AMB  >> Vol. 6 No. 4 (December 2017)

    羊栖菜岩藻甾醇提取物的抗氧化生物活性研究
    Antioxidant Activities of Fucosterol Extract from Sargassum fusiforme

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作者:  

赵 琳,王 韦,卢延斌:浙江工商大学海洋食品研究院,浙江 杭州

关键词:
羊栖菜岩藻甾醇抗氧化活性Sargassum fusiforme Fucosterol Antioxidant Activity

摘要:

研究了羊栖菜岩藻甾醇提取物的抗氧化生物活性。实验以VC和BHT作为阳性对照,分别对三种物质的总还原力、•DPPH自由基、 自由基以及•OH自由基进行了测定。结果表明:在20~200 µg/mL的实验浓度范围内,羊栖菜岩藻甾醇提取物表现出较好的抗氧化活性。
The antioxidant activity of fucosterol extract was assessed through the determination of •DPPH,   and •OH radical scavenging rate and compared with VC and BHT. The results show that fu-costerol extract from Sargassum fusiforme has good anti-oxidant activity in the concentration range of 20 - 200 µg/mL.

1. 引言

羊栖菜(Sargassum fusiforme)隶属褐藻门马尾藻科,是一种暖温带–亚热带性海藻,适宜生长于海水透明度较高、营养盐量丰富的海域。在我国,北至辽东半岛,南至闽粤沿海,其均有分布,其中尤以浙闽海域为盛;在日本、韩国以及朝鲜部分海域亦有分布 [1] [2] [3] 。抗氧化剂在日常生活中的应用愈发广泛,人工合成的抗氧化剂所导致的副作用日益凸显,天然抗氧化剂因其绿色、安全的优点而噬待开发。据相关文献报道,岩藻甾醇具有较强的抗氧化性 [4] 。本实验通过总还原力、·DPPH自由基清除率、 O 2 自由基清除率以及·OH自由基清除率对岩藻甾醇提取物的抗氧化活性进行初步探索,为后期其他天然抗氧化剂的研究开发提供一定的理论依据 [5] [6] 。

2. 材料与方法

2.1. 材料与试剂

新鲜羊栖菜购买于浙江省温州市洞头县,查阅《中国药典》相关规定,将羊栖菜湿样用清水冲洗,以去除泥沙,切碎,置于55˚C真空烘箱中恒温烘干至恒重,然后研制成粉末状,密封,在避光低温条件下储藏备用。·DPPH、VC、BHT、 O 2 、·OH购于阿拉丁试剂公司。其它化学试剂均购自杭州汇谱化工有限公司。

2.2. 仪器

Milli-Q超纯水装置,美国MILLIPORE公司;Evolution 60S紫外可见光分光光度计,美国Themo Fisher公司;iMARK酶标仪,美国Bio-Rad公司。

2.3. 实验方法

2.3.1. 羊栖菜岩藻甾醇粗提物的制备

称量约150 g的羊栖菜干粉,以甲醇–二氯甲烷(1:1, v/v)进行热回流提取,回流液经自然冷却后于高速冷冻离心机中以5000 rpm离心10 min (室温),取上清液后旋转蒸发,获得羊栖菜岩藻甾醇粗提物5.86 g,将岩藻甾醇提取物样品以95%乙醇进行溶解,配制成浓度分别为20 µg/mL、40 µg/mL、80 µg/mL、100 µg/mL、150 µg/mL、200 µg/mL的样品溶液。

2.3.2. 总还原力的测定

物质的总还原力是其潜在抗氧化性的标志。抗氧化剂因自身的还原能力而给出电子从而实现自由基的清除,总还原力越强,抗氧化性越强。因此通过总还原力的测定可以说明其抗氧化活性的强弱。岩藻甾醇提取物总还原力的测定参考相关文献 [7] 并稍作改动,具体实验操作如下:取各浓度样品溶液0.5 mL,向其中分别加入0.2 mol/L PBS缓冲液(pH = 6.6)和1% K3Fe(CN)6各1.25 mL,待其混合均匀后,于50˚C恒温水浴锅中反应20 min。取出后,加入1.25 mL 10%的三氯乙酸,混匀后以1000 rpm离心10 min。取上清液2.5 mL,并加入2.5 mL 95%乙醇以及1 mL 0.1%的FeCl3,混匀后测定其在700 nm下的吸光度。以VC、BHT重复上述实验作为阳性对照。为减小误差,各浓度样品均平行测定3次,取平均值。样品吸光度至越大,表明其总还原力越强。

2.3.3. ·DPPH自由基清除能力的测定

DPPH是以氮为中心的自由基,性质非常稳定,自身呈紫色,其在517 nm下有强烈的吸收。当待测物具有降低烷基自由基、过氧化自由基、羟基自由基及切断脂质过氧化反应等能力时,表明该待测物也具有清除·DPPH自由基能力。样品中氢与·DPPH相结合即·DPPH自由基中孤电子被配对时,其颜色由紫色逐渐变为黄色,直至反应结束,相应地,其在517 nm处的吸光度也逐步降低。因此可以通过吸光度的测定检验物质的清除·DPPH自由基的能力,进而为该物质的抗氧化能力给出参考 [8] 。

准确量取1 mL 1 × 10−4 mol/mL ·DPPH乙醇溶液,向其中加入1 mL样品溶液,混匀,氮气保护下,于暗处反应40 min后,用95%乙醇做参比液,测定反应体系在517 nm处的吸光度Ai;同时测定517 nm处1 mL ·DPPH溶液与等体积95%乙醇混合液的吸光度Ac及1 mL岩藻甾醇样品溶液与等体积乙醇95%混合液的吸光度Aj。以VC、BHT重复上述实验作为阳性对照。各浓度岩藻甾醇提取物样品溶液均平行测定3次,·DPPH自由基清除率的计算公式如下:

· DPPH ( % ) = [ 1 ( A i A j ) / A c ] × 100 % (1)

其中:

Ac—1 mLDPPH溶液加1 mL乙醇的吸光度;

Aj—1 mL样品溶液加1 mL乙醇的吸光度;

Ai—1 mL样品溶液加1 mL DPPH的吸光度。

2.3.4. O 2 自由基清除能力的测定

超氧阴离子( O 2 )是氧类自由基的基础,具有转化成其他自由基的能力。作为机体内存活时间最久的自由基,超氧阴离子自由基可以引发自由基链式反应,从而生成活性相对更强的自由基。由于超氧阴离子自由基具有较强的扩散性及靶向性,从而对机体造成多种伤害:钝化机体内SOD酶及含-SH的酶;氧化机体内抗坏血酸等。因此对 O 2 自由基的有效清除将极大地降低氧自由基的产生量 [9] 。

实验原理:邻苯三酚自氧化法。具体操作如下:将4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl (pH = 8.2)于25˚C恒温水浴中预热20 min后,分别向其中加入1 mL岩藻甾醇提取物样品溶液和0.4 mL 25 nmol/L邻苯三酚溶液,混匀并于25˚C水浴中准确反应5 min,立即向其中加入2滴8 mol/L的HCl以终止反应。在波长320 nm处,测定反应体系的吸光度Ai;另在预热20 min的Tris-HCl (pH = 8.2)中加入1 mL样品溶液和0.4 mL 95%乙醇,混匀后于25˚C水浴中准确反应5 min后,于320 nm测其吸光度Aj;在预热20 min Tris-HCl (pH = 8.2)中加入1 mL乙醇和0.4 mL 25 nmol/L邻苯三酚混匀后于25˚C水浴中准确反应5 min,作为对照,于320 nm测其吸光度Ac。以VC、BHT重复上述实验作为阳性对照。岩藻甾醇提取物 O 2 自由基清除率的计算公式如下:

O 2 ( % ) = [ 1 ( A i A j ) / A c ] × 100 % (2)

其中:

Ai—样品溶液加邻苯三酚溶液的吸光度;

Aj—样品溶液加乙醇的吸光度;

Ac—邻苯三酚溶液加乙醇的吸光度。

2.3.5.·OH自由基清除能力的测定

羟自由基(·OH)是机体内最为活泼的自由基,其可以通过解聚或聚合蛋白质、裂解核酸及脂类等促使细胞及组织发生病变,进而对机体造成巨大伤害。清除·OH自由基可以有效地预防早衰及心血管疾病等 [10] 。

实验原理:Fe2+与H2O2发生反应会产生·OH,其可以被水杨酸捕捉并产生有色物质,此有色物质在510 nm处有最大吸收。具体实验步骤为:取2 mmol/L FeSO4及6 mmol/LH2O2溶液各25 mL,充分混匀后,向其中加入6 mmol/L水杨酸75 mL,取1 mL混合液,加入1 mL 95%乙醇,将其于36.5˚C的恒温水浴锅中反应10 min后于波长510 nm下测吸光度A0;取混合液1 mL,加入1 mL待测样品溶液,于36.5˚C的恒温水浴锅中准确反应10 min后在波长510 nm下测吸光度Ax。以VC、BHT重复上述实验作为阳性对照。样品的·OH自由基清除率计算公式如下:

· OH ( % ) = ( A 0 A x ) / A 0 × 100 % (3)

其中:

A0—空白对照的吸光度;

Ax—加入样品溶液后测得的吸光度。

3. 结果与分析

3.1. 总还原力的测定

VC、BHT、岩藻甾醇提取物的总还原力测定结果如图1所示。实验所测浓度范围内,三者均具有一

Figure 1. Reducing power of VC, BHT and fucosterol extract

图1. VC、BHT、岩藻甾醇提取物的总还原力

定的还原能力,且三者的还原能力与各自浓度呈正相关。其中,在样品浓度低于40 µg/mL时,三者的还原能力相差不大,响应值均在0.3以内;在浓度在40~80 µg/mL范围内,VC的还原能力迅速提高;80 µg/mL以后,三者之间还原能力差距越来越大,基本呈现倍数关系。综合三者相比较,岩藻甾醇提取物的还原能力较低,VC的还原能力明显强于BHT和岩藻甾醇提取物。

3.2. ·DPPH自由基清除能力的测定

VC、BHT、岩藻甾醇提取物的·DPPH自由基清除能力测定结果如图2所示。VC、BHT、岩藻甾醇提取物在实验浓度范围内均表现出较强的·DPPH自由基清除能力,且清除能力与各自的浓度均呈正相关。其中,VC的·DPPH自由基清除能力明显强于岩藻甾醇提取物及BHT。当浓度在20~60 µg/mL范围内,岩藻甾醇提取物的清除能力最弱,但当浓度超过40 µg/mL时,随着浓度的增加,岩藻甾醇提取物的清除率上升幅度明显快于BHT;当浓度在60~150 µg/mL范围内,岩藻甾醇提取物的清除率均高于BHT,但当浓度超过80 µg/mL时,其清除率增幅逐渐趋于平缓而BHT的清除率增幅逐渐增大;当浓度在150~200 µg/mL范围内,岩藻甾醇提取物与BHT的·DPPH自由基清除能力基本持平。

3.3. O 2 自由基清除能力的测定

VC、BHT、岩藻甾醇提取物的 O 2 自由基清除能力测定结果如图3所示。VC、BHT、岩藻甾醇提取物在实验所测浓度范围内表现出较强的 O 2 自由基清除能力,且清除能力与各自的浓度均呈正相关。其中,当浓度为20 µg/mL时,岩藻甾醇提取物的清除率为6.27%,VC与BHT的清除率分别为12.06%和10.67%;当浓度增加到200 µg/mL时,岩藻甾醇提取物的清除率达到53.57%,而VC与BHT的清除率分别达到83.62%及81.20%。

3.4. ·OH自由基清除能力的测定

VC、BHT、岩藻甾醇提取物的·OH自由基清除能力测定结果如图4所示。VC、BHT、岩藻甾醇提

Figure 2. Scavenging activities of VC, BHT and fucosterol extract on ·DPPH

图2. VC、BHT、岩藻甾醇提取物的·DPPH自由基清除能力

Figure 3. Scavenging activities of VC, BHT, and fucosterol extract on O 2

图3. VC、BHT、岩藻甾醇提取物的 O 2 自由基清除能力

Figure 4. Scavenging activities of VC, BHT and fucosterol extract on ·OH

图4. VC、BHT、岩藻甾醇提取物的.OH自由基清除能力

取物在所测浓度范围内据具有清除·OH自由基的作用,且清除能力与各自的浓度均呈正相关。当浓度低于40 µg/mL时,三者的清除能力相差不大,均在30%以内;当浓度在40~80 µg/mL范围内,随着浓度的增加,BHT和岩藻甾醇提取物的清除能力增幅快于VC;当浓度超过80 µg/mL时,BHT的清除能力上升越来越快,而岩藻甾醇提取物和VC的清除率增幅相对逐渐趋于平缓;当浓度达到200 µg/mL时,BHT的·OH自由基清除率达到87.96%,岩藻甾醇提取物与VC的·OH自由基清除率分别为57.85%和56.33%。

4. 结论

本文对羊栖菜岩藻甾醇提取物进行系列的体外抗氧化生物活性试验。在20~200 µg/mL的实验所测浓度范围内,分别对总还原力、·DPPH自由基清除率、 O 2 自由基清除率以及·OH自由基清除率进行测定,并与VC、BHT两种抗氧化剂进行对比。结果表明:VC的总还原力最强、BHT次之,而岩藻甾醇提取物相对较弱;岩藻甾醇提取物的·DPPH自由基清除率较强,在浓度为60~140 µg/mL范围内,其清除率甚至超过了BHT;岩藻甾醇提取物的 O 2 自由基清除能力虽弱于VC和BHT,但当浓度为200 µg/mL时,其清除率亦达到53.5%;与VC相比,岩藻甾醇提取物的·OH自由基清除能力较强。综上所述,羊栖菜中岩藻甾醇提取物具有较好的抗氧化活性。

基金项目

浙江省自然科学基金项目(LY15C200004)。

文章引用:
赵琳, 王韦, 卢延斌. 羊栖菜岩藻甾醇提取物的抗氧化生物活性研究[J]. 微生物前沿, 2017, 6(4): 124-130. https://doi.org/10.12677/AMB.2017.64016

参考文献

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