AMB  >> Vol. 6 No. 4 (December 2017)

    猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立
    Development of a Duplex RT-PCR Targeting Both N Gene and S Gene for Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

  • 全文下载: PDF(840KB) HTML   XML   PP.131-136   DOI: 10.12677/AMB.2017.64017  
  • 下载量: 412  浏览量: 1,721   科研立项经费支持

作者:  

桑益旸,吴 昊,涂光岚,孙 涛,王恒安:上海交通大学农业与生物学院,上海市兽医生物技术重点实验室,上海

关键词:
猪流行性腹泻病毒双重RT-PCRN基因S基因Porcine Epidemic Diarrhea Virus Duplex RT-PCR N Gene S Gene

摘要:

为提高临床检测的准确性,基于N基因和S基因,建立了检测猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)的双重RT-PCR检测方法。在20 μL反应体系中,该双重RT-PCR可检测105拷贝的PEDV cDNA,检测传染性胃肠炎病毒、繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒和圆环病毒2型、乙型脑炎病毒、猪瘟病毒等几种猪病疫苗毒的结果均为阴性,表明该方法具良好的特异性和灵敏性。临床样品检测结果表明该双重RT-PCR能满足临床检测需要,可一定程度弥补单重RT-PCR漏检的不足。

To improve the correct probabilities for detection of clinical samples, a duplex RT-PCR targeting both N gene and S gene for detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) was developed. In a 20 μL reaction system, 105 copies of PEDV cDNA could be detected and with no cross reaction with Transmissible Gastroenteritis Virus (TGV), Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV), Pseudorabies Virus (PRV), Porcine Circovirus 2 (PCV2), Swine epidemic encephalitis B (SEEBV), Swine fever virus (SFV), showing high sensitivity and specificity. The results of clinical sample detection indicated that the established duplex RT-PCR could meet clinical detection and make up the defect of singleplex RT-PCR.

1. 引言

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)引发的急性肠道传染病,1978年从比利时发病猪病料中分离病毒获得成功,毒株命名为CV777 [1] 。2010年7月,我国发现新的强毒力的PEDV毒株,并爆发一轮全国性的PED疫情 [2] [3] ,美国于2013年发现PEDV强毒株 [4] ,随后爆发了猪流行性腹泻全美大流行。

CV777毒株的全基因组序列于2001年公布 [5] ,PEDV为单链正义RNA病毒,其基因组全长约28 Kb,编码4种主要结构蛋白:纤突蛋白S、小膜蛋白E、膜蛋白M和核衣壳蛋白N。目前,GenBank已收录PEDV基因组序列431个,研究发现PEDV的变异比较快 [6] ,且临床粪便样品成分复杂,有时会影响常规单重RT-PCR检测结果的准确性,而猪群发病时能否快速、准确地检测PEDV是决定防控效果的关键因素之一。

本研究基于N和S基因,建立了检测PEDV的双重RT-PCR检测方法,有望弥补单重RT-PCR准确性欠缺的不足。

2. 材料和方法

2.1. 材料

2.1.1. 病毒材料

猪流行性腹泻病毒毒株SH-2012-5由孙涛教授实验室保存;猪的几种常见病毒病活疫苗(TGEV, PRRSV, PRV, PCV2, SEEBV, SFV)为中牧公司产品;临床哺乳仔猪粪便样本收集自上海及周边省份发病猪场。

2.1.2. 试剂

RNA抽提试剂TRIZOL LS、无RNase的DNase I为Invitrogen公司产品;反转录试剂盒为Takara公司产品;PCR扩增试剂盒ES Taq PCR mix为全式金公司产品;Gel Extraction Kit为OMEGA公司产品;Generuler 1Kb DNA Ladder为Fermentas公司产品;引物由上海生工公司合成。

2.2. 方法

2.2.1. 病毒RNA提取及cDNA制备

保存毒株及病毒样品以PBS适当稀释后,4˚C,12,000 rpm离心5 min。取上清250 μL与750 μL TRIZOL LS Reagent混合,室温放置5 min。加入200 μL三氯甲烷,剧烈振荡15 s,室温放置5 min。4˚C,12,000 rpm离心15 min。取上层无色水相500 μL与500 μL异丙醇混合,室温放置5分钟。4˚C,12,000 rpm离心8 min。弃去上清,用1 mL 75%乙醇洗涤沉淀,4˚C,7500 rpm离心5 min。弃上清,晾干3分钟,用55˚C预热的RNase free ddH2O 20 μL溶解RNA沉淀,并用无RNase的DNase I处理。

取8 μL RNA溶液(<5 μg)与1 μL随机引物、1 μL dNTPs混匀,65˚C保温5分钟后,在冰上迅速冷却数分钟。加入4 μL 5 × Prime Script II Buffer、0.5 μL RNase inhibitor、1 μL Prime Script II RTase、4.5 μL RNase free ddH2O,混匀。经30˚C 10 min、42˚C 60 min、70˚C 15 min孵育,得cDNA,−80˚C保存备用。

2.2.2. N、S基因单重RT-PCR

根据GenBank已收录的PEDV基因组序列,利用Multi-alignment软件分析,分别在N基因和S基因的保守区域设计引物,其中引物对P1:5’-ATGGCTTCTGTCAGTTTTC-3’和P2:5’- CGAAGTGGCTCTGGATTTGTT-3’ 用于N基因的RT-PCR扩增,引物对P3:5’- ATGAAGTCTTTAACCTAC-3’和P4:5’-GCAACACGGGACCAATCATT-3’用于S基因的RT-PCR扩增。优化引物设计和反应条件后,N、S基因的单重RT-PCR扩增体系均为20 μL:1 μL cDNA模板、1 μL上游引物、1 μL下游引物、10 μL ES Taq Master Mix、7 μL ddH2O;扩增程序为:95˚C 3 min;95˚C 10 s、58˚C 30 s、72˚C 45 s,30个循环;72˚C 10 min。

2.2.3. N、S基因双重RT-PCR

N/S基因双重RT-PCR的反应体系为20 μL:1 μL cDNA模板、1 μL各个引物、10 μL ES Taq Master Mix、5 μL ddH2O;优化后扩增循环为:95˚C 3 min;95˚C 10 s、58˚C 30 s、72˚C 60 s,30个循环;72˚C 10 min。

2.2.4. 特异性试验

采购几种常见猪病毒病活疫苗,病毒RNA同上抽提并进行反转录,病毒DNA按常规方法抽提。首先测试N、S基因单重RT-PCR的特异性,在单重RT-PCR表现良好特异性的基础上,再测试N/S基因双重RT-PCR的特异性。

2.2.5. 灵敏性试验

以实验室已建立的TaqMan探针荧光定量RT-qPCR定量检测毒株SH-2012-5样品,调整其cDNA浓度为1.0 × 109/μL,用灭菌ddH2O作连续10倍梯度稀释,用于单重和双重RT-PCR的灵敏度测试。

2.2.6. 双重RT-PCR检测临床样品

利用建立的双重RT-PCR检测临床发病仔猪的粪便样品。

3. 结果

3.1. N、S基因单重RT-PCR的特异性

图1可见,针对N基因的引物对只在PEDV中扩增出800 bp左右的片段,扩增产物与预期的809 bp大小一致,进一步的测序分析确认该扩增产物为PEDV的N基因,而TGEV、PRRSV、PRV、PCV2、SEEBV和SFV的扩增结果均为阴性。针对S基因的引物对只在PEDV中扩增出550 bp左右的产物,扩增产物与预期的559 bp大小一致(图2),测序分析确认该扩增产物为PEDV的S基因,而TGEV、PRRSV、PRV、PCV2、SEEBV和SFV的扩增结果也均为阴性,上述结果表明两对引物的特异性良好。

3.2. N、S基因单重RT-PCR的灵敏性

N基因单重RT-PCR可检测1 × 104拷贝的毒株SH-2012-5的cDNA (图3)。S基因单重RT-PCR则可检测1 × 105拷贝的病毒cDNA (图4)。

M: DNA Marker; 1~7:PEDV, TGV, PRRSV, PRV, PCV2, SEEBV and SFV, respectively

Figure 1. Specificity test of single-plex RT-PCR for N gene amplification

图1. N基因单重RT-PCR特异性试验

M: DNA Marker; 1~7:PEDV, TGV, PRRSV, PRV, PCV2, SEEBV and SFV, respectively

Figure 2. Specificity test of single-plex RT-PCR for S gene amplification

图2. S基因单重RT-PCR特异性试验

M:DNA Marker;1~9:109、108、107、106、105、104、103、102、101拷贝数的PEDV cDNA

Figure 3. Sensitivity test of single-plex RT-PCR for N gene amplification

图3. N基因单重RT-PCR灵敏性试验

3.3. N、S基因双重RT-PCR的特异性

图5可见,只有PEDV的扩增产物为两条带,且大小与单重RT-PCR的扩增产物大小一致,而TGEV、PRRSV、PRV、PCV2、SEEBV和SFV的扩增结果均为阴性。

3.4. N、S基因双重RT-PCR的灵敏性

图6显示两条特异性条带,大小分别与单重RT-PCR一致,可检测105拷贝的毒株SH-2012-5的cDNA。

3.5. 双重RT-PCR检测临床样品

利用所建立的双重RT-PCR检测10个临床样本,其中,9个样本可扩增两个特异性条带,但有1个

M:DNA Marker;1~9:109、108、107、106、105、104、103、102、101拷贝数的PEDV cDNA

Figure 4. Sensitivity test of single-plex RT-PCR for S gene amplification

图4. S基因单重RT-PCR灵敏性试验

M: DNA Marker; 1~7:PEDV, TGV, PRRSV, PRV, PCV2, SEEBV and SFV, respectively

Figure 5. Specificity test of duplex RT-PCR for N/S genes amplification

图5. N/S基因双重RT-PCR特异性试验

M:DNA Marker;1~9:109、108、107、106、105、104、103、102、101拷贝数的PEDV cDNA

Figure 6. Sensitivity test of duplex RT-PCR for N/S genes amplification

图6. N/S基因双重RT-PCR灵敏性试验

M: DNA Marker; 1~10: Clinical fecal samples

Figure 7. Clinical fecal samples detected with duplex RT-PCR

图7. 双重RT-PCR检测临床粪便样品

样品只扩增出一个条带(图7),该扩增产物测序结果证明其为PEDV的N基因。

4. 讨论

仔猪感染PEDV后,发病很急,很多仔猪因剧烈腹泻而在感染后2~3天死亡 [2] ,因此,及时、准确地确诊病原是防控该病的关键因素之一。但PEDV的变异比较快 [6] ,且临床粪便样品成分复杂,应用常规单重RT-PCR检测有时候会出现假阴性的现象,为此,本研究经引物和反应条件优化,在确认N、S基因单重RT-PCR的特异性和灵敏性基础上,建立了基于N和S基因的双重RT-PCR检测方法。从图7的临床样品检测结果也可看出,其中的2号样品仅扩增出一个条带,如果仅使用针对S基因的单重RT-PCR进行检测就会因扩增结果阴性而导致疾病误判。

资助项目

上海市科委攻关项目(课题编号:15391901600)。

文章引用:
桑益旸, 吴昊, 涂光岚, 孙涛, 王恒安. 猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立[J]. 微生物前沿, 2017, 6(4): 131-136. https://doi.org/10.12677/AMB.2017.64017

参考文献

[1] Pensaert, M.B., Debouck, P. and Reynolds, D.J. (1981) An Immunoelectron Microscopic and Immunofluorescent Study on the Antigenic Relationship between the Coronavirus-Like Agent, CV 777, and Several Coronaviruses. Archives of Virology, 68, 45-52.
https://doi.org/10.1007/BF01315166
[2] Sun, R.Q., Cai, R.J., Chen, Y.Q., et al. (2012) Outbreak of Porcine Epidemic Diarrhea in Suckling Piglets, China. Emerging Infectious Diseases, 18, 161-163.
https://doi.org/10.3201/eid1801.111259
[3] Sun, M., Ma, J.L., Wang, Y.N., et al. (2015) Genomic and Epidemiological Characteristics Provide New Insights into the Phylogeographical and Spatiotemporal Spread of Porcine Epidemic Diarrhea Virus in Asia. Journal of Clinical Microbiology, 53, 1484-1491.
https://doi.org/10.1128/JCM.02898-14
[4] Stevenson, G.W., Hoang, H., Schwartz, K.J., et al. (2013) Emergence of Porcine Epidemic Diarrhea Virus in the United States: Clinical Signs, Lesions, and Viral Genomic Sequences. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 25, 649-654.
[5] Kocherhans, R., Bridgen, A., Ackermann, M., et al. (2001) Completion of the Porcine Epidemic Diarrhoea Coronavirus (PEDV) Genome Sequence. Virus Genes, 23, 137-144.
https://doi.org/10.1023/A:1011831902219
[6] Lin, C.-M., Saif, L.J., Marthaler, D. and Wang, Q.H. (2016) Evolution, Antigenicity and Pathogenicity of Global Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strains. Virus Research, 226, 20-39.
https://doi.org/10.1016/j.virusres.2016.05.023