1. 引言
APETALA2/ethylene responsive element-binding protein(AP2/EREBP)蛋白是植物中一类多基因家族转录因子，其主要特征是含有1个或2个由60~70个高度保守的氨基酸残基组成的AP2 DNA结构域。AP2/EREBP转录因子包括AP2、RAV、EREBP三个亚家族，其中AP2亚家族主要在植物生长发育中起作用，如调控花、分生组织、胚珠和种子发育 [1] [2] [3] [4] ；EREBP和RAV亚家族主要在植物激素反应、生物或非生物胁迫应答(如冷、热、高盐、干旱)等方面起作用，还调控很多基因的表达，如非生物胁迫反应基因、乙烯反应基因等 [5] - [11] 。前期研究表明，拟南芥AP2-like ABA repressor 1 (ABR1)基因参与脱落酸ABA和胁迫条件(包括冷、高盐度和干旱)反应 [12] ；茎瘤芥ABR1基因受高盐、低温等胁迫条件诱导表达 [13] 。
启动子是一段位于基因5’端上游区、能被RNA聚合酶识别、结合和起始转录的特定DNA序列 [14] [15] [16] 。目前，能应用于植物基因工程的启动子还非常有限，并且大多数存在某些局限性 [17] 。植物基因启动子具有很重要的研究意义，其中有很多种重要的顺式作用元件，在转录水平上参与调控相应基因表达，从而使植物能够抵御外界环境胁迫 [18] 。大白菜BrABR1基因属于AP2/EREBP转录因子基因家族，本研究利用生物信息学技术对大白菜BrABR1基因启动子区进行序列分析，为ABR1基因调控区的分析与鉴定、基因表达调控研究奠定了基础。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
BrABR1基因结构
大白菜(Brassica rapa subsp. pekinensis) BrABR1基因登录号为XM_009113908，定位于大白菜第9号染色体上，BrABR1基因cDNA长度为1299 bp，编码381氨基酸。BrABR1基因组DNA长度为2155 bp，含2个外显子和1个内含子。该基因尚未记录启动子序列。
2.2. 数据库
① 在线核酸序列数据库：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/。② CpG岛预测软件：CpGplot Searcher (http://www.bioon.com.cn/doc/showarticle.asp?newsid=1115)；CpG Finder (http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=cpgfinder&group=programs&subgroup=promoter)。③ 启动子在线分析软件：BDGP (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)。④ 转录结合位点预测软件：Plantcare (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)； Place (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html)；TSSP (http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=tssp&group=programs&subgroup=promoter)。
2.3. 实验方法
2.3.1. BrABR1基因序列的获取
在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/数据库中检索获得大白菜BrABR1基因，基因登录号为XM_009113908。
2.3.2. BrABR1基因启动子区序列的获取
在NCBI的GenBank中查找，获得大白菜BrABR基因的mRNA在基因序列图上的定位，并获取该基因翻译起始位点上游−3377 bp的序列，如图1所示。
2.3.3. BrABR1基因核心启动子预测
通过BDGP启动子分析在线软件对BrABR1基因翻译起始位点上游−3377 bp的启动子区进行核心启动子预测。
2.3.4. BrABR1基因启动子区顺式作用元件分析
利用Plantcare、Place和TSSP转录因子结合位点预测软件，输入BrABR1基因翻译起始位点上游−3377 bp序列，搜索后获得该基因启动子区顺式作用元件。
2.3.5. BrABR1基因启动子区CpG分析
输入BrABR1基因翻译起始位点上游−3377 bp序列，按照CpGplot Searcher和CpG Finder预测软件默认条件进行预测分析。
3. 结果
3.1. 大白菜BrABR1基因启动子预测结果
利用BDGP (Berkeley Drosophila Genome Project (伯克利果蝇基因组计划) Neural Network Promoter Prediction)软件进行预测，得到3个可能的核心启动子序列，结果如表1所示。
3.2. BrABR1基因启动子区CpG岛的预测
在线软件CpGplot Searcher和CpG Finder预测均未发现CpG岛。
3.3. BrABR1基因启动子区顺式作用元件的预测
经Plantcare和TSSP等软件分析发现，在翻译起始密码子上游存在着多个可能的TATA-box和CAAT-box。经PLACE软件分析获得转录因子结合位点获得大白菜BrABR1基因启动子转录起始点上游−3377 bp的正负链顺式作用元件共计126个 [18] ，主要包括核心元件：TATA-box、CAAT-box；光调控元件：IBOXCORE、REALPHALGLHCB21、REBETALGLHCB21、RYREPEATGMGY2、RYREPEATLEGUMINBOX、SORLIP1AT；低温响应原件：DRECRTCOREAT、LTRECOREATCOR15；赤霉素相关元件：GAREAT、MYBGAHV、WRKY71OS；自身反馈元件：CARGCW8GAT [19] 。大白菜BrABR1基因启动区序列具体顺式作用元件位点
标注*斜体ATG：起始密码子；阴影：预测核心启动子序列； ：TATA-box； ：CAAT-box； ：光响应元件(包括G-box、Box I、Box 4、Sp1、chs-CMA1a等)； ：赤霉素响应元件(GARE-motif)； ：热诱导响应相关顺式作用元件(HSE)； ：低温响应元件(LTR)
Figure 1. Sequence analysis of BrABR1 promoter from Chinese cabbage
图1. 大白菜BrABR1基因启动子序列分析
Table 1. Predicted results of core promoter sequences in BrABR1
表1. BrABR1基因核心启动子序列预测结果
如图1所示。
4. 讨论
ABR1基因属于AP2/EREBP转录因子家族，与植物激素ABA和逆境反应相关 [12] ，大白菜BrABR1基因启动子区序列分析对BrABR1基因调控区的分析与鉴定、基因表达调控研究奠定了基础。
DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(mC)的一种反应 [20] 。一般来说，DNA的甲基化会抑制基因的表达，其基因的序列并没有因此而发生改变。DNA甲基化能够直接或间接的抑制基因的转录，通过甲基化直接影响蛋白质因子的结合活性从而不能起始基因转录，或者通过染色体构象的改变、与甲基化CpG结合的蛋白因子间接影响转录因子与DNA的结合 [21] 。本研究使用CpGFinder软件，并未预测到CpG岛的存在，故推测不存在该启动子区域甲基化CpG对基因表达的调控。
BDGP软件对基因启动子进行了分析预测，发现在转录起始密码子相近区域没有核心序列，最相近的一个启动子核心区域也相差将近1000 bp，这说明是转录起始密码子不是转录起始位点。通过核心序列可进一步确定转录起始位点，对于分析启动子核心元件和顺式作用元件有重要作用。由于利用生物信息学的方法对核心启动子序列的预测只具有部分参考作用，具体的核心序列的确定可能还需通过实验方法进行验证。众所周知，外源基因在细胞中的表达是基因工程研究的关键，而外源基因的表达首先取决于其转录的启动 [18] [19] [22] 。
转录因子在植物的各种应答反应中具有重要的作用。转录因子，又称反式作用因子，它是在转录起始复合体组装的过程中，通过与启动子区域和RNA聚合酶相互作用从而影响转录效率的一种蛋白质。针对发育阶段的不同信号和来自外界环境的不同刺激，不同的转录因子可做出其相关反应，结合顺式作用元件，从而对基因的转录起激活或抑制的作用，进而调控不同基因的表达 [23] 。Plantcare、TSSP等软件分析获得大白菜ABR1基因启动子转录起始点上游3377 bp正负链顺式作用元件126个，包括核心元件TATA-box和CAAT-box，其他还包括光调控元件、低温响应原件、赤霉素相关元件、自身反馈元件等。因此预测该启动子的表达可能受赤霉素的调控；还可能受外界非生物胁迫反应相关，与拟南芥ABR1基因参与植物非生物胁迫反应一致。
基金项目
重庆市基础与前沿研究计划一般项目(cstc2014jcyjA80032)。