1. 引言
广藿香[Pogostemoncablin (Blanco) Benth.],唇形科刺蕊草属植物,别名刺蕊草、南香、藿香、枝香、牌香等。原产地是越南、马来西亚、菲律宾等东南亚国家,在梁代或之前引种到我国 [1] 。现在我国广藿香主要分布于海南和广东两省,在广东的广州、肇庆、湛江以及海南省万宁市均有栽培。广藿香是重要的药材兼香料的芳香化湿类中药植物,具有芳香化浊、开胃止呕、发表解暑等功效,用于湿浊中阻、脘痞呕吐、暑湿倦怠、胸闷不适、寒湿闭暑、腹痛吐泻、鼻渊头痛等病证 [2] 。百秋李醇作为广藿香挥发油的主要成分和广藿香的活性成分之一,是历版《中华人民共和国药典》规定的用于评价广藿香药材及广藿香油质量的指标成分,除了具有明显的抗病毒和抑菌功效之外,还是一种很好的定香剂,有独特宜人的气味且可使香味持久,因而广泛应用于药品、食品、化妆品和日用品等行业。
海南大多数被子植物倍半萜合酶的功能需要Mg2+、Mn2+或Co2+的协助。Picaud等 [3] (2005)从黄花蒿(Artemisia annua)中分离到一个倍半萜烯合酶(E)-β-法呢烯合酶[(E)-beta-farnesene synthase],大肠杆菌原核表达此酶的产物可催化FDP形成单一产物β-法呢烯,反应依赖Mg2+、Mn2+或Co2+,这是否就表明广藿香百秋李醇合成酶的催化也需要诱导因子(如Mg2+、Mn2+或Co2+)来协助?迄今,尚不清楚外源施加金属微量元素是否会对百秋李醇的合成产生影响。因此,在土壤中施用或叶面喷施一定量的金属微量元素,是否能促进其酶的过量表达或活性,以提高百秋李醇的含量?为此,本研究拟探讨矿质营养元素对广藿香百秋李醇等含量的影响,以期为广藿香中挥发油及其主要成分的积累机制提供理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
本实验所用生长6个月广藿香和成熟广藿香材料,均来自海南大学园艺园林学院广藿香资源圃。
对6个月广藿香材料叶面喷施Mg、Mn和Co,所用镁、锰和钴肥分别为分析纯硫酸镁(MgSO4∙7H2O)、硫酸锰(MnSO4∙3H2O)和硫酸钴(CoSO4∙7H2O),每种元素设三个量级(Mg1、Mg2、Mg3;Mn1、Mn2、Mn3;Co1、Co2、Co3),浓度设置分别为1 mM、5 mM、10 mM;1 µM、10 µM、100 µM;0.1 mM、0.5 mM、1 mM (按纯元素计),对照(CK)喷等量水,每15天喷施1次,重复3次。处理1天、3天、7天和15天后,对叶片进行取样,液氮冷激后分装于−80℃保存,作为基因表达水平分析的样品;在每次喷施15天后,采集广藿香植株地上部分,用于化学成分分析。每次采样时间均固定在下午5:00~6:00。
2.2. 实验试剂及仪器
试剂:MgSO4∙7H20、MnSO4∙3H20、CoSO4。
仪器:紫外分光光度计(Lambda 25,美国)。
2.3. 试验方法
1) 挥发油提取
将广藿香地上部分材料阴干,用打粉机磨碎,用水蒸气蒸馏法提取挥发油 [4] 。称取粉末100 g,加7倍体积的水浸泡5 h,提取4 h后用无水硫酸钠干燥,于0℃密封避光保存,备用。挥发油含量(mL/kg)以干燥品计算。
2) GC-MS分析条件
气相色谱条件为:色谱柱为HP-Intiowax Polyethylene Glycol弹性石英毛细管柱(柱长30 m,内径0.32 mm,膜厚度0.25 µm),柱温50℃,以6℃/min升温至230℃,保持5 min,汽化室温度250℃。载气为髙纯氦气(99.999%),柱前压7.62 psi,流量1.0 mL/min。进样量1.0 µL,分流比20:1。质谱条件:离子源为EI源,温度230℃;四极杆温度150℃,电子能量70 eV,发射电流34.6 µA,倍增器电压837 V,接口温度250℃,质量范围10~500 amu。化合物鉴定及数据处理:采用色谱峰面积归一化法计算化合物的相对含量 [5] ,结合WILEY275质谱图库和NIST2005标准质谱图库,通过HPMSD化学工作站进行化合物鉴定。方差分析采用SAS软件,在0.05水平下分析不同样品间的差异显著性。
3. 结果与分析
3.1. 矿质营养元素对挥发油含量的影响
吸光值,所得标曲方广藿香和绝大多数的唇形科植物一样,含有大量的挥发性芳香油。图1显示了
Figure 1. Effects of foliar application of Mg, Mn and Co sulphate on volatile oil contents in Patchouli (percentage of dry weight)
图1. 叶面喷施Mg、Mn和Co对广藿香中挥发油含量的影响
叶面喷施Mg、Mn和Co对广藿香挥发油含量的影响。对照中挥发油的含量随着生长期的增加而逐渐上升,含量分别为0.69% (第195天)、0.82% (第210天)和0.86% (第225天)。试验中重复3次叶面喷施矿质营养元素肥料,广藿香中挥发油含量的增加以喷施1次的效果最为明显。当叶面喷施1次1 μM MnSO4 (Mn1)时,广藿香中挥发油含量达到最高值0.95%,比对照增加了37.7%。另外3个处理Mg3、Co2和Co3喷施1次也能不同程度的提高挥发油含量,分别增加了20.3%、1.4%和7.2%。矿质营养元素肥料喷施2次时,检测Mn1、Mg3处理后,对挥发油含量的增幅比喷施1次时均有所下降,为10.8%和7.3%;而Co2和Co3处理使挥发油含量提高了6.1%和12.2%,增加幅度有所上升。由图1可以看出,不同处理连续喷施3次时,均对广藿香挥发油的积累产生不同程度的抑制作。
3.2. 矿质营养元素对百秋李醇含量的影响
广藿香中百秋李醇的含量受到Mg、Mn和Co的影响,不同处理间含量差异明显(图2),从24.33%到47.80%。矿质营养元素处理次数对百秋李醇的影响具有较大差异,3种矿质营养元素只有在处理1次时,对百秋李醇的积累具有明显的促进作用,而处理2次和3次时百秋李醇含量均有所下降,对百秋李醇的积累具有不同程度的抑制作用。不同浓度Mg处理1次时,百秋李醇的含量明显上升,浓度从低到高分别增加了11.8%、8.2%和26.5%。试验中百秋李醇的含量在低浓度的Mn1处理1次达到最高值47.80%,比之对照含量上升了30.4%。Mn2处理1次后,使得百秋李醇的含量提高了8.5%。高浓度的Co3处理下,能提高百秋李醇的含量,增幅为15.3%。
3.3. 矿质营养元素对挥发油其他成分含量的影响
广藿香油被认为是广藿香的主要药用成分,近年来,随着GC-MS技术的发展与普及,使得挥发性成分的分析变得快捷简便,国内外学者对广藿香挥发油成分的研究也越来越深入。本研究采用GC-MS技术就叶面喷施Mg (表1)、Mn (表2)和Co (表3) 3种矿质营养元素对广藿香挥发油中β-广藿香烯、β-榄香烯、石竹烯、α-愈创木烯、刺蕊草烯、葎草烯、α-布藜烯和法呢醇等主要成分含量的影响进行了分析。
1) Mg对广藿香中挥发油主要成分含量的影响
表1为供Mg浓度不同及处理次数不同对广藿香中挥发油主要成分的含量影响,可以看出影响是较大的。不同浓度供Mg处理2次和3次时,广藿香体内β-榄香烯、石竹烯、α-愈创木烯和刺蕊草烯的含量均明显加大,至高浓度Mg3处理3次时,β-榄香烯、石竹烯和α-愈创木烯含量达到最大值,分别为0.68%、3.15%和7.53%,而刺蕊草烯的最高含量5.01%出现在Mg3处理1次时。β-广藿香烯和葎草烯同样是在
Figure 2. Effects of foliar application of Mg, Mn and Co sulphate on content of Patchouli alcohol (expresseding/100g of volatile oil)
图2. 叶面喷施Mg、Mn和Co对广藿香中百秋李醇含量的影响
表1. 叶面喷施Mg对广藿香挥发油主要成分含量的影响
表2. 叶面喷施Mn对广藿香挥发油主要成分含量的影响
表3. 叶面喷施Co对广藿香挥发油主要成分含量的影响
高浓度供Mg处理3次时达到最高含量2.52%和1.01%。α-布藜烯的含量在低浓度Mg1处理3次时达到最大增幅21.9%。法呢醇含量升高幅度是这个组别里最为显著的,在Mg1处理1次时增长幅度为97.2%。
2) Mn对广藿香中挥发油主要成分含量的影响
以对照组喷施等量水为参照比较不同浓度Mn处理不同次数对广藿香挥发油主要成分含量的影响(表2),各成分之间动态变化情况具有一定规律性。与对照相比,β-广藿香烯经Mn处理后大多含量明显下降,仅在Mn1处理2次和Mn2处理3次时含量高于对照,增幅分别为14.4%和7.0%。β-榄香烯、α-愈创木烯、刺蕊草烯和α-布藜烯等成分在不同处理下,含量有着相似的动态变化规律。Mn1和Mn3处理2次时,4种成分的含量均有不同程度的提高,然而处理3次时含量均有所下降。在Mn2喷施2次时,β-榄香烯、α-愈创木烯、刺蕊草烯和α-布藜烯等成分的含量均低于对照,但在Mn2处理3次时4种成分含量急剧上升至最大值,分别为0.71%、7.43%、4.79%和9.81%,增加幅度分别为14.5%、25.3%、18.9%和11.5%。不同供Mn浓度处理1次时对葎草烯的积累具有抑制作用,然而处理2次却能促进葎草烯的积累,处理3次时仅Mn2能提高葎草烯的含量,并达到最高值0.97%。石竹烯和法呢醇均在3种浓度Mn处理3次时含量有所增加高于对照,Mn2浓度处理2次时含量大幅增加至最大值4.49%和18.65%,增幅为245.4%和171.5%。
3) Co对广藿香中挥发油主要成分含量的影响
从表3可以看出,叶面喷施Co对广藿香挥发油主要成分的影响较大,但各组分变化的规律性不强。β-广藿香烯、α-愈创木烯和刺蕊草烯3种成分均在高浓度Co3处理2次时含量增加至最高值2.83%、7.31%和5.22%,增幅分别为27.5%、34.4%和38.5%。Co对葎草烯含量的影响较小,仅在处理2次时含量有所增加,且含量最高值为生长第225天的对照。β-榄香烯、石竹烯、α-布藜烯和法呢醇分别在Co1处理3次、Co3处理3次、Co2处理2次和Co1处理1次时含量达到最高值。
总体而言,α-愈创木烯和葎草烯均在高浓度Mg (10 mM)处理3次后达到含量最高值,中浓度Mn (10 μM)处理2次后石竹烯和法呢醇的含量达到最大值,刺蕊草烯和α-布藜烯分别高和低浓度Mg (10 mM和1 mM)处理1次时获得最高含量,β-榄香烯和β-广藿香烯的含量则分别在中浓度Mn (10 μM)处理3次和高浓度Co处理2次时达到最大值。
4. 讨论
百秋李醇是广藿香的活性成分和广藿香挥发油的主要成分之一,其形成与积累受到各种环境因子的影响,本实验选择了矿质营养元素这一具体的影响因子进行研究。在植物生长发育过程中,施用适量的矿质营养元素肥料对药用植物药效成分的形成与积累有着十分重要的作用。与大量元素相比,药用植物对中、微量元素的需求量较少,特别是微量元素,但其对植物的生长具有重要的生理作用。镁是叶绿素分子的核心元素,参与叶绿素合成和光合作用,并参与植物体内蛋白质及碳水化合物等物质的合成与转化,在植物生理代谢中起着重要作用。锰是植物生长发育必需的微量元素之一,是光合系统II中锰蛋白及超氧化物歧化酶的重要组成部分,直接参与植物光合作用。钴被称作植物的有益元素,在植物生长发育过程中有着举足轻重的作用,能稳定叶绿体影响植物的光合作用。外源补充中、微量营养元素的作用浓度范围较窄,若施用不当则容易造成中毒现象而影响药用植物的正常生长。叶面施肥因具有用肥量少、肥效快、养分吸收效率高、安全可靠等特点,而逐步成为中、微量营养元素施肥的主要技术手段。在植物幼苗期和生长后期根系吸收能力较弱,叶面喷施中、微量营养元素可以及时补充养分,利于作物生长。
因而,本研究选择6个月生长后期的广藿香作为供试材料,通过叶面喷施不同浓度Mg、Mn和Co,来开展矿质营养元素对广藿香中百秋李醇形成与积累影响的研究,通过测定广藿香挥发油及其中百秋李醇等主要成分的含量,分析其随浓度和处理次数的变化规律。3种矿质营养元素中,Mn对广藿香挥发油含量的影响较大,低浓度Mn1 (1 μM)处理1次后达到含量最高值,Mg和Co以高浓度Mg3 (10 mM)和Co3 (1 mM)处理效果最佳,喷施1次和2次均能提高挥发油含量,但喷施2次后广藿香挥发油含量较高。处理次数对百秋李醇的影响具有较大差异,3种矿质营养元素叶面肥均只有在处理1次时,对百秋李醇的积累具有明显的促进作用;3种元素能够提高百秋李醇与挥发油含量的最佳作用浓度相同,分别为:低浓度Mn (1 μM)、高浓度Mg (10 mM)和Co (1 mM),且同样以低浓度Mn1 (1 μM)处理1次获得最高含量。在不同处理下挥发油其他主要成分的含量分析表明,Mg对α-愈创木烯、葎草烯、刺蕊草烯和α-布藜烯等的含量影响较大,且以高浓度Mg3 (10 mM)作用效果最佳,前两个成分均在Mg3处理3次后达到含量最高值,刺蕊草烯和α-布藜烯的含量分别在Mg3处理1次以及Mg1处理1次下达到最高;Mn则对β-榄香烯、石竹烯和法呢醇等的积累具有较好的促进作用,Mn2处理2次后石竹烯和法呢醇的含量达到最大值,β-榄香烯含量最高出现在Mn2处理3次后;Co高浓度Co3 (1 mM)处理2次下β-广藿香烯含量为所有处理组合中最高的。
初步发现,Mg、Mn和Co处理能提高广藿香中挥发油及其主要成分的含量。在其他植物中也发现了Mg、Mn和Co对产量影响的类似结果。如,叶面喷施一定量的Mg能提高牛至和蔷薇中挥发油产量及其成分的含量 [6] [7] 。 [8] Yadegari报道叶面喷施Mn对百里香挥发油及其成分的含量具有较大的影响。研究发现,适量浓度的Mn处理对甘草药材中甘草酸 [9] 、银杏叶中黄酮 [10] 以及芦荟中芦荟苷和芦荟大黄素 [11] 的积累均具有一定程度的促进作用。喷施一定量钴肥能提高紫花苜蓿鲜草产量和营养品质 [12] ,微量元素钴拌种施用能促进小麦生长发育,提高产量,并能显著地改进植物品质 [13] 。然而,关于药用植物喷施钴肥的研究较少见报道。
NOTES
*通讯作者。