HJAS  >> Vol. 7 No. 9 (December 2017)

    蛋白质组学研究方法在蚕丝学中的应用
    Application of the Technology about Proteomics in Sericulture Research

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作者:  

代君君,舒 蕊,刘 健,章玉萍,陈 明,张丽丽,范 涛:安徽省农业科学院蚕桑研究所,安徽 合肥

关键词:
家蚕蛋白质组研究方法进展应用Silkworm Proteome Research Technology Progress Application

摘要:

家蚕既是具有重要经济价值的绢丝昆虫,又是现代生命科学研究的模式生物。近年来,随着蛋白质组学研究技术的飞速发展,有关家蚕性腺、丝腺、血液、中肠、触角等重要组织器官蛋白质组学的研究取得了很大进展,为揭示家蚕重要性状的形成机制、生殖发育调控、组织器官功能、天然免疫等方面提供了丰富的信息。文章对此作了简要的综述,并结合基因组学、生物信息学的研究技术,讨论了家蚕蛋白质组学今后的发展趋势及其应用前景。

Silkworm (Bombyx mori) is not only an important economic insect, but also a model organism in modern life science research. In recent years, with the rapid progress in proteomics research technology, proteomic research of essential organs such as silkworm gonad, silk gland, midgut, hemolymph, antennae and other important organs has made great progress. An abundant infor-mation resource is provided by the results of these researches for revealing the important char-acters of silkworm formation mechanism, reproductive and developmental regulation, tissues and organs function, innate immunity, et al. A brief review is given in this paper for discussing the future development trend and application prospect of silkworm proteomics in combination with genomics and bioinformatics.

1. 引言

随着基因组测序及生物信息技术的成熟及商品化,越来越多生物的基因组完成了测序及分析工作,研究重心已开始从揭示生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对大分子功能的研究,随着基因组学研究的不断深入,人们发现简单的DNA序列并不能揭示蛋白质水平的表达情况,科学家们又进一步提出了后基因组计划。蛋白质组(proteome)便成为其中一个很重要的研究内容,为进一步了解基因的表达、功能和调控提供了基础。蛋白质组一词是澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams在1994年首次提出 [1] ,蛋白质组学研究作为功能基因组的重要支柱,不仅可实现与基因组的对接与关联,而且可直接揭示细胞各项功能、各种生理、生化过程及疾病的病理过程等生命活动规律和本质,可以为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、新陈代谢途径研究等提供理论依据和基础,从而全景式地揭示生命活动的本质。

2. 蛋白质组学研究技术

蛋白质组学主要研究蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质的相互作用等内容,蛋白质组研究的技术手段包括蛋白质样本的制备、分离、定量及鉴定等,有双向凝胶电泳、质谱技术、酵母双杂交系统、蛋白质微阵列技术、生物信息学技术等。蛋白质分离是蛋白质组学研究的核心和前提,它在蛋白质组研究中把复杂的蛋白质样品分离成简单的单个蛋白或者一小群蛋白,使得比较2个样品间蛋白质的差异更加容易比较,比较常用的蛋白分离技术是双向电泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)技术 [2] ,此外,还有一维凝胶电泳(one-dimensional gel electrophoresis, 1-DGE)、高效液相色谱(high-performance liquid chromatography, HPLC)、毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)、等电聚焦(isoelectric focusing, IEF)和亲和层析(affinity chromatography)等技术,如把这些技术加以整合后可以产生功能更为强大的蛋白质多维分离技术。蛋白质间相互作用是细胞生命活动的基础和特征,酵母双杂交系统、噬菌体展示技术等不但可用于检验蛋白质之间及蛋白质与小分子肽、DNA、RNA之间的相互作用,而且能用于发现新的功能蛋白质。蛋白质生物信息分析技术是应用蛋白质分析软件对有价值的蛋白进行分析和预测,可以实现对蛋白质的等电点、分子量、酶切特性、疏水性、电荷分布等物理性质预测,对已知蛋白质的一级结构、二级结构、三级结构等物化性质进行分析,从而可以对已知或者未知的基因产物进行功能上全面的分析和预测。蛋白质组学定量技术可以实现对蛋白质表达水平及其变化的检测,一种是基于传统双向凝胶电泳及染色基础上的定量,另外一种是基于质谱检测技术的定量。

3. 蛋白质组学研究技术在蚕丝学研究中的应用

由于蛋白质是生命活动的直接执行者,蛋白质组学是后基因组时代的一门学科,对推动生命科学的发展起着重要的作用,蛋白质组学研究技术在蚕丝学研究中的应用越来越广泛。家蚕作为经典的鳞翅目模式生物,早已经建立完成了基因组精细图谱,并且也积累了蛋白质组学研究的许多数据。将这些数据归类整理并建库,对家蚕蛋白质组学研究有着非常重要的意义。家蚕蛋白质组研究是以家蚕及其不同组织器官为材料,采用双向电泳分离技术、质谱分析、生物信息学分析等技术,建立相关图谱库及家蚕蛋白质组数据库,它的应用目前主要集中在生理生化、病理、发育、组织器官的功能基础等方面。

3.1. 蛋白质组学在家蚕生殖及胚胎发育研究中的应用

家蚕是一种重要的经济昆虫,研究家蚕的生殖和胚胎发育,对人类提高家蚕经济价值,利用自然界有益昆虫以及防治有害昆虫具有重要的理论意义和实用价值。毛立明等利用蛋白质双向凝胶电泳和图像分析技术分析了家蚕蛹期第二天的雌雄生殖腺细胞蛋白 [3] ,发现了生殖腺除了形态上的明显差异外,总蛋白也存在许多差异。陈金娥 [4] 用shotgun的策略研究了家蚕P50品种五龄第5天幼虫精巢和卵巢组织的蛋白质组,推测致死基因l2的表达一定程度上影响了胚胎发育过程中的有丝分裂和形态发生过程。王晓欢 [5] 对家蚕雄蛾附腺研究表明发现BmAGSP3,BmAGSP4在雄蛾第1天的附腺组织中特异高量表达,在雄蛾附腺组织中BmAGSP3的表达量很少,而BmAGSP4的表达量较多,推测出BmAGSP4蛋白通过雌雄交配进入雌蛾体内后,可能参与影响雌蛾的产卵。陈玉华 [6] 鉴定了家蚕5龄幼虫和蛹中期精巢蛋白质组,建立了生精囊体外培养系,研究发现家蚕生精囊体外培养时对外源物质敏感,可用作化学物质毒理初筛实验。钟伯雄 [7] 研究了家蚕胚胎期蛋白质组成变化情况,发现从临界期到点青期,家蚕体内卵特异性蛋白、30 K蛋白表达量较高;由点青期到转青期再到蚁蚕期,家蚕体内酸性蛋白明显增多,卵特异性蛋白、30 K蛋白逐渐消失。

3.2. 蛋白质组学在家蚕丝腺及茧丝性状研究中的应用

丝腺是合成分泌丝蛋白、决定蚕丝产量和质量的重要组织器官,其在五龄期间形态、功能上都发生显著变化。刘鸿丽 [8] 等通过对家蚕中部丝腺组织的蛋白质进行分离,对其中一些表达量较高的蛋白点进行鉴定,分离出500个以上和100个以上的蛋白点,建立了一整套适合于家蚕蛋白质组研究的方法。颜新培 [9] 等对家蚕同一品种不同个体,及同一个体后部丝腺细胞的蛋白质组成研究后发现其构成基本一致,推测其新陈代谢水平基本无差异。靳远祥 [10] 等分别对家蚕限性黄茧品种雌蚕(黄茧)和雄蚕(白茧)的中部丝腺组织蛋白质组成进行比较分析,黄茧中部丝腺组织一些蛋白的表达水平明显高于白茧,且有2种蛋白只在黄茧中表达,推测这些差异蛋白可能与有色茧丝的形成有关,或是与W染色体的易位片段上其它未知基因有关。统飞英 [11] 等对5龄家蚕中部丝腺细胞不同区段蛋白组成进行研究,发现不同区段存在显著差异。吴卫成 [12] 等对家蚕4龄眠期和5龄期后部丝腺细胞蛋白组成进行分析,发现不同发育时期蛋白组成存在差异。Zhang [13] 等对家蚕P25家族糖基化异构体进行蛋白质组学研究,发现在丝腺中也存在P25异构体,因此推测P25的异构体可能发生糖基化或磷酸化。张利平 [14] 等研究表明后部丝腺的蛋白质表达水平与普通丝量品系和高丝量品系之间有差异,且差异表达蛋白种类主要为应激反应相关蛋白、能量相关蛋白、蛋白质合成相关蛋白和一些酶类,推测在茧丝突变品系Ndx的后部丝腺中,上述蛋白质表达量的变化可能是导致其不能正常吐丝结茧的原因。兰天云 [15] 等研究表明P50蚕品种五龄第一天、第三天、第五天、第七天及熟蚕后部丝腺蛋白质和磷酸化蛋白质表达有变化,并鉴定出73个蛋白斑点。对家蚕后部丝腺发育过程60个磷酸化蛋白质进行质谱分析,成功鉴定其中30个,表明后部丝腺的变化与蛋白质磷酸化 修饰关系不大。余芳 [16] 等研究表明家蚕裸蛹品种的丝腺细胞蛋白斑点与正常茧品种的蛋白斑点的匹配率仅在65%左右,且存在35%左右的特异蛋白斑点,暗示裸蛹性状可能是主效基因控制的微效多基因遗传;且正常茧、薄皮茧和裸蛹3个品种后部丝腺细胞中特异蛋白斑点及上调和下调蛋白斑点中,可能分别存在着与家蚕高茧层量性状、结薄皮茧性状以及不结茧性状有关的蛋白质。尤征英 [17] 研究表明Nd和Nd-s这2个低丝量的突变品种的茧丝关键蛋白表达量下降,丝腺发育相关的蛋白表达下调,丝蛋白合成及信号通路相关的蛋白表达下调,丝蛋白的分泌及运输途径相关的蛋白也受到影响,大量的能量被空耗到无效的代谢途径上,最终影响了丝蛋白的高效合成。沈飞英 [18] 等对家蚕品种大造中部丝腺不同时期不同部位的丝腺细胞蛋白质组成进行了研究,发现5龄第2天、第4天和熟蚕不同时期的中部丝腺细胞蛋白质以及5龄第2天的中部丝腺前、中、后3个不同区段的细胞蛋白质组成具有显著差异。通过对丝腺蛋白的研究有利于阐明家蚕分泌丝素蛋白及蚕茧优质高产的机理,为深入研究利用丝蛋白的合成、分泌和基因表达提供了丰富的信息。

4. 蛋白质组学在家蚕中肠及相关免疫研究中的应用

中肠是家蚕消化器官最发达的部分,它不仅是消化吸收食物的场所,也是进行物质和能量代谢的重要器官,参与着消化、代谢、氧化还原反应等复杂的生物学过程。对家蚕中肠蛋白组的研究将有助于人们从蛋白质水平认识家蚕中肠组织的生理功能。Kajiwara H. [19] 对5龄第3天家蚕中肠组织蛋白进行了双向电泳分析研究,发现其中包含了大量的肌肉运动蛋白、ATP酶、细胞骨架、分子伴侣等。侯勇 [20] 等研究表明家蚕中肠蛋白质主要集中在分子量15~80 kD区域,等电点3~8.5之间。成功鉴定了包括原肌球蛋白以及大量的离子转运蛋白、与代谢相关的酶、与信号传导和细胞凋亡相关的蛋白等32个蛋白点。姚慧鹏 [21] 等利用双向电泳技术对家蚕幼虫5龄期第2天、第5天和第7天的中肠蛋白质进行分离和鉴定,研究发现了构成家蚕中肠组织的一些新的部分结构蛋白和一些可能与消化、吸收相关的蛋白,以及一些能够抵御外界微生物入侵的相关蛋白。

家蚕对病原微生物的免疫力差,蚕病一直威胁着蚕业的安全生产,所以蚕体免疫的研究不仅具有重要的产业价值,而且具有模式研究的科学意义。蔡克亚 [22] 等利用遗传学的原理,通过杂交和回交的方法,建立家蚕抗BmNPV、感BmNPV以及近等基因系模型,利用2-D电泳和MALDI TOF/TOF MS质谱技术,从蛋白质组水平上研究家蚕对BmNPV抵抗性。获得家蚕高抗NB、高感306、近等基因系BC8五龄起蚕血淋巴液蛋白质差异表达谱,共获得明显差异蛋白点12个,初步推测是家蚕抗BmNPV特有蛋白。姜姗彤 [23] 以家蚕围食膜作为研究对象,利用蛋白质组学技术对BmNPV抗性、感性及其近等基因的围食膜的蛋白质表达谱以及差异表达谱进行分析,为进一步探索家蚕对BmNPV病毒的抗病机理奠定基础。周洪英 [24] 等归纳了近年蛋白质组学在家蚕及其他昆虫被细菌感染中的运用,推断出蛋白质组在家蚕感染研究中的运用,将帮助人们发现更多的免疫相关因子,了解昆虫免疫调控机制。崔颖俊 [25] 研究表明家蚕幼虫消化液中的蛋白质种类较少、分子量小、分布集中;在8个鉴定的蛋白点中,1个是30 kP蛋白酶A原,5个是类胰蛋白酶,其它2个是碱性丝氨酸蛋白酶。Kyung H. S. [26] 等人利用巨大芽孢杆菌对5龄第4天家蚕进行了注射诱导,结果发现诱导后6小时的血液当中,有30个蛋白发生了上调反应。利用生物质谱对这些点进行鉴定后发现它们当中不仅包括先天免疫相关蛋白,还包括一些不属于先天免疫途径的蛋白,推测他们可能以其他的某种方式参与到家蚕免疫反应当中。

5. 蛋白质组学在家蚕其他组织相关研究中的应用

家蚕的脂肪体、表皮、马氏管、血液等组织对家蚕的营养储存、物质代谢、适应复杂的生存环境、生物防御等起着至关重要的作用,作为具有巨大经济价值的家蚕,其相关组织蛋白组学的研究越来越受人们的关注。钟伯雄 [27] 构建了5龄家蚕若干组织的蛋白质数据库。罗冰 [28] 等建立了家蚕蛋白质数据库系统(SWPDB),该系统已经收录了家蚕大造品种(P50)胚胎形成期的卵、5龄第3天中部、后部丝腺、血液、中肠、表皮、气管、精巢,5龄第5天马氏管,5龄第5天、上蔟第2天脂肪体和化蛹第1天马氏管、化蛹第1天、化蛾第1天精巢、蛾期鳞毛,以及丝腺突变品种Ndx、21~872的第5天幼虫后部丝腺等家蚕组织器官等蛋白质的相关信息数据。侯勇 [29] 等研究发现,经过双向凝胶电泳及其图象分析技术,银染可以分离出722个清晰蛋白点,其中包括了大量参与代谢的酶类、不同分子量的热激蛋白、重要的血液蛋白30 K,Actin3等。程道军 [30] 等曾对家蚕不同时期的脂肪体EST数据进行过整体分析,比较了幼虫、蛹、成虫脂肪体的基因表达差异。沈以红等人也对五龄第3天脂肪体的EST进行过拼接和整理 [31] 。程廷才 [32] 等利用细菌感染后的脂肪体研究了抗菌肽基因表达情况。Moghaddam [33] 等研究了耐热性(多化性)和热敏感性(二化性)的家蚕品种在热冲击下脂肪体蛋白质组学的变化。他们的研究结果都表明,脂肪体作为家蚕的重要器官,参与了许多重要的生命活动。靳远祥 [34] 等运用双向电泳和生物质谱相结合的研究方法,以常规家蚕品种与Ng突变品种为材料,对不同发育时期的雌性附腺(化蛹第9、10、11、12天及羽化第l天)分泌部蛋白质组成进行了比较,研究表明不同发育时期的蛋白分布图基本相似,并初步鉴定了其中的一些差异蛋白。Zhang [35] 等对幼虫期和蛹期节间肌蛋白质组进行了比较,推测出肌钙蛋白I在家蚕由幼虫向蛹的变态发育过程中起着十分重要的作用。

6. 蛋白质组学在蚕丝学研究中的展望

家蚕蛋白质组研究虽然已经从各个不同的层面开展了一系列研究,并且已取得一定的研究成果,但是由于蛋白质组学的研究仍依托双向凝胶电泳与生物质谱分析等关键技术,由于双向凝胶电泳技术尚未完善,在实践操作过程中还存在一些不足,如重复性差,疏水蛋白、低表达量蛋白、极酸和极碱性蛋白、分子量较小和较大蛋白的分离较为困难,对于低丰度蛋白质的检测精确度不高,高通量自动化的研究技术尚未实现 [36] 。蛋白质数据库的完善和生物信息学技术的发展为快速分析蛋白的生物学功能提供了强有力的工具 [37] ,因此,在进一步探讨与研究家蚕蛋白质组学的分离与鉴定研究技术的同时加强蛋白质组学与生物信息学的研究,对现有的家蚕基因组功能研究鉴定和补充,完成基因组功能注释以及表达调控规律的解析都具有推动性的作用,从而使生命科学与蚕业科学研究的手段更加先进。

目前家蚕蛋白质组学已经在生殖发育、组织器官、生理生化、病理方面进行了研究。蛋白组学研究的重点将从蛋白表达转向蛋白功能研究,但学者们所获得的研究结论还未形成一个完整的系统。完整的家蚕蛋白组学还要深入研究蛋白质合成、转运、修饰以及蛋白质之间相互作用复杂的网络关系,这将是蛋白质组学研究的一项长期而又艰巨的任务。在蚕学研究中应以家蚕及其组织器官为材料,在建立完善的蛋白质组图谱和丰富的数据库基础上,结合家蚕基因组最新研究成果,利用家蚕丰富的遗传资源,阐明家蚕重要生物学性状的形成机制、主要病害的致病机理及相关功能基因的作用。生产上利用差异蛋白质组学技术,发现与家蚕重要经济性状(高产、优质和抗病性)相关的功能蛋白,探明它们的作用机制和调控模式,加以研究和利用。尽管国内外开展家蚕蛋白质组研究的时间还不长,但已取得了可喜的研究进展。有关功能基因组和蛋白质组的研究应可以为蚕业发展提供创新的技术平台,以提升和改造传统的蚕丝业,培育蚕丝业新的经济增长点。

基金项目

国家蚕桑产业技术体系合肥综合试验站(CARS-22-SYZ09)。

NOTES

*通讯作者。

文章引用:
代君君, 舒蕊, 刘健, 章玉萍, 陈明, 张丽丽, 范涛. 蛋白质组学研究方法在蚕丝学中的应用[J]. 农业科学, 2017, 7(9): 686-692. https://doi.org/10.12677/HJAS.2017.79093

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