1. 引言
洁尔阴洗液是一种妇科常用的外用药，由蛇床子、艾叶、独活、石菖蒲、金银花、黄柏、栀子和黄芩等14味中药材制成 [1] 。在临床上，它具有清热燥湿、杀虫止痒的功效，主要用于治疗妇女湿热带下和霉菌性、滴虫性、非特异性阴道炎以及湿疹、接触性皮炎和体股癣等病症 [2] 。在新药转正标准中药第十二册 [1] 中记录了以蛇床子素为指标成分，采用色谱法测定其含量。陈琴华 [3] ，徐亚敏等 [4] 人只采用高效液相色谱法测定了该洗液中蛇床子素的含量。由于艾叶和金银花等药材中含有的绿原酸具有抗菌，抗病毒，消炎的作用 [5] [6] [7] [8] ，也是该洗液中的有效成分，因此准确测定其含量对于保证药效具有重要意义。为完善中药复方制剂质量标准，本实验探讨HPLC法梯度洗脱同时测定洁尔阴洗液中绿原酸和蛇床子素的含量。
2. 仪器与试药
2.1. 仪器
Agilent1260高效液相色谱仪(配置真空在线脱气、自动进样器、VWD检测器、四元泵，色谱工作站)，AUW220D电子分析天平(日本岛津)，KQ-100DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
2.2. 试药
对照品绿原酸(成都植标化纯；批号：14051)、蛇床子素(上海源叶生物科技有限公司；批号：YY20110525)供含量测定用；乙腈(色谱纯，Tedia Company)；甲酸(分析纯，天津市永大化学试剂有限公司)；甲醇(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)；水(娃哈哈饮用纯净水)；洁尔阴洗液(批号：1612096)购自石家庄乐仁堂大药房。
3. 方法与结果
3.1. 色谱条件
色谱柱：ZORBAX SB-C18 (4.6 × 150 mm, 5μm)，流动相：乙腈-0.2%甲酸水溶液，参考文献 [9] 建立了梯度洗脱程序见表1，流速为1.0 mL/min；柱温为30℃；检测波长为324 nm。
3.2. 溶液的制备
3.2.1. 对照品溶液
精密称取绿原酸，蛇床子素对照品2.13 mg、2.86 mg，分别置于100 mL的容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度并摇匀，得到含绿原酸21.3 μg/mL，蛇床子素28.6 μg/mL的对照品溶液。溶液进样分析前经孔径0.45 μm微孔滤膜过滤。
3.2.2. 供试品溶液
取一定量的洁尔阴洗液，摇匀。溶液进样分析前经孔径0.45 μm微孔滤膜过滤。
3.3. 系统适用性试验
取“3.2.”项下的对照品溶液和供试品溶液，按“3.1.”项下色谱条件，分别进样5 μL分析见图1，由图1中(a)和(b)可知，绿原酸和蛇床子素保留时间分别为6.819 min，16.630 min。在样品色谱图(c)中，分别有与对照品绿原酸，蛇床子素保留时间一致的特征峰。
3.4. 线性关系考察
分别取“3.2.1.”项下对照品溶液，按“3.1.”项下色谱条件，绿原酸自动进样0.5，1，3，5，7 μL，
(a) 
(b) 
(c)
Figure 1. HPLC chromatograms. (a) Chlorogenic acid; (b) Osthole; (c) Jieeryin Lotion. (1. Chlorogenic acid; 2.Osthole)
图1. 高效液相色谱图。(a) 绿原酸对照品；(b) 蛇床子素对照品；(c) 洁尔阴供试品。(1. 绿原酸；2. 蛇床子素)
蛇床子素自动进样1，5，10，15，20 μL，记录峰面积。分别以峰面积Y为纵坐标，进样量X为横坐标，进行线性回归。结果显示绿原酸和蛇床子素的进样量分别在0.010~0.149 μg，0.029~0.572 μg范围内线性关系良好。回归方程分别为y = 41.233x + 0.95 (r = 0.9998)，y = 88.756x − 0.7148(r = 0.9999)。
3.5. 精密度试验
分别取“3.2.1.”项下对照品溶液，按“3.1.”项下色谱条件，连续自动进样5 μL，共五次，记录峰面积。计算结果显示绿原酸和蛇床子素峰面积的RSD均为0.28%。表明仪器精密度良好。
3.6. 稳定性试验
取“3.2.2.”项下供试品溶液，按“3.1.”项下色谱条件，于1，2，3，4，5，12，24，36 h自动进样3 μL。记录峰面积，计算得绿原酸和蛇床子素峰面积RSD分别为0.47%，0.39%，表明供试液稳定性良好。
3.7. 重复性试验
取同一批号(批号：1612096)洁尔阴洗液样品，精密量取6份，按“3.2.2.”项下方法制备供试品溶液，按“3.1.”项下色谱条件，分别自动进样3 μL进行分析，记录峰面积，计算得样品中绿原酸和蛇床子素RSD分别为0.36%和0.75%。结果表明，分析方法的重复性良好。
3.8. 加样回收率试验
精密量取已知含量的样品(批号:1612096)1 mL，共6份，分别精密加入绿原酸对照品溶液(21.3 μg/mL) 2 mL和蛇床子素对照品溶液(28.6 μg/mL) 0.545 mL，按“3.2.2.”项下方法制备回收率试液，按“3.1.”项下色谱条件，自动进样5 μL，记录峰面积，计算结果见表2。表明HPLC方法具有良好的准确性。
3.9. 样品含量测定
取“3.2.2.”项下的供试品溶液，按“3.1.”项下色谱条件，自动进样3 μL，共六次，记录峰面积，将测定面积带入相应的标准曲线方程，计算得样品中绿原酸和蛇床子素平均含量分别为40.2 μg/mL，12.4 μg/mL。
4. 讨论
4.1. 检测波长的选择
为了保证各成分都具有适宜的灵敏度和精密度，分别测定了绿原酸和蛇床子素在流动相中的紫外吸收光谱见图2。绿原酸，蛇床子素的最大吸收波长分别为327 nm和322 nm，与参考文献 [10] 一致。由于两波长非常接近，于是本文选取324 nm为检测波长，结果显示目标成分的响应值均较高。见图1(c)中有响应值最高的峰，但该峰并未完全分开。由文献 [11] [12] 可知，艾叶中的蒙花苷，刺槐素，独活中的异欧前胡素等的最强吸收都比较接近324 nm，由此推测可能是这几种物质在该波长下响应信号叠加在一起导
Table 2. Results of recovery tests ( n = 6)
表2. 加样回收率试验结果(n = 6)
Figure 2. UV absorption spectra of chlorogenic acid (D) and osthol (E)
图2. 绿原酸(D)和蛇床子素(E)的紫外吸收光谱
致了这个大峰的出现。
4.2. 流动相的选择
为保证被测定化合物良好的分离度和适当的保留时间，实验中采用等度洗脱，调节甲醇–水、乙腈–水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液分配比例，目标成分和杂质成分未能分离。采用梯度洗脱，以甲醇-0.2%甲酸为流动相，分离效果不好。以乙腈-0.2%甲酸水溶液为流动相分离效果好，峰形好，基线较稳定，同时有机酸降低了磷酸对色谱柱的损坏。
5. 结论
本实验用HPLC法同时测定洁尔阴洗液中绿原酸和蛇床子素的含量。实验结果表明，该洗液中蛇床子素含量符合新药转正标准中药第十二册 [1] 规定(蛇床子素 ≥ 3 μg/ml)，同时增加了绿原酸的含量测定，为洁尔阴洗液的质量控制标准提供了方法依据。
NOTES
*通讯作者。