猪δ冠状病毒研究进展

Research Progress on Porcine Deltacoronavirus

摘要: 猪δ冠状病毒是近年发现的一种新型猪肠道病冠状病毒，可引起猪急性腹泻和新生仔猪死亡。目前没有有效的抗病毒治疗药物和疫苗。自从2014年初美国报道检出PDCoV以来，PDCoV快速蔓延至多个国家，具有全球流行的潜在趋势，引起了世界各国的极大关注及众多的调查研究。本文就PDCoV的病原学、流行病学、检测技术等方面的研究进展进行综述，为该病的进一步研究和有效防控提供依据。

Abstract: Porcine deltacoronavirus (PDCoV) is an emerging swine enteropathogenic coronavirus that causes acute diarrhea and mortality in piglets. At present, there is no proven medication or vaccine for PDCoV. Since it was reported in the US in early 2014, PDCoV has spread to many countries and has the potential of global endemic. It has raised global public health concerns regarding the current sistution and its future evolution. Recent advances in studies on etiology, epidemiology and laboratory diagnosis about PDCoV were summarized in this paper to provide the guidance for its further research and prevention.

1. 引言

冠状病毒(Coronaviridaes, CoV)属于尼多目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒亚科(Coronavirinae)，包括α-冠状病毒(Alphacoronavirus)、β-冠状病毒(Betacoronavirus)和γ-冠状病毒(Gammacoronavirus)和δ-冠状病毒(Deltacoronavirus)四个属 [1] 。猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)是继α冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(porcine respiratory coronavirus, PRCV)以及β冠状病毒属的猪凝血性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, PHEV)后发现的第五种感染猪的冠状病毒，属于δ-冠状病毒属成员 [2] ，是一种新发现的猪肠道病病原，主要感染猪的小肠，尤其是空肠和回肠部位，能引起严重的萎缩性肠炎，临床症状主要表现为急性粥样腹泻、呕吐 [3] 。PDCoV的流行特点、临床症状和病理变化都与猪流行性腹泻(PED)、猪传染性胃肠炎(TGE)较为相似，但在病症的严重程度和感染动物的死亡率方面存在差异，TGEV和PEDV对初次感染的新生仔猪死亡率高达90%~100% [4] ，随着猪龄升高，死亡率有所降低，而PDCoV引起小猪的死亡率约30%~40% [5] 。自2010年以来，全世界范围内爆发的大面积仔猪腹泻给养猪业造成了巨大的经济损失 [6] [7] [8] ，大部分研究报道显示在这些大面积仔猪腹泻中PEDV的检出率超过60% [9] 。然而，近年的研究发现这些腹泻猪群中还存在较高比例的PDCoV [10] [11] [12] 。PDCoV的传播给养猪业带来严重的经济损失，引起了人们的关注，目前我们对PDCoV的认识还比较匮乏，追溯PDCoV的来源和分析各毒株间的进化关系，以及对该病毒的分离、病毒基因功能、致病性研究，乃至疫苗开发是目前亟待开展的工作。

2. 病原学

2.1. 病毒结构与基因组

PDCoV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。电子显微镜下观察，PDCoV呈球形或椭圆形等多形性，包膜上有冠状棘突，除棘突外，病毒颗粒直径约为80~160 nm [5] 。根据目前已测定的PDCoV全基因组序列，除3'端poly(A)尾，该病毒基因组大小约为25.4 kb，是目前已知冠状病毒中基因组最小的，GC含量约为43%。PDCoV基因组的组成、排列与其他冠状病毒相似，两端包含较短的非编码区5'-UTR和3'-UTR。从5'端开始3/4的基因组包含两个重叠的开放阅读框(Open reading frame, ORF) ORF1a和ORF1b，分别编码多聚蛋白pp1a和pp1b。基于其他冠状病毒非结构蛋白的组成并通过生物信息软件预测，PDCoV的多聚蛋白pp1a和pp1b可能被切割、加工成16种非结构蛋白(Nonstructural proteins, Nsps)，这些非结构蛋白主要为病毒复制、转录相关的蛋白酶，包括Nsp3 (木瓜蛋白酶，PL^pro)、Nsp5 (糜蛋白酶，3CL^pro)，Nsp12 (RNA依赖的RNA聚合酶，RdRp)、Nsp13 (解旋酶，Hel)以及其它未知蛋白酶 [13] 。国内Zhu等人 [14] 通过实验证明PDCoV的Nsp5蛋白通过切割κB核因子必需调制蛋白(NF-κB essential modulator, NEMO)保守氨基酸残基Q231来抑制β干扰素(IFN-β)的生成。PDCoV基因组下游依次编码表面纤突蛋白(spike, S)、小膜蛋白(Envelope, E)、膜蛋白(Membrane, M)、非结构蛋白6 (nonstructural protein 6, NS6)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid, N)和非结构蛋白7 (nonstructural protein 7, NS7)。PDCoV的S蛋白是位于病毒颗粒表面的纤突蛋白，主要参与病毒与宿主细胞的吸附和融合，同时也是诱导宿主产生中和抗体的主要抗原分子。另外，S蛋白与病毒的细胞适应性和病毒毒力有关，因此S蛋白是开发疫苗的重要靶点 [15] 。PDCoV的NS6基因和禽源δ冠状病毒一样，位于M和N基因之间，而NS7基因的位置与禽源δ冠状病毒略有不同，PDCoV的NS7基因与N基因重叠，而禽源δ冠状病毒NS基因包含2-4个开放阅读框(NS7a, NS7b, NS7c, NS7d)，这些开放阅读框或与N基因重叠，或位于N基因下游 [13] [16] [17] 。PDCoV HKU15的NS7基因，转录调控序列为有缺陷的5'-GCACCA-3'序列，并且非同义突变率与同义突变率的比值(Ka/Ks)为1.046，暗示NS7基因可能不表达 [13] 。在冠状病毒的结构基因之间分布着数量不等的附属基因，编码群特异性附属蛋白(Accessory protein)，这些附属蛋白在不同冠状病毒中的编码区位置以及个数差异都比较大，主要发挥免疫调节功能 [18] 。

2.2. 病毒的细胞培养特性和减毒性

目前对于PDCoV的分离培养，主要采用LLC猪肾细胞(LLC-PK)和猪睾丸细胞(ST)。在LLC-PK和ST细胞中，PDCoV的致细胞病变效应(CPEs)相似，表现为细胞变大、变圆、单个或成簇存在的密集颗粒细胞以及细胞皱缩、脱落，最终导致细胞凋亡 [19] 。美国国家兽医服务实验室利用ST细胞(ATCC CRL-1746)成功分离到PDCoV USA/IL/2014和Michigan/8977/2014株 [3] [4] 。Hu等 [19] 尝试在非洲绿猴肾细胞(Vero)和猪肠上皮细胞(IPEC-J2)分离PDCoV，未取得成功，但在LLC-PK1(ATCC CCL-101)和ST细胞中成功从病料中分离得到PDCoV OH-FD22株，以及从病料感染的无菌猪小肠内容物中分离到PDCoV OH-FD22 (DC44)株，其中PDCoV OH-FD22已在LLC-PK细胞中连续传代超过90次。国内陈建飞等人从黑龙江某猪场的病料中也成功在LLC-PK细胞分离得到PDCoV NH株 [20] 。在PDCoV细胞培养过程中，添加胰蛋白酶、胰液素或无菌猪小肠内容物(SIC)能促进病毒在细胞内有效繁殖，其作用机制还未明了。冠状病毒的S蛋白被内源性或外源性蛋白酶切割能诱导细胞间的融合以及病毒顺利进入胞内，对于病毒的有效感染至关重要 [21] [22] ，因此认为是胰蛋白酶或SIC对PDCoV表面S蛋白的切割作用增强了病毒对细胞的感染力。

冠状病毒的S蛋白与受体结合位点、宿主适应性密切相关，因此是病毒基因组中最容易发生突变的基因。有研究证实冠状病毒S蛋白的改变能够导致冠状病毒跨物种传播和新宿主的出现 [4] 。Hu等人 [23] 对比了细胞传代培养前后PDCoV OH-FD22株的S基因序列，在ST细胞或LLC-PK细胞中传代至11次时，S基因上出现5个点突变，并分别引起氨基酸改变，这五个点突变一直保留至第20代。在第40代，S基因上又出现了一个新的点突变。试验结果提示第11代出现的5个点突变可能是病毒为获得细胞适应性而发生的关键改变。

Ma等人 [4] 的试验中，在野生型PDCoV Ohio CVM1株和细胞适应株Ohio CVMI感染剂量分别为10⁶和10⁹基因组RNA拷贝条件下，Ohio CVMI株对无菌猪的病症比细胞适应株Ohio CVMI严重，说明PDCoV的细胞适应过程可能降低了病毒的毒力。Hu等人 [23] 对比了野生型PDCoV OH-FD22株和细胞适应株TC-PDCoV OH-FD22不同代次(P5, P20, P40)对无菌猪的致病性，这些毒株表现出相似的毒力，均引起猪只严重腹泻和呕吐，出现萎缩性肠炎，并诱导产生高水平的血清IgG、IgA和中和抗体滴度，说明病毒在有限的传代次数内未获得减毒特性。

3. 流行病学

3.1. δ冠状病毒的起源与进化

2006年，Dong等人 [24] 在对中国南方的严重急性呼吸道综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)进行血清学监测时，从活动物市场的野生亚洲豹猫和中国白鼬獾粪便中检出两种新型冠状病毒，基因组测序和进化树分析结果表明这两个病毒在遗传学上相近但与其他冠状病毒氨基酸同源性较低，且独立于其他冠状病毒属的系统发生。后来这两株病毒被列为δ冠状病毒属成员。2009年Woo等 [17] 从鸟群中检出三种禽源新型冠状病毒，包括夜莺冠状病毒(BuCoV HKU11)、画眉冠状病毒(ThCoV HKU12)以及文鸟冠状病毒(MunCoV HKU13)，最初是将这三种病毒列为γ冠状病毒属下的一个新型冠状病毒亚组，随后这三种禽源冠状病毒被改列为δ冠状病毒属成员。2012年，Woo等 [13] 又从死亡鸟类、鸡、哺乳动物采集的7140个样本中检测到50多个冠状病毒阳性样本，其中七种为新型δ冠状病毒，包括1种猪δ冠状病毒(PDCoV，HKU15)和6种禽源δ冠状病毒(HKU16, HKU17, HKU18, HKU19, HKU20, HKU21)。该研究首次证明了PDCoV存在于2007~2011年采集自中国大陆和香港的猪粪便中，检测率为10.1%，并且首次发表了PDCoV毒株HKU15-44和HKU15-155的全基因组序列，它们的Hel基因、S基因和N基因与亚洲豹猫、中国白鼬獾来源的冠状病毒核苷酸同源性高达99.8%，提示存在δ冠状病毒在这些小型哺乳动物和猪之间传播的可能性。

冠状病毒广泛的宿主性以及自身基因组的结构特征使其在进化过程中极易发生基因重组或缺失突变，从而引起病毒的组织嗜性、传播途径、宿主特异性等的改变，呈现遗传多样性 [4] 。最初发现的亚洲豹猫、中国白鼬獾δ冠状病毒RdRp结构域和S基因核苷酸同源性为100%，当时的检测样本是同时采集自同一个市场，说明这两种动物是短时间内从其他未知感染源感染了δ冠状病毒 [24] 。同时，PDCoV HKU15与麻雀冠状病毒(SpCoV HKU17)的核苷酸同源性较高，这也意味着δ冠状病毒从禽类到猪的种间传递发生时间可能较近 [13] 。HKU17 3'端的非结构蛋白基因NS7a和NS7b缺失可能发生在病毒从禽类到猪的跨种传播过程中，这与SARS-CoV从麝猫传播到人类的过程中ORF8缺失了29 nt的过程非常类似 [13] ，因此不排除该病毒后期继续向其他物种传播的可能性。Woo等人 [13] 提出的冠状病毒进化模型主张蝙蝠为α、β冠状病毒的最初基因源，而鸟类为γ、δ冠状病毒的最初基因源，因此δ冠状病毒有可能是由野生鸟类传给小型哺乳动物和/或家猪。

3.2. PDCoV的在各国的流行情况

目前报道PCDoV检出的国家有中国、美国、加拿大、韩国和泰国。2012年Woo等人 [13] 以全基因组测序的方法首次报道了PDCoV的存在，但没有分离到病毒，也没进行大规模的流行病学调查。2014年2月，美国俄亥俄州5个农场的猪同时出现腹泻，在排除其它猪腹泻病病原后，42份来自腹泻猪的粪便和小肠样本的RT-PCR检测结果显示39份(92.9%)为PDCoV阳性，此次流行相关的PDCoV HKU15-OH1987毒株和HKU15株核苷酸同源性为99% [5] 。同期，美国明尼芬达州立大学兽医诊断实验室和爱荷华州立大学兽医诊断实验室检测到PDCoV，测序结果显示美国株PDCoV与香港检测到的两株PDCoV (HUK15-44和HUK15-155)同源性高达99% [10] 。随后，PDCoV在美国快速散布开来，成为猪群中普遍存在的一个重要病原体。目前为止，美国至少在20个州的猪群中检出PDCoV [25] 。2014年3月加拿大安大略州6个农场出现PDCoV引起的传染性腹泻病 [26] 。2014年4月，韩国首次在腹泻小猪的粪便中检出PDCoV，相比香港毒株，韩国PDCoV毒株核苷酸同源性与美国毒株更接近 [27] 。Lee等人 [28] 采用RT-PCR检测方法对韩国2014年1月至2015年3月59个猪场的691份腹泻粪便样本进行检测，结果显示仅来自其中一个猪场的2份样本为PDCoV阳性。近年，国内的一些流行病学调查结果表明PDCoV在中国大陆的流行较为普遍，检测率高达30% [11] [29] [30] 。2015年7月，泰国一个养猪场的小猪和母猪出现急性腹泻，RT-PCR检测30份样品结果显示其中26份为PDCoV阳性 [31] 。

在对PDCoV流行病学调查时发现，该病毒与其它猪肠道病原共同感染的现象较为普遍。Marthaler等 [26] 检测了293份粪便、肠道、饲料及环境样本，发现PDCoV的检出率为30% (89/293)，其中与轮状病毒的共同感染率高达58% (52/89)。吴美洲等人 [32] 对我国三个省10个猪场的64份样品进行了检测，PDCoV的检测率为23.4%，比PEDV的检测率17.2%要高，同时PDCoV单独感染率为17.2%，与PEDV混合感染率为6.4%。Song等人 [11] 对我国江西省的调查，PDCoV检测率为33.1%，同PEDV共同感染率为19.66%。

3.3. PDCoV的存在早于首次检出时间

在自然条件下，因PDCoV与其它猪肠道病病原共同感染的情况较为普遍，且病症较为相似，使人们忽视了PDCoV的存在，关于PDCoV确切的起源时间无从考证。自从PDCoV被认为是猪群中的一种重要的肠道病病原以来，许多学者进行了回顾性研究。Sinha等 [33] 采用qRT-PCR对来自18个州的1734份样本的检测结果证明至少在2013年8月就已经存在PDCoV。Thachil等 [34] 采用PDCoV特异性IgG间接ELISA方法，从2010年的血清样品中检出阳性样本。国内Dong等 [12] 在2004年存档的安徽样本中检出PDCoV CHN-AH-2004。上述结果说明PDCoV早于首次发现时就已存在猪群中。

3.4. 影响PDCoV感染病症严重程度的因素

临床上，PDCoV可感染各个年龄段的猪，但主要引起新生猪的腹泻。在实验室条件下，人工感染5-19日龄的无菌猪或普通猪，感染后1~2天出现明显的临床症状，主要表现为粥样腹泻，和/或呕吐，症状持续7~12日后恢复 [35] 。Dong等人 [36] 比较了PDCoV细胞适应株CHN-HN-2014对5日龄和21日龄猪的致病性，临床观察结果显示5日龄猪更易感。实验室条件下，母猪临床发病情况较哺乳仔猪轻，且恢复更快。在 [37] 实验中，2日龄仔猪感染PDCoV后的存活率低于3日龄仔猪，提示PDCoV感染后，病症的严重程度、死亡率与猪龄负相关。该现象的机制可能与不同猪龄肠细胞更新周期不同有关，1日龄小猪肠绒毛上皮细胞更新周期约7~10天，感染PDCoV引起猪腹泻的时间大约是一个细胞周期，而肠细胞更新周期随着猪龄增大而缩短，因此PDCoV引起疾病的严重程度与猪龄相关。但2015年在泰国猪场暴发的PDCoV，主要感染母猪，说明该病毒致病性不局限于小猪 [31] 。相同感染剂量条件下 [4] ，PDCoV Ohio MI株引起普通小猪腹泻比无菌猪更严重，在普通猪组，感染病毒1天开始出现严重急性腹泻，而无菌猪组与感染2天后出现临床症状。普通猪组与无菌猪组比较，粪便病毒RNA检出并不因腹泻更为严重而明显增加，说明普通猪肠道菌群或其他生理因素可能与PDCoV发生协同作用，从而影响病程。

4. 诊断和检测技术

4.1. 临床诊断

PDCoV引起的猪病表现为严重粥样腹泻、呕吐。病变区局限在小肠，肠壁彭满扩张，变薄、透明，盲肠和结肠有大量淡黄色液体，小肠和胃内有未消化的凝乳块 [3] 。组织病理检查可在空肠至结肠近端观察到急性、多病灶散布、中到重度的萎缩性肠炎，盲肠和结肠浅表层上皮细胞变性、坏死和空泡化 [35] 。本病依据临床、病理变化和流行病学难于做出诊断，特别是与PEDV和TGEV不易区别，必须依靠实验室技术才能作出确诊。

4.2. 实验室检测技术

目前，PDCoV的检测方法主要有病原学和血清学检测方法。病原学检测方法主要包括免疫电镜(IEM)、免疫荧光(IF)、RT-PCR检测方法等。Song等 [11] 根据PDCoV HKU15 IN2847株的N基因建立了套氏RT-PCR检测方法，对江西省51个养猪场的临床样品进行检测，证实了PDCoV在江西地区的普遍流行。张帆帆等 [38] 针对PDCoV N基因一段长为329 bp的保守区设计特异性引物建立的RT-PCR方法，对249份临床样本检测结果说明该方法具有较好的敏感性和特异性。逄凤娇等 [39] 根据Genbank登录的PDCoV M基因设计特异性引物建立的RT-PCR检测方法，特异性好，敏感性高，最低检测限达6.33 × 104拷贝/μL。Chen等 [3] 针对PDCoV的M和N基因建立的rRT-PCR检测方法，每个反应仅需0.056TCID50 PDCoV；Marthaler等 [26] 建立的PDCoV rRT-PCR检测限仅需2个RNA拷贝。Zhang等 [40] 针对M基因建立了一种双重PEDV/PDCoV rRT-PCR，可以同时检测PDCoV和PDEV，其中对PEDV的检测限为7个RNA拷贝，对PDCoV的检测限为14个RNA拷贝。将该方法应用于临床检测，对170份临床样本的检测结果与PDCoV rRT-PCR和PEDV rRT-PCR相符合。Jung等 [41] 建立的PDCoV原位杂交和免疫荧光染色法，对PDCoV在组织中的感染位点进行了测定，结果显示PDCoV OH-FD22和OH-FD100株在猪的整个肠道引起急性感染，但病毒最先在空肠和回肠部位进行复制。Chen等 [3] 以兔抗PDCoV M、N和S蛋白抗体作为一抗建立了PDCoV组织免疫化学分析法，并利用该方法分析了PDCoV感染猪的组织，结果显示PDCoV主要集中在空肠中段、末端及回肠部位，说明PDCoV对此部位较为敏感，为PDCoV的临床诊断、组织分布以及致病机理研究奠定了基础。

在抗体检测技术方面，Thachil等 [34] 以真核表达PDCoV S蛋白的S1多肽为包被抗原建立的间接ELISA法，用于检测PDCoV特异性的IgG抗体，该检测方法敏感性91%，特异性为95%。该方法对PEDV、TGEV或PRCV感染血清没有交叉反应。Su等 [42] 以原核表达的PDCoV N蛋白作为包被抗原建立了ELISA检测法并与Western blot法进行了比较，对62份血清样品的检测结果证明该方法敏感性为100%，特异性为90.4%。Okda等 [43] 在大肠杆菌(E. coli)中重组表达了PDCoV N蛋白并对重组N蛋白进行了复性折叠，使其空间构象更接近于天然构象，增强了对特异性抗体的捕获能力。以该重组N蛋白作为包被抗原和荧光微球偶联抗原分别建立了ELISA检测方法和荧光微球免疫检测法(fluorescent microsphere immunoassay, FMIA)，使用矩阵法对两种方法中的检测抗原最佳浓度和待测血清最佳稀释度进行了确定，在对629份已知为PDCoV抗体阴性和311份已知PDCoV抗体阳性样品进行检测时，ELISA检测方法的敏感性和特异性分别为96.1%和96.2%，FMIA的敏感性和特异性分别为95.8%和98.1%。使用这两种方法对93份TGEV阳性血清、20份PRCV阳性血清和251份PEDV阳性血清进行检测，均无交叉反应。

5. 结语

长期以来，猪腹泻病一直是困扰养猪业的一大难题。近年来，随着对PDCoV的不断深入研究以及世界各地进行的流行病学监测显示，PDCoV是一种普遍存在的猪肠道疾病病原体，有较强的致病性且对哺乳仔猪造成很高的死亡率，严重危害养猪业生产安全。目前，对PDCoV还有很多的问题有待解决，首先，进一步开展PDCoV的分子流行病学调查是研究该病毒的重点工作之一，这对追溯该病毒的起源与进化具有重要意义，同时还有助于揭示小型哺乳动物作为中间宿主的可能性，以及δ-冠状病毒在小型哺乳动物、猪和鸟类之间跨物种传播的机制。其次，建立新的快速、灵敏、准确并能与其他猪肠道病原进行鉴别诊断的检测技术。最后，加快对PDCoV的基因功能、遗传变异和致病性等方面的研究，以揭示病毒在传播过程中的突变及毒力变化、病毒与宿主细胞之间的相互作用等机制。这需要各国投入更多的调查与研究，尽快明确传播病源及传播途径，以便实施有效的预防和监控措施，并尽早研制出特异性的治疗药物和预防疫苗。

基金项目

国家重点研发计划项目(NO.2016YFD0501100)。