1. 引言
NF-КB是最先在成熟的B细胞中被发现的一种核蛋白，它可通过对相应基因的转录调节，促进肿瘤的发生、肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[1] [2] 。而BCL-2是迄今研究的最深入和广泛的凋亡调控基因之一，但有关NF-КB与BCL-2在多形性腺瘤中表达的报道较少，且目前对BCL-2表达与该肿瘤的发生、发展及侵袭过程的关系及相关机制尚不完全清楚。有鉴于此，本研究采用免疫组化SP法检测NF-КBP65和BCL-2在多形性腺瘤、正常涎腺组织中的表达水平，分析NF-КBP65和BCL-2在多形性腺瘤中的表达情况及意义。
2. 材料与方法
2.1.材料
病例选自2006年1月~2010年12月南昌大学第二附属医院口腔颌面外科多形性腺瘤手术患者，共20例，其中男性13例，女性7例，平均年龄53.6 ± 9.8岁，所有患者均告知并同意其病理结果可以用于科学研究。以切除的多形性腺瘤组织为试验组，瘤旁正常涎腺组织为对照组。收集患者性别、年龄、肿瘤大小、部位等资料。所有患者术前未进行放化疗治疗。所有标本经病理检查确诊后经10%中性福尔马林液固定，常规石蜡包埋。
2.2. 主要试剂
小鼠抗人NF-КB P65单克隆抗体试剂盒和小鼠抗人BCL-2单克隆抗体试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
2.3. 免疫组织化学染色(EliVisionTMplus二步法) [3]
标本制成4 μm石蜡切片，经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化和PBS (PH = 7.4)冲洗后，切片放入高压锅中进行高温抗原修复，冷却后用PBS液冲洗，室温下孵育10分钟，加1滴一抗，置于4℃冰箱内过夜。第二天PBS冲洗结束后，加1滴聚合物增强剂，室温孵育20分钟。加1滴酶标抗兔聚合物，室温孵育30分钟。重复PBS冲洗步骤一次，加1滴新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间。水洗、苏木素复染、0.1%HCL分化和PBS返蓝。切片经酒精脱水干燥、二甲苯透明和树胶封片，最后在显微镜下观察组织。
2.4. 免疫组化阳性判断标准
NF-КBP65以胞浆或胞核出现棕黄色颗粒为阳性；BCL-2以胞浆或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。以阳性细胞所占比率 < 10%判定为阴性(−)，10%~25%为弱阳性(+)，26%~50%为中阳性(+ +)，>51%为强阳性(+ + +)。弱阳性，中阳性，强阳性均记为阳性。
2.5. 统计学方法
采用SPSS 12.0统计软件包进行统计学分析，所有数据均以百分率表示(%)，采用χ2检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. NF-КBP65在多形性腺瘤和瘤旁正常涎腺组织中的表达
NF-КBP65在多形性腺瘤和正常涎腺组织中的表达情况见图1和表1。从该结果可以看出，NF-КBP65在多形性腺瘤中表达较为丰富，表达率为55％，而在癌旁正常涎腺组织表达率仅为10%，表达差异具有统计学意义(P < 0.05)。
3.2. BCL-2在多形性腺瘤和瘤旁正常涎腺组织中的表达
BCL-2在多形性腺瘤和瘤旁正常涎腺组织中的表达情况见图2和表2。该结果表明，BCL-2在多形
Figure 1. The expression of NF-КBP65 in pleomorphic adenoma and adjacent normal salivary gland tissue. (A: Pleomorphic adenoma, B: Adjacent normal salivary gland tissue)
图1. NF-КBP65在多形性腺瘤和瘤旁正常涎腺组织中的表达× 400 (A：多形性腺瘤，B：瘤旁正常组织)
Figure 2. The expression of BCL-2 in pleomorphic adenoma and adjacent normal salivary gland tissue. (A: Pleomorphic adenoma, B: Adjacent normal salivary gland tissue)
图2. BCL-2在多形性腺瘤和瘤旁正常涎腺组织中的表达 × 400 (A：多形性腺瘤，B：瘤旁正常组织)
Table 1. The positive expression rate of NF-КBP65
表1. NF-КBP65的表达阳性率比较
注：组别间采用卡方检测，差异有统计学意义(P < 0.05)。
Table 2. The positive expression rate of BCL-2
表2. BCL-2的表达阳性率
注：组别间采用卡方检测，差异有统计学意义(P < 0.05)。
性腺瘤中的表达率为35%，明显高于其在瘤旁正常涎腺组织中的表达，两者差异具有统计学意义(P < 0.05)。
4. 讨论
大量的研究已表明，肿瘤的发生发展和细胞增殖与凋亡动态平衡受破坏有关[4] ，研究证实许多肿瘤中凋亡相关基因表达异常，主要是抑凋亡基因表达上调，促凋亡基因表达下调[5] [6] 。NF-КB是一种分布和作用均十分广泛的真核因子，NF-КB对多种凋亡抑制因子如c-IAP1、c-IAP2等有诱导性表达作用。NF-КB通过对凋亡蛋白和抗凋亡蛋白不平衡表达的调节作用，以及与肿瘤抑制蛋白(如p53)的直接作用实现抗凋亡功能[7] ；NF-КB所介导的对自我吞噬作用的抑制效应，是其发挥抗凋亡作用的新机制[8] 。越来越多的研究发现，NF-КB信号转导通路在癌变过程中起着重要作用[9] ，特别是RelA (p65)亚基可反式激活多种基因，调节细胞的生长、凋亡、血管生成和侵袭转移。p65蛋白在多种外界刺激下，脱离 IКB的阻滞而转位至细胞核，这是NF-КB信号转导通路活化的标志。
BCL-2是抑制细胞凋亡的基因，它并不改变细胞增殖，却可以抑制延缓细胞凋亡，延长细胞寿命，导致细胞数量增多[10] 。近年来文献显示在多种肿瘤组织内BCL-2都呈现过表达状态。有研究发现，原发性和复发性多形性腺瘤中BCL-2的表达相似，而恶性多形性腺瘤中BCL-2过表达。柴琳[11] 指出BCL-2的表达在口腔鳞癌的发生发展中起着重要的作用。提示BCL-2通过抑制细胞凋亡，从而导致肿瘤细胞的累积和恶性潜能的显现，推动肿瘤发展。本研究结果提示，BCL-2在多形性腺瘤有高表达，表明BCL-2的表达可以作为鉴别涎腺良性肿瘤和恶性肿瘤的参考依据。在恶性肿瘤中，BCL-2蛋白阳性表达越高的病人，恶性程度低，生存率高，预后好，表明BCL-2不仅在良恶性肿瘤的发生发展中起重要的作用，而且还可作为恶性肿瘤判断预后的指标。但这一推论目前仍存在着争议，尤金强等[12] 则认为BCL-2蛋白表达强度越强，临床预后可能越佳；Knowlton等[13] 的观点认为BCL-2不仅抑制了细胞凋亡，由此导致的细胞周期延长可能会延缓细胞增殖。BCL-2在癌组织中的表达意义还有待进一步研究。
已有研究证实BCL-2启动子上存在着NF-КB特异结合位点，被认为是NF-КB下游的一个重要靶基因NF-КBP65的过度激活，可大大增加BCL-2的表达[14] -[16] 。其调节其机制可能为：可使抗凋亡蛋白如BCL-x等凋亡抑制蛋白和TNF受体相关因子的转录增加；阻断Fas介导的凋亡通路，从而抑制癌细胞凋亡；NF-КBP65通过增加其下游基因，如细胞周期素、肝细胞生长因子表达，促进肿瘤细胞的生长；抑制NF-КBP65活性或阻止IКB降解的药物可增加癌细胞凋亡，抑制癌细胞生长。Dai LC等[17] 在人肝细胞癌的研究结论也支持本实验观点。
本研究结果表明NF-КBP65，BCL-2在多形性腺瘤中有较高表达，提示NF-КBP65，BCL-2的表达水平可作为涎腺肿瘤判断预后的可能筛选因子，并为鉴别涎腺良性肿瘤和恶性肿瘤提供一定的参考依据。此外，深入研究NF-КBP65，BCL-2信号转导通路在多形性腺瘤发生中的作用机制，可能会为多形性腺瘤的诊断和治疗提供新的思路。
基金项目
浙江省卫生厅一般项目(No.2012KYB188)。