1. 引言
糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)又称糖尿病肾小球硬化症，是糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)慢性微血管病变的重要表现，也是终末期肾衰的重要病因 [1] 。葛根素能够降低肾指数，改善肾功能，抑制肾脏肥大，减轻肾小球基底膜损伤，保持肾小球毛细血管形态正常。并且可以减少肾小管上皮细胞损伤，抑制肾小管基底膜增厚，减轻肾小管－间质纤维化 [2] 。本研究通过链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)诱导建立DM大鼠模型，利用RT-PCR技术观察葛根素对DM大鼠肾组织中趋化因子CXCL10及其受体CXCR3表达的影响，初步探讨趋化因子及其受体介导的慢性炎症在糖尿病肾脏损害中的作用，以及葛根素在趋化因子介导的慢性炎症中的作用和机制，为临床上葛根素治疗DN提供理论依据。
2. 材料和方法
2.1. 实验动物
成年健康雄性SD大鼠(由甘肃省中医学院实验动物中心提供)，体重230~340 g。适应性喂养1周。
2.2. 药物与试剂
链脲佐霉素(STZ，Sigma公司产品)；葛根素(粉剂)、RT-PCR试剂盒购于宝生物工程有限公司(大连)，引物合成由宝生物工程有限公司(大连)完成。
2.3. DM模型与分组
所有大鼠适应性喂养1周后，禁食水12 h，DM组按60 mg/kg链脲佐菌素(STZ)腹腔注射以诱发DM，对照组仅注射相同体积的枸橼酸钠缓冲液。72 h后取尾静脉血测定，连续3次空腹血糖 > 16.7 mmol/L认为DM造模成功。造模成功后的大鼠分为DM组、DM+葛根素干预组。DM+葛根素干预组采用葛根素(500 mg/kg/日)，经食道灌胃给药，对照组、DM组不予任何药物治疗，每日每只灌3 ml灭菌水。自造模成功起，连续给药4周。实验期间自由进水、进食，不使用胰岛素及其他降糖药物。
2.4. 标本采集与处理
给药后每2周检测各组大鼠血糖及体重，4周后用过量戊巴比妥钠麻醉处死大鼠，切取左侧肾脏，去除包膜，称重。每组随机取2~3只大鼠，切取肾皮质，2.5%戊二醛预固定待作电镜观察，余肾经10%中性甲醛固定待作病理形态学观察和免疫组化检测。切取右肾称质量后立即于−80℃冰箱冷藏以备检测。
2.5. RT-PCR检测CXCL10/CXCR3mRNA的表达水平
用TRIzol试剂按说明从肾组织中提取总RNA，紫外分光光度计测量总RNA浓度。甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性。取总RNA 2 μg，按逆转录试剂说明合成第一链cDNA。CXCL10正义引物序列为5’-TTAGTGGATGTTCTGACCCTGCTTC-3’，反义引物序列为5’-TGGGAGGATGGCAGTGG AAGTC-3’。CXCR3正义引物序列为5’-CCACCCACTGCCAATACAAC一3’，反义引物序列为5’-CGGAA CTYGACCCCTACAAA-3’。管家基因GAPDH正义引物序列为5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，反义引物序列为5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。PCR的反应体积为50 μl，循环参数为：94℃预变性3 min；94℃变性30 S，退火45 S，温度58℃，72℃延伸45 S。循环35次，取PCR产物10 μl，2%琼脂糖凝胶电泳．紫外灯下观察拍照。
2.6. 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件，计量资料用( ± s)描述，组间比较采用t-检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. 葛根素对大鼠血糖、体重的影响
如表1所示：DM组大鼠、葛根素干预组大鼠空腹血糖水平均显著高于正常对照组大鼠(P < 0.05)；DM组大鼠、葛根素干预组大鼠体重较正常对照组显著增加(P < 0.05)。而葛根素干预组大鼠与DM组大鼠空腹血糖水平、体重差异无统计学意义。
3.2. 肾脏组织病理学变化
3.2.1. 光镜结果(图1)示
相较于正常大鼠肾组织，DM组大鼠、葛根素干预组大鼠肾小球系膜及毛细血管基底膜区增宽，细末细胞增生，毛细血管基底膜局灶阶段性增厚。
3.2.2. 电镜结果(图2)显示
相对于正常大鼠肾组织，DM组大鼠肾小球破坏明显，肾小球结构多溶解，仅留有轮廓形态，肾小管多数溶解，部分肾小管上皮细胞核凝集，细胞质溶解，线粒体肿胀溶解。相对于DM组大鼠，葛根素干预组大鼠肾小球结构相对完整，可见肾小球内皮细胞、系膜细胞及足细胞核染色质高度凝集、边集，多数凝集成致密团快，呈现凋亡细胞的形态学改变，滤过屏障中基底膜完整，内皮细胞肿胀、增厚，足突肿胀，部分缺失；肾小管低倍镜下完整，上皮细胞核、肾小球呈凋亡细胞核的改变，细胞质内线粒体肿胀，体积增大。
3.3. 葛根素对肾组织中CXCR3/CXCL10mRNA表达的影响
DM组大鼠CXCR3 mRNA水平显著高于正常对照组大鼠(P < 0.05)；葛根素干预组大鼠CXCR3 mRNA水平较DM组显著降低(P < 0.05)。三组之间在CXCL10 mRNA水平上无统计学差异显示(P均 > 0.05) (见表2)。
Table 1. Effect of puerain on blood glucose and body weight of DM rats
表1. 葛根素对DM大鼠血糖、体重的影响(x ± s)
注：与正常对照组比较*P < 0.05。
Figure 1. Pathological morphology under the light microscope of each rat kidney. (a) normal rats; (b) DM rats; (c) puerarin-intervented rats
图1. 各组大鼠肾组织光镜下病理形态比较。(a) 正常组大鼠；(b) DM组大鼠；(c) 葛根素干预组
Figure 2. Pathological morphology under the electron microscope of each rat kidney. (a) normal rats; (b) DM rats; (c) puerarin-intervented rats
图2. 各组大鼠肾组织电镜下病理形态比较。(a) 正常组大鼠；(b) DM组大鼠；(c) 葛根素干预组
Table 2. Effect of of puerain on expressions of rat kidney CXCR3/CXCL10 mRNA
表2. 葛根素对肾组织中CXCR3/CXCL10mRNA表达的影响(x ± s)
注：与正常对照组比较*P < 0.05。与DM组比较&P < 0.05。
4. 讨论
DN是导致终末期肾病的主要原因之一。近年来越来越多的研究表明DN是一种炎症性疾病，在其发展的每一阶段都存在炎性细胞在肾脏的浸润，趋化因子/趋化因子受体是募集特异性炎性细胞至肾脏的主要参与者，在DN的发生发展过程中起着重要的作用 [3] 。此外，DM本身作为慢性炎症性疾病，其潜在的大血管和微血管病变都可能表现为趋化因子水平升高 [4] [5] 。
干扰素诱导蛋白-10(Interferon Induced Protein, IP)-10/CXCL10属于趋化因子超家族CXC类ELR(—)亚族，对多种炎症细胞包括T淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞具有趋化活性。血清CXCL10水平增加是1型和2型DN发生的危险因子；Wolkow等报道DM微量白蛋白尿患者尿液CXCL10水平增加，而且它们增高的程度与DM患者肾功能的进行性下降密切相关 [6] 。肾微血管损害的DM大鼠肾小管内皮细胞上CXCL10基因的表达选择性上调，伴有T细胞的浸润。另外，抗CXCL10抗体可以减少肾间质内浸润的T细胞数量，改善肾功能，但对巨噬细胞迁移无影响。
CXCL10通过与其受体CXCR3结合而发挥作用，CXCL10与CXCR3结合可导致免疫性1型DM患者胰岛β-细胞的选择性破坏 [8] 。CXCL10或CXCR3基因缺失能够降低1型DM的发生率 [7] 。
葛根素是从野葛或甘葛藤的根中提取的主要有效成分之一。葛根素通过多种作用对DM大鼠肾脏起到保护作用。首先葛根素可通过抑制血管紧张素系统的激活来阻止糖尿病肾病的发生 [8] 。另外，葛根素对非酶糖基化反应有明显抑制作用，对血浆及肾脏晚期糖基化终末产物的水平有明显抑制作用 [9] 。此外，还可通过调节基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达，影响肾小球细胞外基质的质和量，降低肾小球细胞外基质的沉积 [10] 。然而，截至目前为止，关于葛根素对DM大鼠肾组织炎症反应的影响尚未见相关研究。
我们的研究结果显示，葛根素干预组大鼠肾组织结构破坏程度明显减轻。而且，相较于DM组，葛根素干预组大鼠肾组织中趋化因子受体CXCR3的表达水平明显降低(p < 0.05)，但CXCL10的表达水平无明显降低。由此推测葛根素能够降低DM大鼠肾组织中CXCR3的表达，从而在一定程度上减轻DM大鼠肾脏的炎症反应，这可能也是葛根素改善DM大鼠肾组织损伤的原因之一，当然，尚需要更多的研究来证实该结果。
基金项目
国家自然科学基金(81270889)；甘肃省中医药科学技术研究课题(No. GZK-2012-35)。