形成单链RNA分子。18~25nt的成熟miRNA形成后与其他蛋白共同组成RNA介导的沉默复合体(RISC)参与RNA干扰途径。miRNA形成RISC后可与特定的靶mRNA结合，这种结合不要求严格的互补配对。结合后导致靶mRNA翻译的抑制和降解。
3. miRNA检测常用的方法
目前实验室常用的方法有基因表达谱芯片技术，高流量通过技术和新一代的基因测序技术，RT-qPCR技术，nanostring技术和原位杂交技术等。另一方面，原位杂交技术也是一项技术挑战，这项技术的优点是比RT-qPCR技术和基因芯片技术更加精确，能够将肿瘤细胞和周围的基质区分出来。其缺点是只能在高温状态进行定位，而在低温条件下难以进行[8] 。基因芯片技术可以在未知序列的情况下对miRNA进行分析，其缺点是价格比较昂贵。不适合普通实验室。Northernblot技术步骤较繁琐，需要较多的样本且灵敏度比较低。不适合较多临床样本的分析研究。nanostring技术是建立在miRNA表达谱的基础上，可以用于多个miRNA的能力的检测。是一项新的技术。各种技术相比较，RT-qPCR技术更易建立，稳定，可重复性较强，同时具有高度的敏感性和特异度[9] 。是目前应用度最广的一种实验室方法了。而实时定量PCR又有茎环法和试剂盒法两种。研究证明茎环反转录法方法灵敏度高，成本低，适用于少量RNA检测。试剂盒法成本高，工作量小，可以运用于多个miRNA的检测工作。茎环法在少量重要的miRNA检测中有优势，但试剂盒法适用于大量的miRNA的筛选[10] 。
4. miRNA与肿瘤
4.1. miRNA在肿瘤中的作用机制
miRNA是一类非编码的单链小分子RNA，它们主要通过诱导目标mRNA的降解或干扰蛋白质的翻译过程下调特异性基因的表达，在控制细胞的生长、分化和凋亡等方面起着重要作用。miRNA在肿瘤的发生过程中起着重要作用。很多实验证明miRNA在人类恶性肿瘤中有异常表达的现象[11] 。Let[12] 家族主要是通过负调节RAS基因来抑制肿瘤的生长，ras原癌基因参与细胞的分化和增殖。约有15%~30%的肿瘤中有ras基因。He[13] 等将miR-17-92簇中脊椎动物特异的部分miR-17-19b和c-myc在B细胞淋巴癌小鼠模型的造血干细胞中共表达，发现miR-17-19b加快恶性淋巴瘤形成的速度，共表达miR-17-19b和c-myc的细胞比仅表达c-myc的细胞有更高的增殖速度和更低的死亡率。Dews等人[14] 发现miR-17-92簇可以抑制抗血管新生的因子Tsp1和结缔组织生长因子CTGF，从而促进肿瘤中血管的新生，这些研究都表明miR-17-92具有原癌基因的功能而该簇中miR-17-5p和miR-20a可以降低E2F1的水平，E2F1通过调控与DNA复制、细胞分裂和凋亡相关的基因控制细胞从G1期到S期，miR-17-92簇通过降低E2F1的水平又起到了抑癌基因的作用。miR-17-92簇是作为原癌基因还是抑癌基因发挥作用，要依赖于miRNA所在的组织、细胞类型以及胞内存在靶基因的种类。例如原癌基因miR-10b通过抑制HOXD10来促进转移，而HOXD10是与肿瘤细胞增殖和转移相联系的负调节基因[15] 。部分miRNA是有丝分裂的关键调节器，例如RAS和HMGA2。但是仍有部分基因在。郭俊明等[16] 认为DNA甲基化和组蛋白修饰影响miRNA基因的表达后引起肿瘤的发生。为miRNA基因表达与表观遗传调控的关系在肿瘤发生中的作用的研究提供了一个新的方向。Xing T.J. [17] 等人使用实时定量PCR和流式细胞仪技术检测了肝细胞癌huh7等细胞系中miR-122的水平，以及使用脱氧胞苷前后水平差异，认为miR-122在肝细胞癌细胞的增殖和凋亡机制中的作用与DNA的甲基化有关。Fornari F[18] 等研究发现肝癌病人血清中miR-122通过促进细胞周期G1期从而抑制了P53的活性。同时发现miR-122也影响阿霉素对肝癌细胞的作用。
4.2. miRNA与胰腺癌
胰腺癌是恶性程度高，预后较差的肿瘤之一。A.E. Szafranska[19] 等发现miRNA217和miRNA196a在胰腺导管腺中高表达。Marry Dillhoff[8] 等用原位杂交技术和基因芯片技术分析了12例良性肿瘤和45例慢性胰腺炎病人及80例胰腺癌病人的血清miRNA水平发现miRNA-21在胰腺癌中过表达。而在胰腺炎和良性肿瘤中水平波动变化不大。
4.3. 循环miRNA与肝癌
肝细胞癌是世界上第五大恶性肿瘤，死亡率居恶性肿瘤第三位。五年生存率只有0%~14%[20] 。因此亟需早期诊断和早期介入治疗。尽管alpha-fetoprotein(AFP)在肝癌的诊断中起到非常重要的作用。但是仍缺乏一定的敏感性和特异性。因此仍需要更特异的新的生物标志物联合诊断。而miRNA被证实在肝癌早期就有异常表达。可用于肝癌早期的检测。Xu[21] 等发现miR-21 miR-122在肝癌中的高表达。gramantieri等[22] 发现miRNA-122a可以负性调控细胞周期蛋白的表达，而另外一种差异表达的miR-221可以促进肝细胞癌的恶性增殖，说明组织中miRNA与肝细胞癌的发生和发展有着密切的关系。tokuo sukata等[23] 发现与正常肝脏组织相比七种miRNA(miR-34a, miR-7a, let-7f, miR-331, miR-98, miR-338, miR-652)在肝癌血清中高表达。同时发现这七种miRNA是随着肝癌的临床进展而显著增加的。由此可以看出miRNA可以作为肝癌检测的临床标志物。Yusuke Yamamoto等[24] 用RT-qPCR方法发现miR-500在肝癌中高表达，可以作为肝癌的临床诊断的生物标志物。同时发现一些miRNA例如miR-142-5P、miR-451 miR-223在血细胞中早期高表达，随着肝脏的生长表达也随之下降，其机制也许和肝脏是一个造血器官的生理功能有关。异常表达的miRNA可能与干细胞的分化、信号转导有关。同时亦有研究表明miR-199家族(miR-199a.b.c)在大部分肝癌病人组织中表达下调。MiR-199低表达的肝癌病人复发率较miR-199表达水平高的病人复发率更高[25] 。MiR-199在肝癌病人体内作用的目标基因主要有MET、mTOR和PTEN，AKT3 and TIMP2及HIF-1a[26] -[30] 。同时Henry J.C.等[31] 人认为CD44也是miR-199在肝癌病人体内重要的目标基因。因为CD44在细胞间作用，细胞粘附和细胞转移中起到重要作用。miR-199也可能通过影响CD44的表达从而影响肝癌细胞的转移。
4.4. 循环miRNA与结直肠癌
结直肠癌(CRC)是目前世界发病率较高的一种消化道肿瘤，每年大约有100万发病率，死亡率也较高，因此结直肠癌的早期诊断和筛选对降低结直肠癌的病死率很重要，但是目前临床上尚未有非常确切的生物标志物。de krijger I.等[32] 发现miRNA在结直肠癌的肿瘤生成机制中是关键的调节因子，同时在肿瘤的转移过程(包括肿瘤凋亡细胞的逃逸，上皮间质细胞转换，肿瘤血管的生成，以及肿瘤细胞侵袭)中也起到重要的作用。
4.5. 循环miRNA与胃癌
研究证明miRNA在胃癌的发生、转移、预后以及诊断治疗过程中起着重要的作用。Zheng Y. [33] 等发现miR-21在胃癌血清中的水平显著升高。Song J.等[34] 应用RT-PCR方法发现miR-93 miR-16在胃癌的血液中表达水平远远高于正常对照组水平，可以用于胃癌的早期诊断及预后判断标志物的相关研究。
4.6. miRNA与食管癌
食管癌是世界上最常见的消化系统恶性肿瘤之一。其死亡率居恶性肿瘤第四位。食管癌的早期发现和早期治疗可以极大的提高食管癌的生存率。但是临床上灵敏度高特异度强的生物标志物仍缺乏。新兴出现的miRNA的发现有可能弥补这一缺陷。Liu R.等[35] 现血循环miR-155在食管癌患者血清中过表达。蒋敏[36] 等使用xAMP液态芯片技术检测了45名食管癌患者和45名正常对照组外周血单个核细胞中miR-21水平。结果发现食管癌患者外周血单个核细胞中miR-21的表达显著高于正常对照组。在鳞癌和腺癌中表达无显著性差异。且与食管癌的分期无关，预示miR-21可能参与食管癌的发病过程。
4.7. miRNA和其他生物标志物联合诊断的临床意义
Ling Gao等将miR-16和CA19-9进行联合诊断发现明显可以提高胰腺癌的早期诊断和筛选，克服了临床上缺乏确切的生物标志物的不足，同时增加了诊断的可信度。比单个生物标志物的临床特异度，敏感度以及准确度都高[37] 。Angela M. Liu等使用基因芯片技术及RT-qPCR方法研究认为miR-15b与miR-130b联合检测肝细胞癌其准确度达94.83%。其早期诊断效果优于其他单个标志物[38] 。
5. miRNA与个体化治疗
目前关于miRNA的研究越来越多，miRNA在肿瘤的发生，发展转移过程中扮演着重要的角色。miRNA-125在甲状腺癌中表达下调且被证实可以抑制细胞的扩增和细胞循环的延长而起到抑制肿瘤形成的作用[39] 。然而在成神经细胞瘤和前列腺癌中，miR-125b则抑制细胞的凋亡促进细胞的扩增和转移而起到致癌作用[38] [40] 。在许多人类肿瘤病例中存在miRNA表达异常的现象，miRNA表达水平的改变在肿瘤的形成和转移过程中起到重要的作用。近年研究证明miRNA在肿瘤中既可以充当原癌基因也可以作为肿瘤抑制基因。致癌miRNA通过负调节机制抑制抑癌基因或促进细胞分化从而促进肿瘤生长。如果在治疗过程中找到这些miRNA的类似物或拮抗剂来促进或抑制这些基因，将会为肿瘤的治疗提供一个新的治疗理念。在肿瘤患者体内导入反义miRNA降低肿瘤组织中高表达的miRNA或者提高低表达及表达缺失的miRNA也许会成为一种新的抗肿瘤治疗方法。Park等证明反义寡核苷酸能抑制上调的miRNA，用其治疗胰腺癌，同时观察miR-21、miR-221的水平变化，发现miR-21/221都能抑制癌cell增殖提高肿瘤细胞的凋亡。可以用于胰腺癌病人的治疗[41] 。Huang JW[42] 等研究发现miR-103和miR-107通过作用于靶基因RAD51和RAD51D有助于损伤DNA的修复，从而增强药物的敏感性。Ye J.等[43] 通过研究miR-27b在结直肠癌血管中的作用发现miR-27b可以作用于血管内皮影响因子C从而抑制肿瘤的发展和血管生成。可以用于结直肠癌的临床治疗。
6. miRNA作为治疗效果监测的标志物
在肿瘤患者中，改变miRNA的表达或miRNA基因的多肽性和miRNA的结合位点与治疗反应有关。Nakajima G. [44] 认为在大肠癌患者体内let-7和miRNA-181b的表达水平与S-1的化学反应密切相关。在食管癌患者血清中，miR-21浓度比健康人高，而术后比术前明显降低。对化疗药物敏感的食管鳞状细胞癌患者，血清miR-21水平下降，而对化疗药物不敏感的患者miR-21水平没有明显改变。所以miRNA-21被认为是食管鳞状细胞癌的诊断标志物，同时也可以用来作为化疗药物治疗反应的检测[45] 。另外，有研究表明，一些血循环miRNA在肿瘤切除术后水平会下降。也为miRNA治疗效果的监测提供了一个新的无创方法。1999年Yamamoto等[24] 研究发现人miRNA-500在HCC病人血清中显著升高，当行外科手术六个月后，病人血清中miR-500水平下降。
7. miRNA的研究前景和展望
体液中miRNA的检测在生物标志物领域是一个爆炸性的研究，目前在人类基因组中，有超过1500种miRNA被发现，因为miRNA可以作为检测生物标志物的一个潜在的标准，同时也可用于检验癌症治疗反应。尽管有很多临床试验已证明miRNA的临床诊断价值，但是，这项新发现仍有很多问题尚未解决，第一，缺乏长期有用的数据来验证这些结果，因此还需要大量的前瞻性临床试验来验证这项技术。第二，体液中miRNA的表达水平的上调和下降反映了肿瘤的变化，但是仍缺乏一个明确的通用参数用于临床广泛推广。第三，一种肿瘤中可能有很多miRNA异常表达，而同时一种miRNA可以在不同的肿瘤中异常表达，缺乏肿瘤特异性，为miRNA的临床研究增加了一定的难度，我们仍需要大量的研究寻找出具有高度特异性的临床生物标志物如具有肝脏特异性的miR-122[46] 。目前已有很多研究者提出联合检测可以提高肿瘤的早期检出率和有利于早期诊断。例如肿瘤相关抗原(例如PSA)、突变基因(例如BRCA1、RB1、TP53)和染色体异位等。为临床研究打开了一个新的窗口。以血液为基础的癌症标志物miRNA有着自己的优点和潜在的优势。随着现代医学的发展和有关研究的不断深入，关于miRNA的研究将会进行得更广，其作用机制以及和肿瘤之间的关系也会更加的完善。同时也会有越来越多的临床研究来验证这些结果，将会证明血循环miRNA是一项非常有研究价值的临床生物标志物，同时也发明了很多检测血液中miRNA含量和水平的先进方法。我们相信随着对循环miRNA的研究的不断发展以及对其认识的不断深入。将miRNA作为一些肿瘤的早期检测和肿瘤无创检测的标志物将会实现。