1. 引言
云纹石斑鱼(Epinephelus moara)和鞍带石斑鱼(E. lanceolatus)同属于鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑鱼亚科(Epinephelinae)、石斑鱼属(Epinephelus)，均为暖温性礁栖鱼类，均属于经济价值较高的鱼类。云纹石斑鱼主要分布于日本、韩国以及我国的东海和南海，具有个体大、生长快、肉质鲜美的特性 [1] [2] ；鞍带石斑鱼主要分布于东南亚、大洋洲海域，在我国主要分布于南海诸岛，数量较少，是石斑鱼类中体型最大的种类，具有生长速度快，抗病性强，营养价值高等诸多优点 [3] [4] 。为利用两者的优良性状，对其进行杂交，成功获得了云纹石斑鱼(♀) × 鞍带石斑鱼(♂)杂交F1幼鱼 [5] ，其杂交F1在生长方面呈现出杂种优势，是值得开发的优良新品种。微卫星标记因具有多态性高、呈共显性、杂合度高、信息含量丰富以及样品需要量少、操作简单、等位基因条带易于识别等特点 [6] ，广泛应用于亲缘关系分析 [7] 、群体遗传、生物遗传多样性 [8] 、连锁图谱构建 [9] 等研究领域。有关对云纹石斑鱼(♀) × 鞍带石斑鱼(♂)杂交F1的遗传物质基础的研究，成美玲等 [10] 对杂交后代进行染色体核型分析，唐江等 [11] 对杂交后代进行遗传性状了分析。本研究使用13对微卫星引物对3种石斑鱼进行微卫星分析，计算有效等位基因数、基因杂合度、多态信息含量、相似指数和Nei氏遗传距离，并采用UPGMA法构建聚类分析图，以分析杂交F1与亲本的遗传关系，从分子水平上分析杂交F1代的遗传学特性，为其杂种优势的研究提供理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 材料
云纹石斑鱼、鞍带石斑鱼和云纹石斑鱼(♀) × 鞍带石斑鱼(♂)杂交F1均取自莱州明波水产有限公司。选择体色和形态正常、性腺发育成熟的健康亲鱼用于种间远缘杂交，将亲鱼用MS-222麻醉，轻压亲鱼腹部，采集成熟卵子和精液进行人工授精。将受精卵放入孵化槽中进行孵化，孵化水温为24℃~25℃、盐度为30，微充气，流水孵化；再将其转入水温为25℃~27℃、盐度为29~31、溶解氧 ≥ 5 mg/L的方形水泥池中培育。每种样本取17个个体，杂交F1为6月龄幼鱼，分别剪取鳍条保存于95%的乙醇中。
2.2. 方法
2.2.1. 总DNA的提取
将乙醇保存的鳍条样品采用酚-氯仿法提取DNA，以1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性与纯度，用紫外分光光度计检测质量浓度。
2.2.2. 微卫星引物
从云纹石斑鱼及石斑鱼属的其它种开发的引物中选取13对引物，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
2.2.3. PCR扩增
PCR扩增反应体积为15 μl，反应体系包括DNA模板1 µl，10 × PCR Buffer 1.5 µl，2.5 µM dNTP混合液1.2 µl，25 µM MgCl2 0.9 µl，Taq DNA聚合酶0.3 µl，10 µM上下游引物各0.5 µl，双蒸水9.1 µl。PCR循环为94℃预变性5 min后进入循环体系，94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，最后72℃终延伸5 min，4℃保存。在ABI 3730 XL sequencer测序仪上进行毛细管电泳。使用Data Collection和Genemapper软件进行数据收集和分析，输出电泳图谱，计算各等位基因大小。
2.2.4. 数据统计分析
使用GENPOP Version 3.4软件计算等位基因数(alleles number, Ao)、等位基因频率(allele frequency)、观测杂合度(observedheterozygosity, Ho)、期望杂合度(expectedheterozygosity, He)，并依据Botstein等 [12] 提出的公式计算多态信息含量(polymorphism informationcontent, PIC)。
使用DISPAN软件计算Nei氏遗传距离(geneticdistances)和遗传相似度(genetic similarity)。采用算术平均数的非加权成组配对法(unweightd pair group witharithmetic average, UPGMA)，使用Mega 4.0软件 [13] 根据Nei氏遗传距离 [14] 构建系统进化树。
3. 结果
3.1. 微卫星标记的筛选
从25对微卫星引物中筛选出13对，在3种石斑鱼群体中均可得到稳定清晰的产物。13对引物信息见表1。
3.2. 微卫星引物扩增结果
使用13对微卫星引物对云纹石斑鱼、鞍带石斑鱼和杂交F1的基因组DNA进行检测。结果显示，引物Ese26扩增的片段大小在云纹石斑鱼群体中为190 bp，在鞍带石斑鱼群体中为200~202 bp；引物RH_CA_001扩增的片段大小范围在云纹石斑鱼群体中为386~422 bp，在鞍带石斑鱼群体为372~384 bp；引物RH_CA_004扩增的片段大小范围在云纹石斑鱼群体中为199~213 bp，在鞍带石斑鱼群体为183~197 bp；引物RH_CA_007扩增的片段大小在云纹石斑鱼群体中为306 bp，在鞍带石斑鱼群体为318~320 bp；引物RH_CA_008扩增的片段大小范围在云纹石斑鱼群体中为198~200 bp，在鞍带石斑鱼群体为206~214 bp。结果表明，引物Ese26、RH_CA_001、RH_CA_004、RH_CA_007和RH_CA_008均能区分云纹石斑鱼和鞍带石斑鱼两个群体。
引物Ese26中，母本云纹石斑鱼群体均为纯合型，只有一条带190 bp，父本鞍带石斑鱼群体有杂合型，而杂交F1均为杂合型，均有一条190 bp的条带，父、母本条带同时出现(图1)，是鉴别杂交F1的最佳分子标记。引物RH_CA_007中，母本云纹石斑鱼群体均为纯合型，只有一条带306 bp，父本鞍带石斑鱼群体有杂合型，而杂交F1均为杂合型，均有一条306 bp的条带，父、母本条带同时出现(图2)，也是鉴别杂交F1的最佳分子标记。
3.3. 遗传变异参数
3种石斑鱼13对微卫星位点的平均等位基因数、平均观测杂合度、平均期望杂合度、平均多态信息含量见表2。结果显示，云纹石斑鱼的平均等位基因数(Ao)最大(5.2900)，其次为杂交F1 (4.2100)，鞍带石斑鱼最小(2.6200)；在平均观测杂合度(Ho)中，杂交F1最高(0.7108)，其次为云纹石斑鱼(0.4510)，鞍带石斑鱼最低(0.4167)；平均期望杂合度(He)中，杂交F1最高(0.5461)，其次为云纹石斑鱼(0.5105)，鞍带石斑鱼最低(0.4012)。从位点来看，多态信息含量(PIC)最高的为云纹石斑鱼的RH_CA_001位点(0.8975)；从
Table 1. The characteristics of 13 microsatellite primers
表1. 13对微卫星引物的特征
(a) 
(b)
(c)
Figure 1. Representative chromatogram microsatellites obtained using primer Ese26; (a) Referred as E. moara (allele size = 190 bp ); (b) Referred as hybrid F1 (190, 202 bp); (c) Referred as E. lanceolatus (202 bp)
图1. 引物Ese26的毛细管电泳峰值图；(a) 云纹石斑鱼个体，条带大小为190 bp；(b) 杂交F1个体，条带大小为190和202 bp；(c) 鞍带石斑鱼个体，条带大小为202 bp
(a) 
(b) 
(c)
Figure 2. Representative chromatogram microsatellites obtained using primer RH_CA_007; (a) Referred as E. moara (allele size = 306 bp); (b) Referred as hybrid F1 (306, 320 bp); (c) Referred as E. lanceolatus (320 bp)
图2. 引物RH_CA_007的毛细管电泳峰值图；(a) 云纹石斑鱼个体，条带大小为306 bp；(b) 杂交F1个体，条带大小为306和320 bp；(c) 鞍带石斑鱼个体，条带大小为320 bp
群体来看，3个群体的平均PIC为0.4290，杂交F1的平均PIC最高为0.4818，云纹石斑鱼为0.4661，鞍带石斑鱼最低为0.3392。
3.4. 遗传相似指数、遗传距离及聚类分析
3种石斑鱼群体的遗传相似指数和遗传距离结果显示(表3)，鞍带石斑鱼与杂交F1遗传相似率最高(0.7616)，其次为云纹石斑鱼和杂交F1 (0.7247)，云纹石斑鱼和鞍带石斑鱼相似率最低(0.4296)；云纹石斑鱼和鞍带石斑鱼遗传距离最大(0.8449)，其次为云纹石斑鱼和杂交F1 (0.3220)，鞍带石斑鱼与杂交F1遗传距离最小(0.2724)。结果表明，杂交F1偏向父本鞍带石斑鱼。
根据遗传距离采用UPGMA法构建聚类分析图(图3)，结果显示，鞍带石斑鱼和杂交F1先聚为一支，
Table 2. Parameters of genetic variation of E. moara, E. lanceolatus and hybrid F1
表2. 3种石斑鱼群体的遗传变异参数
Table 3. Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) among E. moara，E. lanceolatus and hybrid F1
表3. 云纹石斑鱼、鞍带石斑鱼和杂交F1间的遗传相似指数(上三角)和Nei氏遗传距离(下三角)
Figure 3. UPGMA molecular trees of E. moara, E. lanceolatus and hybrid F1 based on genetic distance
图3. 云纹石斑鱼、鞍带石斑鱼和杂交F1的UPGMA聚类分析图
云纹石斑鱼位于最外支。结果表明，杂交F1与父本鞍带石斑鱼的亲缘关系较近。
4. 讨论
微卫星标记遵循孟德尔的分离规律，是一种共显性的分子标记，亲本微卫星位点的等位基因在繁殖时发生分离，真正的杂交F1的遗传物质一方来自父本而另一方来自母本，因而在鱼类远缘杂交育种上，微卫星标记适用于亲本与杂交F1亲缘关系的鉴定。在本研究中，杂交F1的等位基因基本来自父母本群体，总体上符合孟德尔的分离规律，属两性融合生殖，是真正意义上的杂交种。本研究使用的13对微卫星位点可以作为云纹石斑鱼和鞍带石斑鱼两个群体的有效分子标记，分析两种石斑鱼群体的遗传多样性，其中，引物Ese26、RH_CA_001、RH_CA_004、RH_CA_007和RH_CA_008可将云纹石斑鱼和鞍带石斑鱼两个群体进行区分，引物Ese26和RH_CA_007是鉴别杂交F1的最佳分子标记。
多态信息含量(PIC)是指后代所获得的某个等位基因标记来源于其亲本同一个等位基因标记的可能性大小，是衡量等位基因多态性的理想指标，值越大，群体杂合个体的比例越高，显示的遗传信息越多。据Botstein等 [12] 提出的衡量标准，当PIC大于0.5 时，该位点为高度多态性位点；PIC介于0.25和0.5之间时，为中度多态性位点；PIC小于0.25时，为低度多态性位点。本研究中各位点均为中度多态性位点，杂交F1的平均PIC均高于父母本，表明杂交F1在遗传信息和遗传多样性等方面有所提高。
基因杂合度能够表明群体中个体遗传变异的程度，是评估群体遗传变异的理想指标之一 [15] ，通过其数值大小可以判断遗传多样性的丰富程度，数值越大，表明变异程度越高，遗传多样性越丰富。在本研究中，杂交F1的平均观测杂合度(0.7108)高于母本云纹石斑鱼(0.4510)和父本鞍带石斑鱼(0.4167)，进一步表明通过远缘杂交，可以有效提升杂交后代的遗传多样性，增加遗传结构的变异。
遗传距离是研究群体遗传多样性的基础，是反映遗传多样性高低的主要指标之一，遗传距离越小，表明群体分化时间越短、亲缘关系越近、遗传多样性越低，反之，遗传距离越大则遗传多样性越高。杂种优势是指不同基因型的亲本杂交产生的杂交子代在生长、成活、抗逆性和品质等方面均优于双亲的现象。现代杂种优势理论认为，亲本之间的遗传距离越大，杂合位点数目越多，杂交子代的杂种优势就越强 [16] 。Crawford等 [17] 指出通过微卫星标记分析得到的遗传距离更能准确反映分化时间的长短，能够客观的反映种间遗传变异和分化，可用来预测杂交组合的优劣性，避免实际杂交试验的盲目性 [18] 。在本研究中，云纹石斑鱼和鞍带石斑鱼的遗传距离为0.8449，通过开展前期实验，杂交F1在生长、抗逆性 [19] 、营养成分 [20] 等方面均具有明显的杂种优势，可以利用其杂种优势进行人工繁殖和培育以开展遗传育种工作。
基金项目
山东省自然科学基金(ZR2015PC015)。
NOTES
*通讯作者。