临产前后胎盘上bcl-2、Fasl的表达与母血、羊水中ET-1、PGE₂浓度之间的关系

A Relationship between the Expressions of bcl-2 and Fasl in Placental and the Concentrations of ET-1 and PGE₂ in Maternal Blood and Amniotic Fluid on Labor Onset

摘要: 目的：探讨临产前后bcl-2、Fasl在胎盘滋养层细胞的蛋白表达变化及其与母血、羊水中内皮素-1 (Endothelin-1, ET-1)、前列腺素E₂ (ProstaglandinE₂, PGE₂)的浓度之间的关系。方法：53例足月妊娠妇女分成两组，其中临产组28例，未临产组25例。用免疫组化(Immunohistochemical, IHC)法测定胎盘滋养层细胞bcl-2、Fasl的蛋白表达，用放射免疫法测定孕妇母血、羊水中ET-1、PGE₂的浓度。结果：1) 临产组胎盘滋养层细胞bcl-2、Fasl的蛋白表达明显低于未临产组，两组平均灰度及阳性细胞率比较，差异有显著性(p < 0.05)。2) 临产组母血、羊水中ET-1、PGE₂水平均高于未临产组(p < 0.05)。3) 母血、羊水中ET-1的浓度与PGE2的浓度变化呈明显的正相关；母血、羊水中ET-1、PGE₂的变化与bcl-2的蛋白表达呈负相关(p < 0.05)，而与Fasl的表达不相关(p > 0.05)。结论：bcl-2、Fasl介导的胎盘滋养层细胞凋亡在启动分娩发动过程中具有重要作用；bcl-2的作用可能受ET-1、PGE₂等细胞因子的调控。

Abstract: Objective: To investigate the expressions of bcl-2 and Fasl proteins in placental trophoblastic cells on labor onset and their relationships with the concentrations of Endothelin-1 and Prostaglandin E₂ in maternal blood and amniotic fluid. Methods: Fifty-three women on term pregnancy were divided into two groups. One group on the time of labor onset was twenty-eight women. Another group not on the time of labor onset was twenty-five women. Expressions of bcl-2 and Fasl proteins in placental trophoblastic cells were detected by immunohistochemical assay. The concentrations of ET-1 and PGE₂ in maternal blood and amnionotic fluid were detected by radioimmune assay. Results: 1) Expressions of bcl-2 and Fasl proteins in the group of labor onset were significantly lower than that in the group of not labor onset. There was a statistically difference in the average gray scale and the ratio of positive cells between the two groups (p < 0.05). 2) The concentrations of ET-1 and PGE₂ in maternal blood and amniotic fluid of labor onset group were higher than that of not labor onset group (p < 0.05). 3) There was a positive correlation between the concentrations of ET-1 and PGE₂ in maternal blood and amniotic fluid, and the expression of bcl-2 proteins had a negative correlation with the concentrations of ET-1 and PGE₂ respectively, but there was no correlation between the expression of Fasl proteins and the concentrations of ET-1 and PGE₂. Conclusions: It was considered that the apoptosis of placental trophoblastic cells induced by bcl-2 and Fasl may play an important role in the initiation of term labor onset. ET-1 and PGE₂ may control the expression of bcl-2.

1. 引言

胎盘是母、儿在体内相互接触的部位，对妊娠的维持发挥着重要作用，但其在分娩中的作用尚不清楚。已有的研究表明，孕晚期胎盘存在细胞凋亡 [1] ，而一些细胞因子与分娩发动相关，可以推测这些细胞因子与胎盘凋亡可能有关。ET-1和PGE₂在分娩过程中发挥着重要的作用，而调控胎盘细胞凋亡的基因主要是bcl-2及Fasl [2] 。本课题应用免疫组化及放免方法，通过检测bcl-2及Fasl在正常足月妊娠妇女胎盘的表达以及母血、羊水中ET-1和PGE₂含量的测定，探讨分娩发动时胎盘凋亡与细胞因子之间的关系。

2. 资料与方法

2.1. 一般资料

该研究纳入病例均征得孕妇本人同意并签署知情同意书。2006年9月至11月53例足月妊娠住院孕妇根据临产状态分为未临产组及临产组。分类标准参照谢幸、苟文丽主编第8版《妇产科学》，如下：1) 未临产组25例：为骨盆狭窄或社会因素要求剖宫产，胎心监护仪显示无宫缩，肛查宫口未开。年龄20~34岁，孕龄37~41周，新生儿出生体重3000~3830 g。2) 临产组28例：均为经阴道自然分娩。年龄19~34岁，孕龄37~41周，新生儿出生体重3010~3700 g。两组孕妇均为初产妇，入选标准为无任何病理妊娠及妊娠并发症，产程中无特殊用药。入院时肝、肾功能检查正常，两组孕妇年龄、产次、孕龄及新生儿体重比较，差异无显著性(p > 0.05)。

2.2. 方法

2.2.1. 标本采集及处理

临产组于宫缩进入活跃期后抽取产妇肘正中静脉血4 ml，分成两份，各2 ml分别加入含EDTA 30 µl及抑肽酶40 µl的试管中，4℃，3000 r/min，离心10 min，分离血浆，分离样本标记后一起置−70℃冰箱保存。并于人工破膜时经前羊膜囊穿刺取羊水4 ml，4℃，3000 r/min，离心5 min后，取上清，分装两管，标记后置−70℃冰箱保存。未临产组于术前取血及术中切开子宫下段肌层后经胎膜取羊水，取法及处理同上。胎盘娩出后立即在母体面中央及四周边缘部各剪取组织一块，大小1 × 1 × 0、5 cm。生理盐水中漂洗干净，中性甲醛固定24小时，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋。

2.2.2. IHC检测胎盘滋养层bcl-2、Fasl的表达及计算机图象扫描分析

1) IHC染色SP法：试剂盒由福州迈新生物技术公司提供。标本制成4 µm切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，高温高压修复抗原，内源性过氧化物酶阻断10 min，PBS洗3 × 5 min，非免疫源性动物血清10 min，PBS洗3 × 5 min，一抗4℃冰箱过夜，PBS洗3 × 5 min，生物素化二抗10 min，PBS洗3 × 5 min，链亲和素-过氧化物酶10 min，PBS洗3 × 5 min，DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，自来水返蓝，中性树胶封片。2) 计算机图象扫描分析：采用15,400计算机图象分析仪对切片进行图象分析。每张切片随机选取10个绒毛，分别计算单个绒毛阳性细胞总面积及绒毛合体滋养细胞、细胞滋养细胞、间质细胞的总扫描面积、总灰度参数；用阳性细胞率(阳性细胞总面积/总扫描面积)及平均灰度(总灰度/总扫描面积)代表bcl-2、Fasl表达强度。

2.2.3. 放免法检测ET-1、PGE₂

采用非平衡法测定血浆和羊水中的ET-1、PGE₂浓度，药盒由解放军总医院东亚放免所提供。

2.2.4. 统计学分析

所有数据用SPSS 10.0统计学软件包处理。根据资料性质，分别采用t检验或t’检验；两因素相关分析用直线相关分析。结果均以( $\bar{x}\pm s$ )表示。

3. 结果

3.1. 两组胎盘绒毛滋养细胞计算机扫描定量分析结果

两组平均扫描视野和扫描面积比较，差异有显著性。(p < 0.05)平均灰度及阳性细胞率见表1。

3.2. 两组母血、羊水中ET-1、PGE₂检测结果

两组母血、羊水ET-1、PGE₂检测结果显示，临产组母血、羊水中ET-1、PGE₂值均明显高于未临产组，有差异显著性(p < 0.05)，见表2。

3.3. bcl-2、Fasl的表达与ET-1、PGE₂量之间的关系

bcl-2、Fasl平均灰度及阳性细胞率分别与母血、羊水中ET-1、PGE₂放免值作直线相关分析发现，bcl-2平均灰度及阳性细胞率分别与母血、羊水中ET-1、PGE₂浓度呈显著负相关，直线相关系数r有统计学意义(p < 0.05)。Fasl平均灰度及阳性细胞率与母血、羊水中ET-1、PGE₂浓度不相关(p > 0.05)。

4. 讨论

4.1. bcl-2、Fasl的表达与分娩发动的关系

bcl-2是胎盘凋亡的抑制基因 [1] 。在bcl-2高表达的组织，细胞凋亡相对较少，而低表达的组织，细胞凋亡增多。本实验应用免疫组化SP法对两组胎盘绒毛滋养层细胞进行染色后发现，在光镜下，bcl-2主要定位于合体滋养细胞，阳性颗粒分布于胞膜及胞浆上，阳性细胞呈弥漫性或局灶性分布。临产组及未临产组均有bcl-2表达，通过做图象分析使染色结果量化后发现，未临产组bcl-2表达的阳性细胞率及平均灰度高于临产组(p < 0.05)，证明未临产组bcl-2表达明显高于临产组。说明分娩发动状态下，bcl-2的表达是减少的，由于bcl-2的降低使其对胎盘滋养细胞的抑凋亡作用减弱，从而可能使细胞凋亡增加。研究结果表明，bcl-2介导的胎盘滋养层细胞凋亡是分娩发作中存在的一种现象，并可能在参与启动分娩发作方面起重要的作用。

另一个凋亡基因Fasl的测定结果显示，胎盘绒毛细胞滋养细胞、合体滋养细胞、间质细胞均有Fasl的表达，阳性颗粒分布于胞浆。光镜下两组Fasl在滋养细胞的表达皆以中度及弱阳性为主，强阳性不多，与文献报道的观察结果一致 [2] 。但进一步作图象分析量化后发现，未临产组Fasl的阳性细胞率及平均灰度仍大于临产组，统计学检验，差别有显著性(p < 0.05)。已知Fasl是Fas的配体，二者结合后，能引起表达Fas的淋巴细胞凋亡，本实验结果推测，临产组低Fasl的表达可能与分娩发动有关，由于Fasl的降低，使Fas阳性表达的淋巴细胞凋亡减少，从而使母体对胎儿及胎盘的免疫反应增强，引起分娩发作。

Table 1. Comparison of two groups of placental bcl-2 and Fasl gene expression ( x ¯ ± s )

表1. 两组胎盘bcl-2、Fasl基因表达的比较( $\bar{x}\pm s$ )

注：与未临产组比较¹⁾ p < 0.05。

Table 2. Two groups of maternal blood and amniotic fluid ET-1, the concentration of PGE2 ( x ¯ ± s )

表2. 两组母血、羊水中ET-1、PGE₂浓度比较( $\bar{x}\pm s$ )

注：与未临产组比较¹⁾p < 0.05。

4.2. ET-1、PGE₂与分娩发动的关系

已知前列腺素(Prostaglandins, PG_S)为人体多种生理及病理代谢调节的中介物。已有的研究表明，人胎膜局部释放的PGE₂可引起子宫平滑肌收缩和宫颈成熟，且其促宫缩作用比缩宫素强 [3] 。已知羊膜是合成PGE₂的主要部位，这与羊膜层主要表达前列腺素合成酶(Prostaglandin endoperoxide H synthase, PGHS)活性有关，绒毛膜中也存在少许PGHS活性。

ET是一组有强的血管收缩作用的多肽类物质，本实验测定了与妊娠关系密切的母血及羊水中的ET-1浓度。发现临产组母血及羊水中ET-1浓度分别明显大于未临产组。且临产组浓度较正常值(50.8 ± 7.58)成倍数关系。由此说明，ET与分娩发作关系密切。研究证明，ET有强的子宫收缩作用，并可刺激羊膜上PGE₂的形成 [4] ，子宫肌上存在ET受体，ET与其受体结合后，使胞内 ${\text{G}}_{\text{a}}^{2+}$ 浓度升高，引起宫缩 [5] ，同时，羊水中ET的作用使PGE₂形成增多，PGE₂作用于子宫平滑肌，进一步加强宫缩，促进分娩发作。

4.3. bcl-2、Fasl的表达与ET-1、PGE₂的关系

bcl-2、Fasl的阳性细胞率、平均灰度分别与母血、羊水中的ET-1、PGE₂浓度进行相关分析后发现，胎盘凋亡基因bcl-2的表达与母血、羊水中的ET-1、PGE₂的量呈显著负相关，相关系数r统计学检验有意义(p < 0.05)，说明ET-1、PGE₂可能对bcl-2的表达存在负性调节作用。目前研究表明，前列腺素可诱导足月妊娠胎盘滋养层细胞发生凋亡 [6] ，而ET-1有促进前列腺素合成的作用，本实验结果认为，ET-1是通过促进PGE₂的合成而增加滋养层细胞凋亡的。而实验证实，在人体的胃肠道等部位，PGE₂的促凋亡作用是通过抑制bcl-2的表达而实现的。并且可能也适用于其他组织 [7] 。本实验中，ET-1、PGE₂与bcl-2呈明显的负相关，因此ET-1通过PGE₂增加滋养层细胞凋亡的作用可能也是通过抑制bcl-2基因的表达而实现的。而胎盘凋亡基因Fasl的表达与母血、羊水中的EGF、ET的量不相关，相关系数r统计学检验无意义(p > 0.05)，说明临产后Fasl的低表达与前列腺素作用可能无关，可能是临产后胎盘表达的一种生理现象，但在启动母胎免疫机制上却发挥重要的作用。