OJNS  >> Vol. 6 No. 1 (January 2018)

    重庆酉阳分布寒露林蛙的分子鉴定
    Molecular Identification of a Rana hanluica Population Distributed in Youyang County, Chongqing City in China

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作者:  

朱思瑾,张细林,张 爽,张 蓉,刘 姗,熊荣川:六盘水师范学院生物科学与技术学院明湖实验室,贵州 六盘水

关键词:
寒露林蛙16S rRNA分子鉴定重庆Rana hanluica 16S rRNA Molecular Identification Chongqing

摘要:

于2014年9月17日在重庆市酉阳县中采集到一蛙科标本,经初步形态鉴定为寒露林蛙。然而,之前文献记载寒露林蛙主要分布在湖南、江西、贵州、广西等地,尚无在重庆分布的记载,因此有必要使用分子生物学研究方法做进一步的物种鉴定。对该标本的肌肉样本进行DNA提取及PCR实验,扩增线粒体16S rRNA基因并进行系统发育分析及分子鉴定。结果表明,酉阳蛙类样本16S rRNA基因序列与3条寒露林蛙16S基因序列聚为一个单系,且与寒露林蛙模式产地湖南双牌一标本的16S rRNA基因序列共享同一个单倍型。因此,初步判断该标本属寒露林蛙(Rana hanluica),为重庆市两栖动物一新纪录。本文还对部分林蛙类物种的有效性进行了讨论。

In September 17th, 2014, a frog specimen was collected from Youyang County, Chongqing City in China and identified as Rana hanluica morphologically. However, the Rana hanluica frogs are usually recorded in the Hunan province, Jiangxi province, Guizhou province and Guangxi prov-ince in most scientific documentation, and there is no distribution record in Chongqing City. So, it needs further species delimitation based on molecular biological methods. Then DNA extrac-tion and PCR experiments were conducted with the tissue of the specimen to amplify the mito-chondrial 16S rRNA gene for further phylogenetic analysis and molecular identification. The results showed that the 16S rRNA gene sequence from the frog specimen in Youyang was clus-tered into a monophyletic group with 3 homologous sequences of Rana hanluica. And the target sequence shared the same haplotype with a sequence from the type locality of Rana hanluica. Therefore, the Youyang frog specimen was preliminary identified as Rana hanluica. This is a new record of amphibians in Chongqing city. We also discussed the validation of some Rana spe-cies in this study.

1. 引言

寒露林蛙(Rana hanluica)属无尾目(Anura)蛙科(Ranidae)林蛙属(Rana),因其繁殖季节在中国农历二十四节气中的寒露节前后而得名,模式产地为湖南双牌 [1] ,是我国特有的一种蛙类 [2] 。近年来,陆续在江西齐云山 [3] ,湖南南岳衡山 [4] 、莽山 [5] ,贵州雷公山 [6] 、梵净山 [7] 以及广西猫儿山 [8] 等地报道了寒露林蛙的分布,说明该物种的确切分布范围还需要进一步研究确定。本研究于2014年9月17日在重庆市酉阳县境内采集到一蛙科标本,经初步形态鉴定为寒露林蛙(Rana hanluica),但之前并没有该物种在重庆境内分布的文献记载,因此有必要使用分子手段对其分类地位进行准确界定。本文对采自重庆市酉阳县的寒露林蛙标本进行DNA提取,并克隆其线粒体16S rRNA基因片段(以下简称16S基因),使用分子系统发育学研究方法对其物种进行初步的分子鉴定。

2. 材料与方法

2.1. 标本信息

寒露林蛙(Rana hanluica)标本(图1)为2014年9月17日采自重庆市酉阳县青华林场的一号雌性标本(标本号:LPSYY2014091704),保存于六盘水师范学院动物标本馆。

使用电子游标卡尺(精确到0.1 mm)对该标本26个形态性状进行量度:头体长(62.20 mm),头长(21.90 mm),头宽(20.26 mm),吻长(8.94 mm),眼径(5.36),上眼睑宽(3.73 mm),上眼睑长(6.94 mm),眼间距(4.42 mm),鼻间距(5.16 mm),鼻吻距(3.96 mm),鼻眼距(5.45 mm),前眼角距(8.72 mm),后眼角距(12.70 mm),鼓膜径(4.06 mm),鼓膜–眼距(1.81 mm),前臂及手长(24.21),手长(14.06 mm),股长(32.88 mm),胫长(36.95),胫宽(8.11 mm),跗足长(49.02),足长(33.65 mm),外掌突长(2.98 mm),外掌突宽(1.53 mm),内蹠突长(2.62 mm),内蹠突宽(1.52 mm)。

Figure 1. Dorsum view, venter view and lateral view of the specimen in this study

图1. 本研究所用标本的背面(左上)、腹面(右上)及侧面照(下)

2.2. 总DNA提取及目的基因片段的扩增

取标本腿部新鲜肌肉组织适量,90%酒精固定后,使用动物组织DNA提取试剂盒(FOREGENE,DE-05011:250 Preps)提取总DNA,−20℃保存备用。扩增引物P7/P8为脊椎动物通用的线粒体16S rRNA基因片段扩增引物 [9] 。所扩增目的序列对应峨眉林蛙Rana omeimontis线粒体基因组(Genbank索取号KU246050) 2169-2704 bp区间位置,对应峨眉林蛙16S rRNA全基因(Genbank索取号KU246050) 885-1420 bp区间位置。

PCR反应条件:反应体积为50 ul,其中北京全式金公司配备反应缓冲液2 × EasyTaq PCR SuperMix 25 ul,总DNA模板2 ul(含10~100 ng),上、下游引物各2 ul(10 uM),用ddH2O补足50 ul。扩增PCR反应程序为94℃预变性4 min;94℃变性40 s,52℃退火40 s,72℃延伸40 s,循环次数为35次;72℃再延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送测序公司测序。

2.3. 参考基因序列下载及系统发育分析

将所测得的寒露林蛙16S基因序列经过上传GenBank进行搜索比对(megablast)获得100条初步的参考序列,与待定基因序列一起构成数据集A。进行系统发育分析时不预先设定外群,构建一棵无根系统发育树。用MUSCLE [10] 程序对序列进行比对,辅以人工校对。在MEGA7 [11] 中筛选最适合该数据集序列演化模型以供最大似然法(Maximum likelihood,ML)分析和贝叶斯分析(Bayesian inference methods)。根据BIC标准,适合本数据集的模型K2+G+I。使用MEGA7构建最大似然树(Maximum likelihood tree, ML tree),相应地设置模型为Kimura 2-parameter model(K2),在位点间速率变异模式(Rates among Sites)设置为Gamma distributed with Invariant sites (G+I)。最大似然树支持率大于70%表明该支系关系得到充分解决,在50% - 70%之间为中度支持,否则视为未解决。使用Mrbayes 3.2 [12] 构建贝叶斯树(Bayesian inference tree, BI tree)。贝叶斯树支持率大于95%表明该支系关系得到充分解决,在75%~95%之间为中度支持,否则视为未解决。使用MEGA7 [11] 软件构建邻接树(Neighbor-Joining Tree, NJ tree)和最大简约树(Maximum Parsimony Tree, MP tree),自举检验支持率大于70%表明该支系关系得到充分解决,在50%~70%之间为中度支持,否则视为未解决。

2.4. 单倍型网络构建

根据双重单系法 [13] [14] ,在数据集构建的系统发育树上,以自测序列(MG461221)为起点向根部回溯两个单系中间节点,从而得到包含自测序列及其近缘物种同源基因序列构成数据集B。对数据集B进一步进行系统发育分析时不预先设定外群,构建一棵无根系统发育树。用MUSCLE [10] 程序对序列进行比对,辅以人工校对。在MEGA7 [11] 中筛选最适合该数据集序列演化模型以供最大似然法(Maximum likelihood,ML)分析。根据BIC标准,适合本数据集的模型K2+G。使用MEGA7构建最大似然树(Maximum likelihood tree, ML tree),相应地设置模型为Kimura 2-parameter model (K2),在位点间速率变异模式(Rates among Sites)设置为Gamma distributed(G)。最大似然树支持率大于70%表明该支系关系得到充分解决,在50%~70%之间为中度支持,否则视为未解决。

另外,使用R语言程序包haplotypes [15] ,分析数据集B的单倍型类型并绘制单倍型网络。设置简约上限(parsimony limit)时,默认值为0.95,考虑到要将不同的物种划分到独立的网络中去,本研究中简约上限设置为0.97。

3. 结果

3.1. PCR扩增及测序结果

经1%琼脂糖凝胶电泳检测,引物P7/P8扩增到550 bp左右的基因片段(GenBank索取号:MG461221)。序列碱基组成存在明显的偏向性:AT含量较高(A:28.5%,T:25.6%);GC含量较低(G:20.9%,C:24.9%)。

3.2. 支系分化

将所测得寒露林蛙16S基因序列提交Genbank进行搜索比对,其与Genbank中的已有寒露林蛙序列(HQ228158)相似度最高,下载搜索得到的100条同源序列与待鉴定目标序列构成16S序列数据集A。基于不同的分析方法(ML、BI、NJ、MP)对该数据集构建的系统发育树,都支持本研究的自测序列(MG461221)与3条寒露林蛙16S基因序列聚为一个单系(图2,寒露林蛙支系,序列基本信息见表1),然而该支系与其它支系(非寒露林蛙支系)的聚类关系在各种方法构建的系统发育树间差异较大,且支持率较低。

3.3. 单倍型网络图

基于数据集B构建的单倍网络在将简约上限设置为默认值0.95时,只能得到两个独立的单倍型网络,考虑到数据集B包含了8个名义物种,而通常每个单倍型网络对应一个物种。所以,根据系统发育树的主要支系分化的拓扑结构,将简约上限设置0.97,以得到更多的相互独立的单倍型网络(4个单倍型网络分别为Net01、Net02、Net03、Net04,图3)。

4. 讨论

4.1. 物种鉴定及省级新纪录

本研究成功扩增了重庆市酉阳县一林蛙标本的线粒体16S rRNA基因部分序列,经过基于不同推断方法的系统发育分析,其与3条寒露林蛙同源序列以较高的支持率聚为一个独立支系,最大似然率、贝

Figure 2. The neighbor-joining tree (ring topology) based on the dataset A and the Rana hanluica clade with support rates under different analysis (ML bootstrap/Bayesian posterior probability/MP bootstrap/NJ bootstrap)

图2. 基于数据集A构建的邻接树(环形树)及寒露林蛙支系在不同方法构建的系统发育树中的支持率(最大似然率/贝叶斯后验概率/最大简约法自举检验支持率/邻接法自举检验支持率)

Figure 3. The haplotype network based on the dataset B. Net01 is the haplotype network for Rana omeimontis, Rana longicrus, Rana jiemuxiensis, Rana culaiensis, Rana zhenhaiensis and Net02, Net03, Net04 for Rana hanluica, Rana japonica, Rana chaochiaoensis respectively

图3. 基于数据集B构建的单倍型网络图。Net01为峨眉林蛙、长肢林蛙、借母溪林蛙、徂徕林蛙、镇海林蛙组成的单倍型网络,Net02为寒露林蛙单倍型网络,Net03为日本林蛙单倍型网络,Net04为昭觉林蛙单倍型网络

Table 1. The sequence information of the dataset B in this study

表1. 本研究中数据集B的序列信息

叶斯后验概率、最大简约法及邻接法自举检验值也都大于99%,证明该支系的单系性。因此可以初步判断该标本为寒露林蛙(Rana hanluica)。

在基于数据集B构建单倍型网络过程中,简约上限设置为默认值0.95时只能得到两个独立的单倍型网络,考虑该数据集中名义物种较多,提高简约上限以得到更多独立的单倍型网络。在简约上限设置为0.97时,得到4个单倍型网络,其中峨眉林蛙、长肢林蛙、借母溪林蛙、徂徕林蛙、镇海林蛙仍然相互联结在同一个单倍型网络(Net01),而此时包含本研究自测序列及3条寒露林蛙序列的支系已经独立为单独的单倍型网络,且自测序列(MG461221)和一条来自寒露林蛙模式产地湖南双牌的序列(HQ228158)共享同一个单倍型,证明本研究的林蛙标本应属寒露林蛙。寒露林蛙之前主要分布于湖南 [4] [5] [24] 、江西 [3] 、贵州 [6] [7] 、广西 [8] 等地,为重庆市两栖动物新纪录。

4.2. 部分林蛙物种有效性初探

使用最大简约法构建基于数据集B的单倍型网络图,结果显示,在简约上限设置为默认值0.95时,只能得到两个独立的单倍型网络。将简约上限进一步提高到0.97时,得到了更多的独立的单倍型网络,寒露林蛙,昭觉林蛙等都自成一个单独的单倍型网络,然而本研究中的长肢林蛙、徂徕林蛙、镇海林蛙、借母溪林蛙仍然共享同一个单倍型网络。进一步分析显示,该单倍型网络分成三个主要支系:峨眉林蛙单倍型支系,借母溪林蛙支系以及徂徕林蛙、长肢林蛙、镇海林蛙支系。前两者在单倍型网络上相对独立,然而后者中,三个物种的单倍型相互嵌套,因此三者的物种有效性还有待进一步研究。

致谢

感谢六盘水师范学院生物科学与技术学院田应洲教授、李松教授在野外工作方面提供的帮助;感谢生物科学与技术学院陆珍、杨柳青等同学在实验室工作方面提供的帮助。

基金项目

国家自然科学基金(31360512);贵州省科技厅自然科学项目(黔科合J字LKLS[2013]06号);贵州省教育厅自然科学研究重点项目(黔教合KY字[2015]387号);六盘水师范学院科技创新团队项目(LPSSYKJTD201602);贵州省普通高等学校创新人才团队项目(黔教合人才团队字[2015] 72号)。

文章引用:
朱思瑾, 张细林, 张爽, 张蓉, 刘姗, 熊荣川. 重庆酉阳分布寒露林蛙的分子鉴定[J]. 自然科学, 2018, 6(1): 1-8. https://doi.org/10.12677/OJNS.2018.61001

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